携P-_SLex和TE单抗...剪切力下靶向黏附能力的评价_朱正球.pdf

东南大学学报（医学版）（），；（）：收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目（）作者简介 朱正球（），男，安徽池州人，主治医师，医学硕士。：通信作者 黄辉：引文格式 朱正球，杨芳，陈苓珊，等 携 和 单抗双靶向超声微泡的构建及高剪切力下靶向黏附能力的评价 东南大学学报（医学版），（）：论著 携 和 单抗双靶向超声微泡的构建及高剪切力下靶向黏附能力的评价朱正球，杨芳，陈苓珊，吴意贇，王银萍，马学慧，沈碧潇，黄辉（江苏省中医院，南京中医药大学附属医院 超声医学科，江苏 南京；东南大学 生物科学与医学工程学院，生物电子学国家重点实验室，江苏省生物材料与器件重点实验室，江苏 南京；江苏省中医院，南京中医药大学附属医院 放射科，江苏 南京）摘要 目的：体外评估携多聚唾液酸化路易斯（）和弹性蛋白原（）单抗的双靶向超声微泡在高剪切力下的靶向黏附能力。方法：构建空载微泡（）、携 单靶向微泡（）、携 单抗单靶向微泡（）及携 和 单抗的双靶向超声微泡（）种微泡，利用平行平板流动腔装置及 图像分析软件，分别在 、和 （）剪切力下评估每种微泡 的全程结合总数，并检测微泡的半数解离剪切应力及完全解离剪切应力。结果：、及 种剪切力下微泡的 全程结合总数，是 的 倍、的 倍及 的 倍（均 ）。、及 的微泡半数及完全解离剪切应力均依次递增。结论：双靶向微泡能够实现与靶分子相对牢固的结合，其靶向黏附效能显著优于 及单靶向对照微泡，有望实现高剪切力下的在体动脉超声分子影像学评估。关键词 双靶向超声微泡；弹性蛋白原；多聚唾液酸化路易斯；靶向黏附中图分类号 文献标志码 文章编号（）：动脉粥样硬化（，）是心脑血管疾病的重要发病基础。慢性炎症贯穿于 的发病全过程，其诱导的动脉管壁细胞外基质弹性蛋白的弹性生成（，）功能紊乱，是动脉结构重塑、弹性衰退及 进展的重要机制。大量研究证实，合成弹性蛋白的前体物质弹性蛋白原（，）在正常动脉细胞外基质中含量极低；然而当动脉 功能紊乱时，可在细胞外基质中及内皮细胞表面大量蓄积。这一特征使得靶向 的超声微泡（，）在理论上可实现活体状态下实时评估动脉 功能紊乱状态。然而人体大动脉始终处于高速、高剪切力的血流状态下，单靶向超声微泡很难与动脉内皮细胞及其间隙细胞外基质上的靶分子实现有效结合。多聚唾液酸化路易斯（，）是一种非抗体性的选择素快速结合型配基，能与动脉内皮细胞表面的 选择素快速但不牢固地结合。这为 缓慢结合型配基形成牢固结合提供了必不可少的时间窗与机会。本研究欲构建携 和 单抗的双靶向超声微泡，并体外验证其在高剪切力下的靶向黏附能力。材料与方法 、双靶向微泡的构建按一定摩尔比取二棕榈酰磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺和二硬脂酰磷脂酰乙醇胺生物素脂质（均为 公司，美国）溶液，均匀混合后减压旋转蒸发除尽有机溶剂，在形成的脂质膜中加入磷酸盐缓冲溶液（），得脂质混悬液，再填充六氟化硫气体（.，安徽强源气体有限公司），机械振荡后加入亲和素（公司，美国）混合，再分离纯化后制备得到携载生物素的空载微泡（）。为制备靶向微泡，按照 个微泡浓度加入 的比例，分别加入（公司，新西兰）、单克隆兔抗小鼠抗体（公司，中国）以及 抗体 的混合液体，均匀混合后离心分离取气泡层样品，即分别制备得到携 的单靶向超声微泡（）、携 单抗的单靶向超声微泡（）以及携 和 单抗的双靶向超声微泡（）。靶向微泡显微表征、粒径、电位和浓度检测将微泡溶液用 稀释 倍后，取 滴到载玻片上，采用荧光倒置显微镜（，日本），在 倍物镜下依次拍照观察显微表征（图）。取微泡溶液，使用 稀释 倍后，取 稀释液加入到高灵敏度 电位及粒度分析仪样品池（，美国）中，测定其 电位。在 电解溶液中加入 微泡分散液，使用颗粒细胞计数及粒度分析仪（，贝克曼公司，美国）测定其平均粒径和微泡浓度。图 （）、（）、（）和（）的显微光镜表征 靶向微泡体外高剪切力靶向黏附能力评价 细胞培养皿用甲醇漂洗后干燥，再用 分别配备 的小鼠 选择素 段溶液（公司，美国）和小鼠 抗原溶液（公司，美国），按 比例混匀后，用移液器滴加 在培养皿中央，冰箱中放置 ，用 的 吐温 溶液洗涤 遍，的 缓冲盐溶液（）小牛血清白蛋白处理 ，再用 的 吐温 溶液洗涤 遍后备用。搭建好平行平板流动腔装置（，美国），分别在、（）的剪切应力下注射微泡样品（均约 个），进行微泡结合实验评价。微泡注射 期间，使用 倍物镜进行视频录制（帧）及定量分析（图）。图 平行平板流动腔微泡结合实验，注射微泡（）、（）、（）、（）的微泡结合情况 再使用生理盐水冲洗平行流动板，清洗完静止但未结合的微泡；从 剪切力开始进行冲洗，每 增加 倍剪切力，至镜下微泡完全解离或 后达到 ，进行微泡解离实验评价。冲洗过程使用显微镜（倍物镜）进行视频录制（帧）（图），最后采用 软件（，美国）对视频图像进行微泡计数及定量分析。东南大学学报（医学版）年 月，（）图 平行平板流动腔微气泡解离实验，逐步增加剪切力下（）、（）、（）、（）的微泡解离情况 统计学处理采用 软件对数据进行统计分析。计量资料以均值 标准差表示。不同剪切力下同一微泡类型组间比较及同一剪切下不同微泡类型组间差异比较均采用单因素方差分析，再利用析因分析分析不同微泡类型及不同剪切力两因素之间是否存在交互效应，然后利用 检验比较两两组间差异。.为差异具有统计学意义。结 果 微泡基本物理特征评价普通光学显微镜下本研究的生物素化脂质 为透亮 微 气 泡（图 ），分 布 均 匀，平 均 粒 径 约 为 ，平均浓度为 个。制备的、及 种微泡形态类似，平均粒径为 ，电 位 为 ，微泡浓度为 个（表）。表、和 的平均粒径、电位及微泡浓度测定结果微泡平均粒径 电位 微泡浓度 个 微泡靶向黏附结合能力的体外评价由低至高（、）的 种剪切力作用下微泡的全程（）结合数目 分别是 的 、及 倍，的 、及 倍，的 、及 倍（均 ）（表）。进一步组内两两比较证实，种剪切力之间及 种微泡之间差异均有统计学意义（均 ），且 种微泡结合数目均随着剪切力的增高而显著减少（均 ）（图、）。不同微泡类型及不同剪切力两因素对微泡结合数目的影响存在交互效应（）（表）。表 不同剪切应力下的微泡结合数（，）微泡不同剪切应力下每个视野微泡结合个数 总 计 值 值 总计 值 值 微泡靶向黏附解离能力的体外评价在微泡解离实验中，、及 的半数解离剪切应力依次为（）、（）、（）及（），组间比较差异有统计学意义（）。在（.）的剪切应力下，即可达到完全解朱正球，等 携 和 单抗双靶向超声微泡的构建及高剪切力下靶向黏附能力的评价离，而 和 的完全解离剪切应力分别为（.）及（），则为（），组间比较差异有统计学意义（）。与 剪切力比较，；与 剪切力比较，图 平行平板流动腔微泡结合实验同一微泡类型不同剪切力的两两比较 与 比较，；与 比较，；与 比较，图 平行平板流动腔微泡结合实验同一剪切力下不同微泡类型的两两比较 讨 论本研究利用 的特异性单抗构建靶向超声微泡用于超声分子成像，有望实现精准化在体评估 及 功能紊乱状态。我们的体外研究已证实，单靶向 的 超声微泡能与平行流动板的 抗原有效结合，且其结合可较空载微泡 耐受更强的剪切力冲击。然而，人体大血管始终处于高速、高剪切力的血流环境下，单靶向 的超声微泡很难与动脉内皮细胞及其间隙细胞外基质上的靶分子实现持续的有效结合，进而可能导致成像失败。本研究显示，的微泡结合总体数目显著优于 及，但其与 一样不能很好地耐受 高剪切力的冲击；相反，尽管 能较好耐受 剪切力的冲击且拥有较高的半数及完全解离剪切力，但是其微泡在长达 的持续结合中的总体数目较 及 显著减少。这说明，靶向微泡表面的 抗体确实能与动脉管壁内皮细胞表面的 形成较为牢固的结合，可以耐受高剪切力的持续冲击。但若没有 与 选择素之间快速且较不牢固的结合所争取的时间窗，其最终的结合数目仍然不尽如人意。这同时也说明，单靶向微泡 或 可能都很难胜任未来实现活体状态下的大血管 功能紊乱成像，联合二者的优势所构建的双靶向超声微泡 可能才是解决问题的关键。前已述及，慢性炎症状态在 和心脑血管疾病的发生发展中扮演了核心机制的角色。处在炎症状态的动脉管壁内皮细胞会在细胞膜表面高表达 选择素，以便于白细胞通过 选择素的相关受体与之快速结合并锚定在细胞表面，从而诱导管腔内的白细胞进入动脉管壁并发生慢性炎症反应。正是利用这一特征，携 选择素的非抗体性配基 及 单抗的双靶向超声微泡，本研究已证实其不仅可耐受 的剪切力冲击，还具有较高的半数解离剪切应力及完全解离剪切应力，特别是在高剪切力下结合数目分别为 的 倍、的 倍及 的 倍。近期 等已成功利用 选择素配基及抗炎性分子单抗双靶向微泡，在体外高剪切力下成功实现与靶分子的有效结合及体内的超声分子成像。然而迄今为止，利用超声分子成像技术在体评估动脉 功能紊乱尚未见报道，故本研究所构建的双靶向微泡 有望在未来活体状态的 功能紊乱定量评估中发挥重要的可视化作用。本研究具有一定的局限性，本研究为体外实验，且平行平板流动腔设备所需剪切力为生理盐水冲击构建，与人体循环系统内环境存在一定的差异，故靶向微泡黏附能力在未来还需进一步动物实验体内验证。总之，本研究利用 及 单抗构建的双靶向超声微泡，在体外微泡结合及解离实验中表东南大学学报（医学版）年 月，（）东南大学学报（医学版）（），；（）：现出区别于空载及单靶向微泡的黏附力和解离能力，能在较高剪切力下实现与靶分子的有效结合，有望在活体状态下实现大动脉的超声分子影像学成像并实时动态评估 功能紊乱状态。参考文献 ，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，：，（）：收稿日期 修回日期 基金项目 国家自然科学基金资助项目（）作者简介 丁建东（），男，江苏盐城人，主任医师，医学博士。：通信作者 马根山：引文格式 丁建东，徐荣丰，张晓黎，等 单纯应用超声心动图指导经皮二尖瓣钳夹术治疗重度功能性二尖瓣反流一例 东南大学学报（医学版），（）：论著 单纯应用超声心动图指导经皮二尖瓣钳夹术治疗重度功能性二尖瓣反流一例丁建东，徐荣丰，张晓黎，丁秀霞，王臻，陆启同，章晓国，陈立娟，马根山（东南大学附属中大医院 心内科，麻醉科，心胸外科，江苏 南京）摘要 二尖瓣反流（）是最常见的心脏瓣膜疾病，对合并高龄、多器官并发症、心力衰竭等因素的严重 高手术风险患者，经皮二尖瓣钳夹术（）已成为替代治疗方法。目前该技术通常由 线和超声心动图引导，但术中 线对术者及患者均有辐射损伤。作者首次在江苏省报道 例单纯应用超声心动图指导 治疗重度功能性。在超声引导下，完成二尖瓣夹输送和安装，且随访效果良好。关键词 超声心动图；二尖瓣钳夹术；二尖瓣关闭不全，重度中图分类号 文献标志码 文章编号（）：