人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑敏感基线的建立及抗药性监测_马新智.pdf

第 51 卷 第 3 期东北林业大学学报Vol51 No32023 年 3 月JOUNAL OF NOTHEAST FOESTY UNIVESITYMar 20231)吉林省科技发展计划(20210204047YY);国家现代农业中药材产业技术体系项目(CAS21)。第一作者简介:马新智，男，1996 年 3 月生，吉林农业大学植物保护学院，硕士研究生。Email:15764338162 163com。通信作者:张艳敬，吉林农业大学植物保护学院，讲师。Email:yjzhang77 126com。高洁，吉林农业大学植物保护学院，教授。Email:jiegao115 126com。收稿日期:2022 年 3 月 9 日。责任编辑:王广建。人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑敏感基线的建立及抗药性监测1)马新智卢宝慧王若谷陈长卿张艳敬高洁(吉林农业大学，长春，130118)冯志伟侯万鹏孙国刚李公启(吉林参王植保科技有限公司)(集安市人参研究所)摘要为了解人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性情况，采用菌丝生长速率法测定了人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感性，采用最小抑菌浓度法监测人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性。结果表明:氯氟醚菌唑对供试的 148 株人参灰葡萄孢菌株的 EC50值为 0008 42795 8 mg/L，其敏感性频率分布呈连续单峰曲线，经 KS 法检验符合正态分布，未出现敏感性明显下降的抗药性菌株群体，EC50平均值为 0174 4 mg/L，可作为人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线;不同地区来源、不同年份分离的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性差异显著(P005);所检测的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的抗药性水平多数为敏感菌株和低抗菌株，只有吉林省抚松县和集安市有少量中抗和高抗菌株，抗性频率均在 370%以下。本研究为氯氟醚菌唑防治人参灰霉病提供了技术依据。关键词人参;灰葡萄孢;氯氟醚菌唑;敏感基线;抗药性分类号S4822Establishing Sensitivity Baseline and Fungicide-resistance Monitoring of Botrytis cinerea Populations from Ginsengto Mefentrifluconazole/Ma Xinzhi，Lu Baohui，Wang uogu，Chen Changqing，Zhang Yanjing，Gao Jie(Jilin Agricul-tural University，Changchun130118，P China);Feng Zhiwei，Hou Wanpeng(Jilin Shenwang Plant Protection Scienceand Technology Co Ltd);Sun Guogang，Li Gongqi(Insitute of Ginseng esearch in Ji an City)/Journal of NortheastForestry University，2023，51(3):136139In order to clarify the resistance of ginseng Botrytis cinerea strains to mefentrifluconazole，the sensitivity of B cinereato mefentrifluconazole was determined by mycelial growth rate method，and fungicide-resistance of B cinerea to mefentriflu-conazole was monitored with minimum inhibitory concentration method The range of EC50values of mefentrifluconazoleagainst the tested B cinerea strains was from 0008 4 to 2795 8 mg/L，and the sensitivity frequency distribution showed acontinuous unimodal curve，which was in line with the normal distribution by KS method There was no resistant popula-tion with significantly decreased sensitivity，and its average EC50value of 0174 4 mg/L can be used as the sensitive base-line of B cinerea to mefentrifluconazole There were significant differences in the sensitivity of B cinerea strains from dif-ferent geographical regions and different years to mefentrifluconazole Most of the tested strains of Bcinerea were sensitiveor low resistantto mefentrifluconazole，only a small number of medium and high resistant strains were found in FusongCounty and Ji an City of Jilin Province，and the resistance frequency was all less than 37%KeywordsGinseng;Botrytis cinerea;Mefentrifluconazole;Sensitivity baseline;Fungicide-resistance由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)引起的灰霉病是人参生产上的最重要的病害之一，通常发病株率为15%30%，严重地块超过 50%，严重影响了人参的产量和品质1。灰葡萄孢寄主范围广泛，具有变异频率高、再侵染频繁、易产生抗药性等特点，属于高抗药性风险的致病菌之一2。化学药剂是防治灰霉病的重要手段，但化学药剂的长期使用易导致灰霉病菌产生抗药性等问题。抗药性一旦产生病菌对药剂的敏感性下降，防治效果随之降低。检测病原菌抗药性产生是植物病害防治的重要内容3。已有研究表明，灰葡萄孢对腐霉利、嘧霉胺、嘧菌酯、吡唑醚菌酯、异菌脲、多菌灵、乙霉威等已产生不同程度的抗药性411。氯氟醚菌唑是由巴斯夫公司 2016 年开发的异丙醇三唑类杀菌剂，陆续在北美洲、欧洲和我国获得登记使用，用于防治多种作物的叶斑病和灰霉病等1216。Li et al17 已建立了来自草莓、芸豆、番茄和黄瓜上的灰葡萄孢病菌对氯氟醚菌唑的敏感基线，氯氟醚菌唑处理黄瓜灰葡萄孢后可导致菌丝分支增加，麦角甾醇含量降低，细胞膜通透性发生变化，在离体情况下，200 mg/L 氯氟醚菌唑对黄瓜灰霉病的预防效果可达100%，治疗效果为 727%，防治效果较好，且证实氯氟醚菌唑与戊唑醇、苯醚甲环唑、腈菌唑、己唑醇、三唑酮、氟哇唑、氯啶菌酯之间无交互抗性。关于人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑抗性情况未见DOI:10.13759/ki.dlxb.2023.03.003报道。因此，本研究测定了来自东北三省的 148 株人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感性，建立了人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线，比较了不同来源、不同年份的菌株敏感性差异监测了各个地区和不同年份获得的人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性情况，以期明确人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性情况，为氯氟醚菌唑防治人参灰霉病科学使用和灰葡萄孢病菌的抗药性风险评估提供科学依据。1材料与方法供试材料:20172019 年从人参产区田间发生灰霉病的植株分离的 148 株人参灰葡萄孢(Botrytiscinerea)，用于敏感基线的建立;20202021 年分离获得的 246 株灰葡萄孢病菌用于抗药性监测，所有菌株均经过柯赫氏法则验证对人参有致病性。滤纸片法20 保存于吉林农业大学植物病害综合治理实验室，使用前在 PDA 平板培养基上活化。供试药剂为 400 g/L 氯氟醚菌唑悬浮剂由巴斯夫欧洲公司提供。含药培养基的制备:将 400 g/L 的氯氟醚菌唑悬浮剂配成 10 000 mg/L 母液，置于 4 冰箱中备用。使用时用蒸馏水稀释母液，按设置浓度加入到马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基中，充分混匀，分别制成质量浓度为 1 000、100、10、1、01、001、0001 mg/L 的含药平板18。药剂敏感性测定:参考 Yin et al19 的方法进行测定。25 条件下，待测菌株在 PDA 平板上培养120 h，用无菌打孔器自菌落边缘打取直径 8 mm 的菌饼，菌丝面朝下接种于含药 PDA 平板的中心。每个浓度重复 3 次，以不加药的 PDA 平板作为对照。25 下培养 120 h，用十字交叉法测量菌落直径，取平均值，计算不同浓度的药剂对菌丝的生长抑制率。菌丝生长抑制率=(对照菌落直径处理菌落直径)/(对照菌落直径菌饼直径)100%。人参灰葡萄孢病菌田间抗药性监测:将 20202021 年分离获得的 246 株灰葡萄菌株 25 PDA 上活化培养后，置于敏感基线值的 5、10、100 倍浓度的含药 PDA 培养基上，以含等量无菌水的 PDA 培养基作为空白对照，均设 3 次重复，在 25 恒温、无光照、30%H 条件下培养 5 d 后，测量菌丝生长情况，参照推荐的标准2021 划分抗性类型，并计算其抗性频率。抗性水平划分:所有菌株在等量无菌水的PDA 培养基均可正常生长，在所有浓度的含药 PDA培养基上均不能生长的菌株为敏感菌株;在 5 倍敏感基线值浓度可以生长，10 倍浓度不能生长的的菌株为低抗菌株;在 5 倍、10 倍浓度均可以生长，100倍浓度不能生长的菌株为中抗菌株;在所有浓度均生长的为高抗菌株。抗性频率=(抗性菌株数/总菌株数)100%。数据处理:采用 SPSS 160 和 DPS 160 进行数据处理。根据野生敏感型病原群体对药剂敏感性分布为正态分布的原理，确认病原菌群体 EC50敏感性频率分布是否呈正态分布或连续的单峰曲线，如果呈正态分布或连续的单峰曲线，可将其群体 EC50均值作为病原菌对药剂的敏感基线22。采用 SPSS160 软件中的 Duncan 氏新复极差法对不同地区、不同年份的平均 EC50值进行差异显著性分析。2结果与分析21人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感基线的建立由表 1 可知，氯氟醚菌唑对来自东北地区的148 株人参灰葡萄孢病菌的 EC50值分布在 0008 42795 8 mg/L，平均值为 0174 4 mg/L，所检测的菌株对该药剂具有较高的敏感性，未发现抗药性亚群体。但最大值为最小值的 332 倍，EC50值跨度范围比较大，表明群体内个体间对氯氟醚菌唑的敏感性差异较大。EC50敏感性频率分布呈现连续性单峰曲线，通过 DPS 中的 KS 正态检验得到 P=012005，说明人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性频率符合正态分布，按照野生型病原群体对药剂的敏感性呈正态分布的原理，本研究中 148 株灰葡萄孢病菌的 EC50平均值 0174 4 mg/L 可作为人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线。表 1148 株人参灰葡萄孢病菌对氯氟醚菌唑的敏感性频率分布EC50/mgL1频率/%EC50/mgL1频率/%0008 40080 6)541 0441 60473 0)946 0080 60152 8)811 0473 00937 6)608 0152 80225 1)1689 0937 61402 2)203 0225 10297 2)2162 1402 21866 8)135 0297 20369 4)1486 1866 82795 8068 0369 40441 6)135122不同地区来源的灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性水平由表 2 可知，不同地区来源的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性存在一定的差异(P 005);较敏感的是来自吉林省的抚松县和靖宇县，黑龙江省的尚志县及辽宁省桓仁县的菌株，其 EC50平均值分别为 0134 1、0560 7、0203 1 和 0156 5mg/L，最不敏感的是吉林省安图县的菌株，其 EC50平均值为 0653 6 mg/L。731第 3 期马新智，等:人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑敏感基线的建立及抗药性监测表 2氯氟醚菌唑对不同地区来源的人参灰霉病菌的 EC50值比较地区株数/株频率/%EC50分布范围/mgL1EC50/mgL1黑龙江省尚志县42780027 80433 6(0203 10098 1)d吉林省集安市4631940008 41818 2(0316 70069 2)c吉林省抚松县4833330010 21057 6(0134 10040 8)d吉林省长白县1913190012 32232 5(0484 30130 3)b吉林省靖宇县32080012 61005 5(0560 70291 2)ab吉林省安图县1611110016 92795 8(0653 60159 3)a辽宁省桓仁县32080054 00187 4(0156 50040 1)d辽宁省清原县53470026 02749 5(0449 40328 2)b注:表中数值为平均值标准差，同列不同小写字母表示在 005水平上差异显著。23不同年份的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性水平由表 3 可知，不同年份的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性存在一定差异。无论从 EC50的最小值、最大值，还是平均值，2017 年采集的菌株对氯氟醚菌唑的敏感性高于 2018、2019 年的菌株。表 3氯氟醚菌唑对不同时间分离的人参灰葡萄孢病菌的EC50值年份株数/株频率/%EC50分布范围/mgL1EC50/mgL120174832430008 41818 2(0229 40141 5)b20183725000012 32232 5(0328 30109 1)a20196342570012 62795 8(0363 60115 3)a注:表中数值为平均值标准差，同列不同小写字母表示在 005水平上差异显著。24人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的田间抗药性监测由表 4 可知，采用最小抑菌浓度法测定 20202021 年分离的 246 株灰葡萄孢病菌对氯氟醚菌唑的敏感性，231 株表现为敏感，平均频率为 9431%;9 株为低抗菌株，抗性频率为 366%;4 株中抗菌株，抗性频率为 163%;2 株高抗菌株，抗性频率为081%。表 4不同地区人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的抗药性水平及抗性频率菌株来源样品数量敏感菌株数量频率/%低抗菌株数量频率/%中抗菌株数量频率/%高抗菌株数量频率/%吉林省抚松县54488888355523701185吉林省江源区2726963013700000吉林省集安市71649014456322811141吉林省柳河县141410000000000吉林省通化县383810000000000吉林省蛟河市121210000000000辽宁省宽甸县181810000000000辽宁省桓仁县12119167183300003结论与讨论建立病原菌对一种杀菌剂的敏感基线及进行抗药性评价，有助于优化该杀菌剂的使用策略，延长杀菌剂的使用寿命23。虽然氯氟醚菌唑已经在其他作物上用于防治灰霉病多年，在防治人参灰霉病上也有应用，但人参灰葡萄孢菌株对其抗药性水平尚不明确。本研究测定了采自中国东北地区人参主产省份的 148 株人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感性，确立了人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线为 01744 mg/L，对 20202021 年采自东北三省的246 株灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的抗药性监测结果表明人参灰葡萄病菌对氯氟醚菌唑抗药性水平和抗性频率均较低。尽管 Li et al17 已建立山东省草莓、芸豆、番茄和黄瓜上灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线(0124 mg/L)，但由于人参灰霉病的用药与草莓、芸豆、番茄和黄瓜上的灰霉病用药频次有很大不同，因此有必要建立人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线，这样更有利于准确监测人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的抗药性水平及进行抗药性风险评估。本研究建立的人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑的敏感基线值(01744 mg/L)高于 Li et al17 建立的黄瓜等作物灰葡萄孢的敏感基线值(0124 mg/L)。Li et al17 的研究结果表明氯氟醚菌唑与苯醚甲环唑、戊唑醇、腈菌唑之间无交互抗性，而苯醚甲环唑、戊唑醇、腈菌唑也是人参上常用的杀菌剂，因此一旦人参灰葡萄孢对这些常用的三唑类杀菌剂产生抗药性，可以用氯氟醚菌唑替代上述三唑类杀菌剂防治相应病害。本研究表明人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑尚未产生中、高水平的抗药性，但发现不同来源的人参灰葡萄孢菌株对氯氟醚菌唑的敏感性存在差异，这可能与不同地区的人参种植年限和灰霉病的发生历史、用药措施以及病菌本身的遗传差异及群体组成等因素有关。由于生产中连续大量使用同类杀菌剂或者其他有交互抗性的杀菌剂，会使病菌对杀菌剂的敏感性降低。因此，为了延缓人参灰葡萄孢对氯氟醚菌唑抗药性，建议要继续定期监测其抗药性情况，减少作用机制相同类型杀菌剂的使用频次，按照推荐最低有效剂量使用，并科学合理与其他药剂混用或831东北林业大学学报第 51 卷与负交互抗药性的杀菌剂轮换使用，延长其使用寿命。参考文献 1朱建兰番茄灰霉病菌的生物学特性研究J甘肃农业大学学报，1995，12(1):7378 2普继雄，周宗山，王娜，等弥勒市葡萄灰霉病菌对 4 种杀菌剂的抗药性检测 J 果树学报，2021，38(7):11471152 3郑肖兰，傅帅，郑服丛，等植物病原菌抗药性研究进展J 热带农业科学，2011，31(1):8690 4陈仁，陈群航，杜宜新，等福州地区灰霉病菌对腐霉利和嘧霉胺抗药性测定 J 福建农业学报，2015，30(2):180183 5肖婷，许媛，陈宏州，等江苏丘陵地区草莓灰霉病菌(Botrytiscinerea)对 QoIs 类杀菌剂的抗药性研究J果树学报，2017，34(5):603610 6宋晰，肖露，林东，等番茄灰霉病菌对腐霉利的抗药性检测及生物学性状研究 J农药学学报，2013，15(4):398404 7刘超，张悦丽，张博，等山东灰霉病菌对腐霉利的抗药性检测J 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