液滴微流控技术在微生物工程菌株选育中的应用进展_涂然.pdf

2023 年 第 4 卷 第 1 期|Synthetic Biology Journal 2023，4（1）：165-184液滴微流控技术在微生物工程菌株选育中的应用进展涂然1，2，李世新3，李昊霓3，王猛2（1 重庆工商大学环境与资源学院，重庆 400067；2 中国科学院天津工业生物技术研究所，中国科学院低碳合成工程生物学重点实验室，天津 300308；3 天津科技大学生物工程学院，天津 300457）摘要：微生物工程菌株是生物制造的重要基础，但大多数的工程菌株需要进化改造才能适用于生物制造。在菌种选育过程中，如何高效地筛选获得具有目标性状的微生物工程菌株是进行生物制造应用的关键影响因素之一。液滴微流控技术作为近年来发展起来的一种基于微芯片的高通量检测筛选技术，可以生成大小均一、相互独立的微体积液滴小室，并应用于单细胞的培养、检测和分离，在微生物菌株改造尤其是分泌型菌株的改造中得到广泛应用。本文首先概述液滴微流控技术的组成部分，对关键性的技术进行简要介绍；其次根据液滴检测信号的来源、液滴筛选流程的难易程度和液滴分选仪器的适用范围，对液滴微流控技术在工程菌株选育中的应用进行总结分析；最后对液滴微流控技术在应用中存在的问题和研究方向进行展望，为深化其在微生物合成生物学中的应用提供指导。关键词：液滴微流控技术；单细胞分析；细胞工厂；高通量筛选；进化改造中图分类号：Q939.97 文献标志码：A Advances and applications of droplet-based microfluidics in evolution and screening of engineered microbial strainsTU Ran1，2，LI Shixin3，LI Haoni3，WANG Meng2（1 College of Environmental and Resources，Chongqing Technology and Business University，Chongqing 400067，China；2 Key Laboratory of Engineering Biology for Low-Carbon Manufacturing，Tianjin Institute of Industrial Biotechnology，Chinese Academy of Sciences，Tianjin 300308，China；3 College of Biotechnology，Tianjin University of Science&Technology，Tianjin 300457，China）Abstract:Microbial strains are perquisites for biomanufacting through microbial culture and fermentation.However,most strains usually need to be engineered to improve their performances for industrial applications.Therefore how to efficiently screen and isolate robust strains is a critical step of strain engineering.As an advanced high-throughput screening technology,droplet-based microfluidics developed with micro-chips can generate highly independent and uniform micro-or nano-liter droplets,in which single cells can be encapsulated,inoculated,detected,and analyzed for strain engineering.It is especially useful in the evolution of microbial strains for producing extracellular products.In 收稿日期：2021-12-05 修回日期：2022-01-18基金项目：国家重点研发计划“绿色生物制造”重点专项（2021YFC2100201，2021YFC2103302）；天津市合成生物技术创新能力提升行动项目（TSBICIP-PTJS-003，TSBICIP-KJGG-006）引用本文：涂然，李世新，李昊霓，王猛.液滴微流控技术在微生物工程菌株选育中的应用进展 J.合成生物学，2023，4（1）：165-184Citation：TU Ran，LI Shixin，LI Haoni，WANG Meng.Advances and applications of droplet-based microfluidics in evolution and screening of engineered microbial strains J.Synthetic Biology Journal，2023，4（1）：165-184DOI:10.12211/2096-8280.2021-105特约评述合成生物学 第 4 卷this review,we first introduce the basic components of the droplet-based microfluidic system and the main steps involved in the strain screening.We then summarize key factors for the application of the droplet-based microfluidic technology in strain engineering,such as the signal sources of droplet detection,the difficulties of handling droplet screening,and the scopes of droplet sorting instruments.Based on the instruments used for the droplet sorting,we group the application cases into two types either via fluorescence-activated droplet sorting(FADS)using microfluidic equipment or via fluorescence-activated cell sorting(FACS)using flow cytometry instrument.While FADS using single-layer water-in-oil droplet can be further classified into cellular signature,fluorescent reporter protein,and substrate-based reaction according to the signal sources,FACS can be divided into double-layers water-in-oil-in-water(W/O/W)droplet or microgel droplet according to the droplet property.Finally,we outline challenges and prospects for the droplet microfluidic technology,and provide some guidelines for its applications in synthetic biology.Compared with traditional screening methods such as shaking flask or microplate with a throughput of hundreds to thousands of samples per day in milli-or micro-liter volume,the droplet-based microfluidic technology can achieve millions of samples per day in pico-or nano-liter volume,resulting in an increase of thousand-folds in screening speed and cost-saving for million-folds.By integrating with an automated station,the droplet-based microfluidic technology can be further improved for its screening efficiencies and application potentials in microbial synthetic biology.Keywords:droplet-based microfluidics;single-cell analysis;cell factory;high-throughput screening;direct evolution合成生物学被认为是“DNA双螺旋发现”和“人类基因组测序”后的第三次生物技术革命，在生物基化学品合成、生物材料、生物能源、现代农业、环境治理等领域也有着广泛的应用前景1。合成生物学与传统生物学通过解剖生命研究其内在机理的方法刚好相反，它先基于数学、物理法则建立零部件，再将零部件（如基因）组装起来组成人工细胞，从而实现人工设计的生命体功能2-3。作为合成生物学的一个重要分支，微生物合成生物学是以微生物为研究对象，对已有微生物进行设计创制，使其具备目标性状功能4，并进一步优化选育成为工业化应用的工程菌株。在微生物合成生物学研究过程中，如何高效地检测筛选获得具有目标特性功能起着重要作用，是有效获得目标菌株的关键5。最高效的检测筛选方式是基于目标性状与细胞生长相耦联的方式即选择筛选“selection”，如基于抗性6、表达7或者能量平衡的细胞增殖，166第 4 卷 目标性状越好细胞增殖越快。然而大多数的工业微生物表达产物如代谢物或者酶并不能与宿主细胞的生长相偶联，只能通过目标性状的表型进行检测筛选“screening”。通过表型检测筛选的高通量技术主要采用酶标仪、流式细胞仪和液滴微流控装置，每天的检测通量可以达到数十万至千万个细胞，极大提高了微生物工程菌株选育的效率8-9。其中，液滴微流控技术作为近年来发展起来的一种基于微芯片的高通量检测技术，它可以在微、纳尺寸的芯片上生成大小均一、相互独立的液滴，用于单细胞的培养、检测和分离10-11。与连续流动的微流控系统相比，用于单细胞的液滴微流控系统最大的优势在于：液滴之间互不相容，每个液滴皆可作为独立的微反应器，可以将待检测的细胞样品单独包埋，进行单细胞及其胞外分泌代谢产物的分析12-13；短时间内可以生成大量的液滴，速度达到每秒数千个液滴，适合高通量的生物和化学分析14-15；液滴直径均一可控，液滴体积从皮升至纳升不等，降低了样品与试剂的消耗16。因此，液滴微流控技术具有速度快、通量高、成本低等显著特点。随着技术发展，研究者们可以在微芯片上进行液滴生成、融合、培养和分选等操作，实现微量样品的低成本、高通量的检测和筛选，这些研究显示出液滴微流控技术在微生物工程菌株改造、细胞分析和药物筛选等领域的巨大应用潜力10，17-25。本文针对液滴微流控技术在微生物工程菌株改造中的应用，首先简要介绍了液滴微流控系统的组成和特点；其次根据液滴微流控筛选技术中液滴检测信号的来源和检测分选的操作特点，按照液滴分选仪器的分类解析了采用液滴微流控装置的单层液滴和采用流式细胞仪的双层液滴或者凝胶液滴在工程菌株选育中的应用；最后展望了液滴微流控技术的发展方向，为进一步普及和指导液滴微流控技术在工程菌株创制中的应用奠定基础。1 液滴微流控技术与装置1.1 液滴微流控技术微流控技术（microfluidics）是一种在微通道中对流体进行操控的科学与技术，涉及化学、材料、生物等多个交叉学科，具有微型化和集成化的特点，也被称为芯片实验室（lab on a chip）26。微流控技术主要包括连续微流体技术和以间断液滴为基础的微流体技术，相对连续流体，间断液滴最大的优势在于可以形成大小可控、相互独立的单个液滴微反应器，并将待检测的样品单独包埋在这些液滴微反应器中，实现单细胞及其胞外分泌物的分析13。由于液滴体积微小且能在极短的时间内大批量地生成并平行处理，因此液滴微流控分选技术（FADS，fluorescence-activated droplet sorting）具有速度快、通量高、成本低等显著特点。通过在微芯片上设计特定的通道，可以实现液滴的生成、混合、存储、培养、输送、融合、分裂、检测、分选等操控27，为低成本高通量地检测筛选微生物工程菌株奠定了基础28。有关液滴微流控技术中液滴的操控有很多相关综述14，29-33，本文根据在微生物工程菌株筛选中的应用需求（图1），主要选取液滴的生成、培养（或融合）、检测、分选等图2（a）进行介绍。液滴生成是微流控筛选微生物菌株的第一步，通过将单细胞包埋在相互隔离分散的液滴中，奠图图1液滴微流控技术筛选微生物工程菌株流程图Fig.1Flowchart of droplet microfluidic screening for industrial strains167合成生物学 第 4 卷定后续液滴中细胞培养和检测的基础34。与传统的乳化过程类似，液滴生成是通过将两种互不相溶的液体混合而成。两种液体中一种是分散相而另一种是连续相，且分散相以相对较小的体积分散于连续相中形成液滴35-36。根据连续相和分散相的不同，液滴可以分为油包水液滴（W/O，water-in-oil）和水包油液滴（O/W，oil-in-water），用于微生物培养的通常都是W/O油包水液滴。液滴的生成方式包括两类：主动生成和被动生成。主动生成的方法主要是通过外加场的搅动来生成液滴，如电37、磁38、声37、气39-40等，该方法可以更好地控制液滴的大小和频率，且不依赖微芯片，但生成液滴的速度较慢且在细胞液滴中应用较少41-42。被动生成的方法主要通过芯片的几何结构特性来进行液滴生成图2（b），如T型结构（T-junction）、流动聚焦结构（flow focusing）、同流结构（co-flowing）等33，该方法生成液滴的过程简单、高效、速度快，能达到每秒 2 万个液滴43。其中，T型结构的不对称力对液滴包埋细胞的影响较大，同流结构由于采用套管导致它的控制复杂且不均一，故较少用于细胞液滴44；相比而言，流动聚焦液滴包埋细胞的生成过程更为稳定，且液滴大小操控范围更宽42，因此在微生物细胞包埋中应用更为广泛。液滴培养是微流控筛选微生物菌株的第二步，生成的细胞液滴作为细胞培养的微反应器，通过芯片原位在线培养45-46或者离心管、注射器等离线培养47-48方式进行细胞增殖。利用芯片原位在线培养可以定向观测细胞特性，如生长速率、细胞对外界的响应、细胞分泌酶动力学监测15，49。由于原位培养的细胞液滴保存在芯片上，不利于后续的检测分选。因此，对于涉及分选步骤的微生物菌种选育研究，常采用离心管或注射器的方式进行液滴离线培养，以利于培养后的液滴重注入到分选芯片上进行检测分选，从而获得高产工程菌株48。包埋细胞的液滴需具备温度和pH耐受性，维持细胞液滴的长期稳定培养。通过在油相中添加改变液面张力的表面活性剂，可以起到增加液滴稳定性、减少液滴与液滴间物质交换的作用50。细胞液滴常采用非离子型表面活性剂，具有良好的稳定性和生物兼容50-51。已报道的表面活性剂包括实验室自制的KryJeffD900 fluorosurfactant52-53或者商业化购买的 Pico-Surf54-55、EA surfactant56-57和008-Fluoro Surfactant58等，这些表面活性剂制备的液滴在细胞培养、核酸检测、代谢物监测等方面都有广泛应用。细胞液滴培养后，可能需要向液滴内引入其他物质，如酶活性检测的底物、细胞裂解试剂、相互作用物、染色剂、反应终止剂等物质，完成液滴内内涵物的反应和检测分析59-60。其他物质的引入可以通过将试剂液滴和目标液滴这两种液滴相融合（droplet merge）61或者将试剂皮升注入（pico-injection）至目标液滴 62的方式进行。液滴融合又可分为主动融合和被动融合。前者是利用微芯片的几何结构变换和连续相油相的表面特性改变致使液滴不稳定诱导液滴间的被动融合；而后者是通过施加外电场、磁场、温度场、表面声波和激光聚焦等作用诱导液滴界面失去稳定性实现液滴间的主动融合42。因此被动融合不需要主动控制类的设备装置，比主动融合所需装备少，且因为没有外部施加压力，对细胞内物质的干扰较小，在细胞生化分析方面更有优势，但其融合效率远小于主动融合；相反主动融合方式可以利用电极加速液滴表面张力的不稳定性，促进液滴更快速地融合，具有更高的效率63。外源物质的添加也可以通过皮升注入的方式，在电场诱导的液体界面不稳定状态下，将外加试剂注入到液滴中。该方法具有每秒钟数千个液滴的通量和顺序图图2液滴操控示意图Fig.2Diagram for manipulating microfluidic droplets168第 4 卷 多次注入其他物质的能力62，在微生物工程菌株检测筛选中进行其他物质添加的应用占主导地位。液滴检测分选是微流控筛选微生物菌株的最后一步，其目的是从大量的液滴中检测并分离出感兴趣的目标液滴，获得高产工程菌株。根据分选的作用方式分为主动分选和被动分选。被动分选是利用微流控芯片的结构及液滴自身的物理性质进行的分选（如液滴的大小）64，这种分选方式并不依靠外加场或者力的作用，虽然所需设备少，但因干扰因素多导致分选效率低、误差大，因此实际使用较少。主动分选是依据液滴自身或者外加因素导致的物理或者化学性质差异，在检测确定目标液滴后，通过对液滴施加外部作用力，如光65-66、电67、磁68、声69、压70等方式进行液滴分选71。大多数可测定的液滴参数都可以作为信号确定目标液滴，进行后续的主动分选，因此主动分选不依赖于微芯片的限制，能对较大范围尺寸（pL至nL）和多种参数信号的液滴进行分选，例如基于吸光度（AADS，absorbance-activated droplet sorting）、荧光（FADS，fluorescence-activated droplet sorting）、拉曼（RADS，raman-activated droplet sorting）、细胞密度（IADS，image-activated droplet sorting）、质谱（MADS，mass-activated droplet sorting）等检测信号进行分选，极大拓展了适用范围，成为微生物工程菌株液滴分选的主要方式72。1.2 液滴微流控检测分选装置液滴微流控检测分选装置主要包含液滴微芯片、信号检测分选光路和信号采集处理三部分图3（a）。其中液滴微芯片是进行液滴生成和操控的载体，微芯片的制备可以采用高聚物材料、无机材料和纸基材料等多种材料32，但用于细胞液滴的微芯片常采用聚二甲基硅氧烷（PDMS）/玻璃或者聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）等制作，前者因成本低廉、设备门槛低是高校实验室中最为常见的微芯片材料，后者因复制成品率高、性能稳定、不易形变等优点，在商业化产品中大量使用32。信号检测分选光路用于微流控芯片上流经液滴样品的信号检测和液滴分选，直接决定样品信号的检测速度、灵敏度和适用范围等指标。按照检测原理可以分为光学检测、电化学检测、质谱检测等73-74。光学检测通过检测各种光信号参量来确定样品的各项指标，可以分为吸光度、荧光、化学发光、拉曼光谱和折射率等检测方式74。其中吸光度检测（AADS）依据朗伯-比尔定律测量物质浓度，具有检测物质种类丰富、检测器结构简单等优点，是最早应用于微芯片分析的一类光学检测方法，但由于微流控芯片检测区的检测体积小、吸收光程短等局限，导致吸光度检测的相对灵敏度低，使其应用受到一定限制75。与吸光度检测相比，荧光检测（FADS）具有极高的检测灵敏度，通过荧光试剂标记可以检测fmol/L或者pmol/L级的低浓度物质，利用光子计数、双光子激发等技术甚至可以检测单分子蛋白76，此外荧光检测还具有特异性强和线性区间大的优点，适用于氨基酸、DNA等多种重要生化物质的检测。化学发光检测通过化学、生物或者电化学反应产生光信号反馈出待测物质的浓度，与荧光检测相比较，化学发光不需要外来的光源，对设备要求简单，但在灵敏度上弱于荧光信号77。拉曼光谱检测（RADS）利用物质自身的分子振动、转动等特性指纹来鉴定物质，不需要外加其他试剂与待检测物反应获取检测信号，因此属于免标记检测方式78，具有更广泛的应用范围，但由于拉曼信号较弱需要采集时间长，检测通量约20个/s79，小于荧光信号检测通量（2000个/s）16。折射率检测也是利用物质自身的特性进行无标记检测，可以通过材料的折射率不同检测无紫外吸收、无荧光的非离子物质如蔗糖、PEG，也可以通过细胞的折射率不同检测形态大小和细胞核等内涵物差异较大的细胞80，这种免标记的方式避免了荧光标记和化学修饰对细胞的影响，但折射率检测对激光光源及外部条件如温度、压力和流速的控制要求高，多应用于细胞自然状态的监测81。此外，通过细胞浓度不同影响散射光信号（light scattering）也可以检测液滴内细胞个数，进行耐药性菌株的筛选分析82。上述的光学检测方法中，荧光检测因其灵敏度高、特异性强、检测通量高，是微生物细胞工程菌株筛选中最常用和最有效的方法。电化学检测包括安培检测和电导检测83，其169合成生物学 第 4 卷原理是基于样品发生氧化还原反应产生电流信号或者样品自身的电导差异进行检测84，可以进行液滴尺寸、生成频率、液滴内物质离子浓度检测，在小分子化合物检测方面具有优势77，85-86。质谱检测（MADS）通过测量离子质荷比（质量-电荷比）进行物质结构分析87，特别适用于未知结构物质的检测，多用于细胞-药物作用后代谢物质的分析研究88-89。通过结合液滴微流控检测分选技术，在微生物工程菌株产小分子物质肽、蛋白、酶等检测和筛选方面应用潜力巨大90-91。目前微流控装置以实验室自研为主，信号采集处理系统主要采用美国国家仪器公司的现场可编程门阵列（FPGA）和 LabVIEW 自编软件程序控制55，92，少部分采用其他微控制处理器如Arduino板进行控制93-94。根据光路设计不同分成基于激光诱导荧光检测的共聚焦光路95图3（b）和基于光纤传导光路96-98图3（c）。已报道的液滴微流控荧光检测筛选技术多采用共聚焦光路，该光路中的激发光（激光光源）经过扩束器准直和二向色镜反射后，通过显微物镜聚焦并垂直照射到芯片的样品上，样品被激光激发后产生的发射光（荧光信号）经过显微物镜聚焦后，再经干涉滤光片滤除干扰光后成像，在光检测元件上实现信号检测。该系统通过共聚焦和滤光处理将激发光、反射光、杂散光和目标荧光信号完全分开，极大提高了目标荧光信号的检测灵敏度和信噪比99。与共聚焦光路相比，光纤光路通过将光纤整合在芯片上实现信号检测，省去了空间光路对准模块，具有仪器体积小、光信号传播方向灵活、光信号受外界光干扰小等优点，但由于光纤整合芯片的制备工艺复杂，不利于量产加工，因此商品化的液滴微流控仪器多采用非光纤芯片的形式。目前的微流控检测分选装置以实验室自主研制为主，商品化的仪器较少100-101，因此采用液滴微流控装置进行菌株选育受到仪器装置的限制无法广泛普及。为了更广泛地将液滴微流控技术应用于菌株选育，研究者也开发了基于液滴的流式细胞仪工程菌株检测分选技术17。已报道的基于液滴的微生物工程菌株筛选应用综述主要从检测信号来源、酶分类或宿主细胞分类等方面阐述10，59。本文从是否具备液滴分选装置角度出发，根据液滴信号来源和液滴操作特点，对适用于液滴微流控装置的单层液滴和适用于流式细胞仪的双层液滴或者凝胶液滴归纳阐述，为研究者根据所具有的装备条件选择合适的液滴微流控技术进行工程菌株选育研究提供参考（图4）。图图3液滴微流控装置示意图Fig.3Schematic diagram for droplet microfluidic equipment170第 4 卷 2 基于液滴微流控装置的筛选应用依托液滴微流控装置进行菌株的检测分选时，根据液滴内检测信号的来源和检测分选时液滴操作的差别，可以分成基于细胞自身信号、基于荧光报告蛋白和基于外源添加试剂（直接添加底物或者基于皮升注入添加底物）三种方式（图5）。2.1 基于细胞自身信号当微生物工程菌株分泌表达的待检测物自身具有荧光信号如核黄素、叶绿素、类胡萝卜素等，可以直接利用该物质的荧光信号进行检测，对液滴内的工程菌株进行检测筛选。其微流控操控的流程如图5（a）所示，通过液滴生成芯片形成含有细胞的液滴，通过离线培养（由于细胞增殖时间较长一般采用离线培养方式）后经过液滴重注入，在液滴分选芯片中进行检测和分选，获得目标微生物菌株。该类型不需要采用其他特殊试剂（底物、生物传感器），具有液滴稳定、操控简单（只需要制备液滴和对液滴进行检测分选）的特点。如利用叶绿素在488 nm或者594 nm激光激发下产生630 nm发射光的荧光特性，对具有不同生长速度的微藻或者蓝藻细菌进行液滴微流控筛选。由于生长快的细胞增殖后在液滴中细胞数多，因此细胞液滴的叶绿素含量更多，其荧光信号更高102。通过分选出荧光信号高的液滴，可以获得生长更快图图4液滴微流控菌株检测筛选应用流程图Fig.4Flowchart for applying droplet-based microfluidic technology to microbial strain screening图图5基于液滴微流控技术装置的微生物工程菌株检测分选组成模块示意图Fig.5Schematic diagram for the modules of detection and sorting of industrial strains using FADS171合成生物学 第 4 卷的藻类细胞，促进藻类的碳中和利用的应用。此外，利用核黄素在 Ex488 nm/Em520 nm 的荧光特性，研究者将低水平分泌核黄素的乳酸菌，通过化学诱变的方式获得了核黄素生产菌种突变库，并以核黄素的天然荧光信号进行液滴微流控的检测分选，获得高分泌表达的核黄素生产菌株。其筛选速度达到每秒300个细胞，阳性细胞的富集率高达2000倍，利用该技术可以发现只有约百万分之一概率碱基突变的菌株，且筛选获得的高产菌株比出发菌株的核黄素产量提高250%，显示出液滴微流控筛选的高通量和有效性103。除了荧光信号，拉曼光谱和质谱信号作为一种利用物质自身的指纹信号，也可以用来进行液滴内工程菌株的检测筛选。由于拉曼光谱信号弱、信号采集时间长、细胞高速移动定位困难等因素，导致其检测速度仅每分钟数个。针对这一问题，研究者通过正介电泳快速捕获细胞的方式将拉曼信号的检测速度提高几十倍，通量达到 260 个样品/min，并成功用于虾青素高产菌株的检测分选78。此外，也可以将液滴与质谱检测系统相耦联，利用物质自身的质荷比特性，对微生物工程菌株产生的物质如多肽、酶、代谢物等检测筛选90，104。受限于质谱分析的速度，液滴质谱检测分选通量约每分钟240个，其筛选速度基本与拉曼信号检测分选类似，都小于基于荧光信号每秒钟2000个样品的分选通量16。当检测的对象是细胞本身而非其生产的代谢物等时，利用图像识别技术，通过光散射差异对液滴内细胞数进行分析，也可以作为液滴信号进行目标微生物的检测筛选。在实际应用中，液滴通过时，相机会自动捕捉拍照液滴，并对液滴内的信号进行图像识别处理。利用该技术，研究者能够对不同形态的藻类细胞进行分类和分选105，对含有红细胞的单细胞液滴进行富集106，为下一步的处理和分析提供便利。由于这种方式依据细胞的形态和数目等特性，不需要待检测的细胞含有荧光、拉曼等信号，因此在细胞分类、耐药性研究以及与细胞生长耦联的检测体系中应用潜力巨大，但与荧光信号检测分选比较，也存在通量较低（每秒钟数十个细胞）的不足。2.2 基于荧光报告蛋白荧光蛋白是一种在激发光照射下能够发射荧光的蛋白质，可以用来标记其他物质（如酶蛋白、小分子物质等），并将目标物质的浓度转换为荧光信号进行定量检测，进而检测和筛选生产目标酶蛋白或者小分子物质的微生物工程菌株。与基于细胞自身信号类似，如图5（b）所示基于荧光报告蛋白的微流控操作流程也相对简单。通过液滴生成芯片产生含有细胞的液滴，该细胞液滴可以只含有一种单细胞或者含有多种细胞，经过离线长期培养后，再经过液滴重注入将液滴转移到分选芯片中进行检测，并分选获得目标微生物菌株。由于检测信号来源于细胞内的荧光蛋白信号，因此该类型也无需外源添加其他试剂的步骤，同样具有液滴稳定、操控简单的特点。已报道的文献主要包括酶蛋白高表达筛选（如生产菌内酶蛋白与荧光蛋白融合表达）55，化合物高分泌工程菌株筛选（如生产菌内含有能感应目标化合物的生物传感器）107，生产菌和感应菌（内含能感应化合物的生物传感器）共包埋培养108三种方式。前两种方式因为荧光蛋白标记在生产菌中，因此只需要在液滴中包埋生产菌一种细胞即可。例如将热诱导型启动子控制的目标植物酶蛋白和黄色荧光蛋白（YFP）融合表达后，酶蛋白表达越多则荧光信号越强，经过原生质体液滴制备和培养，根据液滴内荧光信号的强弱可以高通量分选获得热激条件下目标酶蛋白表达量高的植物细胞。该技术每小时能检测筛选10万个细胞，对比传统植物愈伤组织培养后再检测的方法，显著缩短植物细胞的培养和检测时间，有效促进植物生物学研究55。此外，通过将能感应目标化合物的生物传感器导入到生产菌中，可以对高产该化合物的高产菌进行检测筛选。然而，对于绝大多数微生物工程菌株而言，由于生产稳定性要求或者非模式菌株遗传操作困难等限制条件，无法直接在生产菌中导入生物传感器，此时可以采用第三种形式，即将生产菌和能响应生产菌产生的小分子物质的感应菌株共同包埋在液滴中，通过感应菌的荧光信号间接反映出目标小分子含量，进行生产菌的172第 4 卷 检测筛选。例如对香豆酸与阻遏蛋白结合后能将阻遏蛋白从启动子区域解离，进而启动下游 YFP荧光蛋白的转录翻译，根据这一原理，可以构建出响应对香豆酸的生物传感器，并导入到大肠杆菌中获得对香豆酸感应菌。当目标化合物对香豆酸浓度越大时，穿膜进入感应菌的对香豆酸越多，其解阻遏效应强，感应菌中YFP蛋白表达越多荧光信号越强。将该感应菌与分泌对香豆酸的酵母生产菌共同包埋在液滴中进行培养，由于对香豆酸的浓度与YFP的荧光信号成正相关，因此可以通过YFP荧光信号筛选获得高产对香豆酸的生产菌109。这种生产菌和感应菌共包埋培养的策略也可以应用于两种菌株互相依赖生长的“交叉饲养”类型检测筛选，其中生产菌产生的物质是感应菌生长的必需物质。例如研究者按照50150个氨基酸营养缺陷型感应菌匹配1个分泌氨基酸生产菌的比例，将两类菌株共同包埋在液滴中进行“交叉饲养”，其中感应菌能组成型表达绿色荧光蛋白，当氨基酸生产菌大量生产分泌氨基酸时，感应菌因快速增殖而表达出高荧光信号，通过分选高荧光信号的液滴即可获得高产氨基酸的生产菌株110。在以上共包埋培养体系中，需要注意的是为了获得生产菌的单细胞液滴，一般生产菌的细胞个数要符合泊松分布且远小于共包埋的感应菌的细胞个数。另外由于分选出的液滴中含有生产和感应两种菌株，还需要对分选液滴进行生产菌株的分离培养，如通过添加抗性等方式获得纯的目标生产菌株。2.3 基于外源添加试剂当微生物工程菌株分泌表达的待检测物（小分子化合物、酶）没有自发的检测信号时，可以通过外源添加试剂与待检测小分子物质发生反应或者发生酶催化反应并产生光学信号进行检测筛选。根据底物与待检测物反应时间的快慢选择不同的时间加入试剂，包括细胞和试剂同时包埋在液滴中进行培养、检测和分选，或者细胞先包埋在液滴中培养一定时间后再将试剂通过液滴融合（merge）111或者皮升加入（pico-injection）112的方式加入到细胞液滴中进行检测和分选。细胞和试剂同时包埋的微流控操作流程如图5（c）所示，通过两个水相入口的液滴生成芯片将细胞和底物共包埋在液滴中，经过离线长期培养后，再将液滴重注入至液滴分选芯片进行检测和分选。例如首次报道的液滴微流控应用于酶活性筛选的案例中，研究者将产半乳糖的大肠杆菌细胞和半乳糖苷酶底物共包埋在液滴中并离线培养，细胞在液滴中增殖的同时表达半乳糖苷酶，酶作用于底物产生荧光，酶越多则荧光信号越强，因此根据荧光信号的强弱可以分选获得高产半乳糖苷酶的大肠杆菌，其分选通量达到每秒钟 300 个细胞，分选正确率达到99.9%92。此后，液滴微流控在微生物工程菌株表达酶筛选得到了广泛应用，如芽孢杆菌表达纤维素酶（cellulase）113、淀粉酶（amylase）114，酵母表达辣根过氧化酶（horseradish peroxidase）16、淀粉酶（amylase）48，115，大肠杆菌表达硫酸酯酶（sulfatase）47，56、糖苷酶（glycosidase）116、醛缩酶（aldolase）52，117、酯酶（esterases）118、DNA 作用酶（polymerase，restraction endonuclease，ligase）8等。由于液滴生成芯片的通道尺寸限制，已报道的微生物工程菌株主要是大肠杆菌、芽孢杆菌、酵母菌等形状相对规则、直径在数十微米以下的细胞。对于萌发后形成丝状的细胞可以通过包埋孢子的方式进行液滴制备，如研究者通过将黑曲霉的孢子悬液与淀粉酶底物共包埋在液滴中，孢子在液滴中能正常萌发并表达淀粉酶，实现了高产淀粉酶丝状真菌的检测筛选，其分选通量可以达到每秒钟20个细胞，在1.5 h内可以完成上万个细胞的检测筛选53。该方式也在里氏木霉产纤维素酶高产菌株的筛选中得到应用，从数十万的突变菌株中筛选获得纤维素酶产量提高46%的突变株119。细胞和底物共包埋制备液滴的方式简单便捷，但有时底物的过早加入会由于酶促反应过快或者底物自身降解、非特异性反应等因素导致底物产生 的 信 号 值 与 目 标 细 胞 的 特 性 不 一 致 的 现象112，120。此时采用先进行细胞液滴培养，再通过液滴融合或者皮升注入的方法加入底物试剂进行酶促反应图5（d）。如漆酶112、木聚糖酶121、脂肪酶122、乙醇123等微生物工程菌株的筛选和基于血管紧张素酶底物的抗体细胞124筛选应用。此外，对于先转录翻译，再检测筛选的无细胞体系（体外转录翻译，in vitro transcription and translation，173合成生物学 第 4 卷IVTT），为了避免底物对于IVTT的影响，也需要先制备IVTT的液滴进行目标蛋白表达，再加入底物进行检测筛选，如半乳糖苷酶111、核糖酶125、蛋白酶126等应用筛选。总体而言，基于细胞和底物试剂反应的筛选应用占据微流控在微生物工程菌株筛选的70%以上，远超过基于细胞自身信号和荧光报告蛋白的筛选应用。基于液滴微流控装置的液滴筛选体系总结于表1。3 基于液滴和流式