日粮添加尿素对育肥湖羊空肠...氨和尿素转运蛋白表达的影响_孙美杰.pdf

南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；中央高校基本科研业务费专项资金（）作者简介：孙美杰，硕士研究生。通信作者：申军士，副教授，研究方向为反刍动物营养与消化道微生物，：。孙美杰，郑文金，申军士，等 日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响 南京农业大学学报，（）：，（）：日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响孙美杰，郑文金，申军士，朱伟云（南京农业大学国家动物消化道营养国际联合研究中心 江苏省消化道营养与动物健康重点实验室动物科技学院消化道微生物研究室，江苏 南京）摘要：目目的的 本试验旨在探究日粮添加尿素对育肥湖羊空肠发酵、菌群结构以及氨和尿素转运蛋白表达的影响。方方法法 将 只 月龄育肥公湖羊（约）随机均分为 个处理组，在饲喂基础日粮的基础上分别添加 （组）、（组）、（组）尿素。试验预饲期 周，正试期 周。试验结束每组随机选取 只屠宰，采集空肠内容物，测定发酵参数和定量总菌，并利用 测序分析空肠细菌组成；采集空肠上皮组织样品检测氨转运蛋白（）、氨转运蛋白（）和尿素转运蛋白（）基因 表达。结结果果 与 组相比，和 组空肠氨态氮含量显著升高（）。与 组相比，组总挥发性脂肪酸和乙酸含量显著降低，组丁酸和异戊酸含量相较于 组显著升高（）。相较于 组，和 组的总菌数量显著升高（）。测序结果显示，添加尿素并未影响空肠 、和 指数（），分析结果显示各组间空肠细菌群落组成明显区分。添加尿素对湖羊空肠中细菌门水平相对丰度无显著影响，但细菌属水平相对丰度存在差异。各处理组主要优势菌属为 、和 ，其中 和 的相对丰度均在 组中最高。此外，组 和 的相对丰度相较于 组显著升高（）。与 和 组相比，组空肠上皮 基因 表达水平显著上调（）；基因和 基因表达水平随尿素添加水平的升高逐渐降低，但差异不显著（）。结结论论 日粮补充适宜尿素（）可提高空肠内氨态氮含量，促进氮利用细菌的生长定殖，改善菌群结构。此外，添加尿素会影响空肠上皮 基因的表达，但不影响 基因和 基因的表达。关键词：湖羊；尿素；菌群结构；氨转运蛋白；尿素转运蛋白中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：（），（），（）（），南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 （），（）（），（），（）（）（），（），（），（），（）（），：；尿素作为一种性价比高且氮含量（左右）丰富的非蛋白氮（），能够替代部分蛋白质饲料以降低饲养成本，因此被广泛应用于反刍动物饲粮中。前人在绵羊和山羊等的研究中发现，日粮补充尿素在很大程度上会影响瘤胃发酵参数、瘤胃微生物菌群组成和瘤胃上皮尿素转运蛋白的表达，但研究重点仅局限在瘤胃。尿素进入反刍动物瘤胃后首先被水解为氨，氨除了可提供瘤胃微生物合成微生物蛋白（）所需的氮源外，过量氨还会通过瘤胃壁随血液转运至肝脏，在肝脏中通过鸟氨酸循环合成内源性尿素，部分尿素会重新循环回胃肠道的各个部位，从而达到对尿素的回收再利用。在这一个过程中，尿素通过简单扩散进入胃肠道各部位的效率非常低，多数尿素返回胃肠道各部位主要依赖肠壁上皮的转运蛋白（如尿素转运蛋白）。通过尿素转运蛋白介导的尿素转运除了回到瘤胃外，还有一个重要部位就是小肠，而肝脏合成的尿素返回肠道的比例主要受日粮组成、粗蛋白或可发酵碳水化合物水平以及有机物消化率等因素的影响。等报道，给饲喂青贮牧草或黑麦干草的绵羊补饲尿素，分别有和 的尿素转移进入小肠。小肠除了可通过肠内细菌产生的脲酶直接分解尿素产生氨外，还可通过氨基酸的脱氨作用或谷氨酰胺酶途径产生氨，小肠内产生的氨可通过自由扩散或肠上皮的氨转运蛋白转运入血并经门静脉入肝，从小肠吸收的氨可占门静脉吸收氨总量的 ，这反映了瘤胃后消化道部分对氨吸收利用的潜力。因此，小肠对反刍动物尿素氮的循环再利用以及氮代谢发挥着重要作用。目前关于日粮尿素供应的研究热点主要集中在瘤胃，而在小肠上的相关报道较少。基于小肠在反刍动物氮代谢和尿素循环中的重要作用，本试验旨在探究日粮添加尿素对湖羊空肠发酵参数、微生物菌群结构以及肠上皮氨转运蛋白和尿素转运蛋白表达影响，研究结果可为深入了解尿素在反刍动物体内的代谢利用机制提供更多的理论依据。材料与方法 试验设计与饲养管理将 只体重相近（约 ）的健康公湖羊按照随机区组设计分为 个处理组，每组 栏，每栏 只。组在饲喂基础日粮的基础上分别添加 （组）、（组）和 （组）的尿素。各组日粮能量水平相近，满足 育肥肉羊的生长需求（肉羊饲养标准：），但各组的粗蛋白水平不同。具体日粮组成和营养水平见本实验室前期 等的饲养试验。每日：和：等量饲喂，自由采食和饮水。试验包括 周适应期和 周正式期。样品采集试验结束的最后 ，每组随机选择 栏，每栏选 只湖羊于晨饲后 屠宰。统一收集空肠中段内容物，充分混匀后分装到离心管内。玻璃片刮取空肠中段上皮黏膜样品并分装于冻存管内，所有样品保存 第 期孙美杰，等：日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响于 冰箱中用于后续指标的测定。空肠发酵参数测定采样过程中，立即用 计（，）测定空肠内容物 值。参照 等的比色法，以氯化铵为标准品测定氨态氮的浓度。参照秦为琳的方法测定挥发性脂肪酸（，）含量并进行适当改进。样品加入适量双蒸水充分混合离心后，取 上清液加入 偏磷酸巴豆酸混合溶液后于 保存过夜。次日解冻后 离心 ，取上清液经 针式滤器过滤后，使用全自动气相色谱仪（，）进行测定。具体参数：前进样口，柱温 ，前检测器 ，分流比，载气为氮气。空肠微生物菌群定量及高通量测序 的提取 取 空肠解冻内容物于 离心管中，加 稀释并混匀离心，取上清液参照 等的方法加入 十六烷基三甲基溴化铵（，）混匀后转移至锆珠管中，经、酶、提取液和冰乙醇依次处理，提取空肠细菌的，随后使用 分光光度计（）检测其浓度（），确保所有样品 值为，保存于 备用。总菌定量 参照申军士等的方法构建 反应体系，包括：模板、上游引物、下游引物和 双蒸水。使用 仪（，）对空肠内容物中的总菌进行荧光定量 分析。其中以总菌的 基因构建质粒并以此作为模板制作总菌的定量标准曲线。细菌 扩增与 测序 空肠细菌的高通量测序由上海凌恩生物科技有限公司完成。选取细菌 基因的 可变区域作为目的片段对空肠细菌 进行 扩增。在扩增过程中引入不同样本的接头（碱基序列）和测序引物（：和：）。反应条件：；，个循环；。扩增完成后使用 蓝色荧光定量系统进行定量检测，按照测序要求进行 测序。将从 平台测序完成的所有原始数据运用 软件进行片段拼接和质量过滤。过滤截去序列后端质量值低于 的碱基，过滤质控后 以下的序列，再根据双端序列间的重叠关系将成对序列拼接成一条序列，再使用 软件基于 算法识别并删除嵌合体，最终得到有效序列。以 的序列相似性将有效序列聚类成不同操作分类单元（），再将每个 的代表序列与 数据库进行比对、分类和注释。使用 软件对样品进行 多样性分析（包括 数、覆盖率、丰富度指数和多样性指数），再使用 语言基于 距离矩阵进行主坐标分析（）。空肠相关氨和尿素转运蛋白 表达的测定按照总 快速提取试剂盒（，）说明书提取空肠上皮的，检测其 浓度（）并保证 值为。将所有的 样品浓度稀释至 ，用反转录试剂盒（，）将其反转成，随后以合成的 为模板，参照 试剂盒（，）说明书进行。反应条件：；，个循环；，。其中，扩增的氨转运蛋白基因（、）和尿素转运蛋白基因（）引物由南京英骏生物科技有限公司合成。具体引物序列见表。采用 法计算各基因相对表达量。表 基因引物对序列 基因 引物对序列 （）产物长度 注：氨转运蛋白 基因 ；：氨转运蛋白 基因 ；：尿素转运蛋白 基因 ；：甘油醛磷酸脱氢酶基因 南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 数据分析将试验数据利用 软件进行分析，对空肠发酵参数和总菌定量数据进行单因素方差分析，对空肠细菌多样性指数和细菌门、属水平相对丰度进行非参数检验分析。采用 法进行多重比较，显著性水平定为。结果与分析 日粮添加尿素对育肥湖羊空肠发酵参数的影响由表 可知：与 组相比，和 组的空肠氨态氮含量显著升高（），而 值虽有所降低但差异不显著（）；与 组相比，组的总挥发性脂肪酸和乙酸含量显著降低；组丁酸和异戊酸含量相较于 组显著升高（）；空肠各组间丙酸、乙酸 丙酸、异丁酸和戊酸含量无显著差异（）。表 尿素添加对育肥湖羊空肠发酵参数的影响 项目处理 标准误 值 值 氨态氮含量（）总挥发性脂肪酸含量（）乙酸含量（）丙酸含量（）乙酸 丙酸 异丁酸含量（）丁酸含量（）异戊酸含量（）戊酸含量（）注：）、表示尿素添加量分别为、。，）：表示未检测到 ）同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（）。，（）。下同。日粮添加尿素对育肥湖羊空肠细菌多样性及组成的影响 日粮添加尿素对育肥湖羊空肠细菌菌群 和 多样性的影响 如表 所示：基因覆盖空肠 以上的细菌群落，说明测序结果能代表样本中微生物菌群的真实情况。多样性分析结果表明，各组间空肠细菌的 、和 指数均无显著差异（），说明添加尿素并未影响育肥湖羊空肠内细菌菌群的丰富度和多样性。分析结果显示：各组空肠细菌呈现区域性聚集，且组间明显区分开（：，；：，），说明不同尿素剂量处理组间的空肠细菌菌群组成存在差异（图）。表 尿素添加对育肥湖羊空肠细菌菌群 多样性的影响 项目处理 标准误 值 数 指数 指数 香农指数 辛普森指数 覆盖率 日粮添加尿素对育肥湖羊空肠细菌门、属水平相对丰度的影响 图 展示不同处理组空肠细菌在门、属水平上的相对丰度。由图 可知：在门水平上，空肠内主要菌门有厚壁菌门（）、放线菌门（）、变形菌门（）、髌骨菌门（）、软壁菌门（）和拟杆菌门（）。不同处理组最主要的菌门均为厚壁菌门（），其次是（），两者在不同组的比例之和均达到 以上。放线菌门的丰度随尿素添加量的增加有所降低，但差异不显 第 期孙美杰，等：日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响图 空肠内容物中细菌菌群的主坐标分析.著（）。由图 可知：在属水平上，湖羊空肠中相对丰度大于 的细菌属有 个。各处理组的主要优势菌属为毛 螺 菌 科 （，）、瘤胃球菌属（，）、醋香肠菌属（，）和未分类双歧杆菌科（，），其中毛螺菌科 和瘤胃球菌属 的相对丰度均在 组中最高。由图 属水平上差异变化的细菌可知，与 组相比，组瘤胃球菌属 群（）和欧陆森氏菌属（）的相对丰度显著升高（），而 组瘤胃球菌科 （）的相对丰度相较于 组显著降低（）。组瘤胃球菌科 群（）和 的相对丰度在 组中最高（），且霍氏真杆菌（）和缠结优杆菌（）在 组间存在差异显著的趋势（），其中以 组的相对丰度最高。添加尿素对属水平其他细菌的相对丰度影响不显著（）。图 添加尿素对育肥湖羊空肠细菌门水平（）组成和属水平（）相对丰度的影响（相对丰度）.（）（）（）：厚壁菌门；：未分类细菌；：放线菌门；：变形菌门；：髌骨菌门；：软壁菌门；：拟杆菌门；：毛螺菌科；：瘤胃球菌属；：醋香肠菌属；：未分类双歧杆菌科；：克里斯滕森菌科；：瘤胃球菌属 群；：双歧杆菌属；：霍氏真杆菌；：欧陆森氏菌属；：瘤胃球菌科 群；：候选单胞生糖菌属；：瘤胃球菌科；：缠结优杆菌；：其他。图 同此。日粮添加尿素对育肥湖羊空肠内总菌数量的影响 总菌定量分析结果表明，添加尿素处理的 和 组的总菌数量显著高于 组（），且 组总菌数量在所有处理组中最高（图）。日粮添加尿素对育肥湖羊空肠氨和尿素转运蛋白 表达的影响、基因和 基因 表达情况见图。与 和 组相比，组空肠上皮 的 表达水平显著增加（）。随着尿素添加水平的升高，和 表达水平逐渐下降，但差异不显著（）。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 在属水平上受尿素添加影响显著的细菌.不同字母表示不同处理间差异显著（）。（）图 尿素添加对育肥湖羊空肠总菌数量的影响.图 尿素添加对育肥湖羊空肠相关氨和尿素转运蛋白 表达的影响.讨论 日粮添加尿素对育肥湖羊空肠发酵参数的影响胃肠中氨、氮含量可以反映微生物对含氮物质的降解及宿主对其吸收利用情况。通常空肠中的氨主要有 个来源：一是肠腔内微生物对含氮化合物的降解，二是肠腔微生物对来自血液尿素氮的水解，其余则是通过瘤胃流入的氨。在本试验中，与 组相比，组和 组空肠氨态氮含量显著升高，且 组在所有组中最高。等和 等研究发现，瘤胃中氨态氮含量和血液中血氨和血尿素氮含量均随尿素添加量的升高而显著升高，因此，本试验中空肠氨态氮含量的升高可能是由瘤胃氨流入或血液中尿素氮通过肠壁进入空肠内水解所致。酸碱度是反映宿主内环境稳定状况的重要指标，本研究发现湖羊空肠 值并没有因尿素添加量的升高发生显著变化，说明空肠内环境保持在相对稳定状态。先前针对不同剂量尿素的研究证明，饲喂添加 尿素日粮的湖羊的干物质采食量（）和平均日增重 第 期孙美杰，等：日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响（）均较其他尿素处理组表现最好。我们推测可能是 组尿素在被瘤胃微生物利用合成 的过程中，其水解释放氨的量与瘤胃微生物合成 所需能量比例较适宜，能和氮的同步释放促使淀粉等可发酵碳水化合物降解产生的挥发性脂肪酸更多地被宿主机体或瘤胃微生物吸收利用，能量的利用效率升高，从而导致进入小肠的能量相对减少。因此，在本试验中，组总挥发性脂肪酸和乙酸含量相较于其他处理组显著降低，丁酸含量显著低于 组。此外，与 等在瘤胃上的结果类似，本研究也发现在空肠中 组异戊酸含量明显高于 和 组。异戊酸主要是从支链氨基酸（如缬氨酸和异亮氨酸）中衍生出来的，因此日粮添加尿素可能会影响空肠内支链氨基酸的代谢。以上结果表明，日粮添加不同水平的尿素，湖羊空肠内环境保持相对稳定，但会显著提高空肠氨态氮含量。日粮添加尿素对育肥湖羊空肠细菌多样性及组成的影响小肠是反刍动物消化吸收营养物质的主要场所之一，除各种消化酶作用之外，其内定殖的微生物菌群在促进营养物质消化吸收和合成代谢等方面同样发挥着重要作用。本研究发现，日粮添加不同水平的尿素对育肥湖羊空肠菌群的 多样性（、和 指数）无显著影响，表明日粮添加尿素并不影响空肠细菌的丰富度和多样性，空肠菌群维持在动态平衡状态。结果显示各组间空肠菌群组成明显区分开，说明不同尿素剂量处理组空肠细菌的群落组成存在较大差异。进一步对空肠内总菌进行定量后发现，相较于对照组，和 组的总菌数量显著升高，且 组在所有组中最高。总菌数量的增加可能意味着肝脏产生的内源性尿素氮更多返回到胃肠道内被重新利用，在提高氮利用率的同时促进了空肠内细菌的生长定殖，而且 组较 组表现出的效果更好。从本试验结果还发现，组育肥湖羊空肠内容物中最主要的优势菌门是，其次是。其中 的比例在所有组中均超，由此可见，在空肠中占有绝对优势。成员在碳水化合物代谢中起关键作用，可将不溶性纤维类物质（如葡聚糖、木聚糖和纤维素）降解为可溶性低聚糖。与 和 组相比，组育肥湖羊空肠内容物中 的相对丰度更 高，且 进 一 步 分 析 属 水 平 上 的 变 化，发 现 属 于 的 、和 等菌属的相对丰度均在 组表现最高。可以促进氮的吸收利用，有研究表明其在盲肠内的丰度与氮利用率呈正相关关系。由此可说明，低剂量尿素组相较于高剂量尿素组更有助于提高空肠菌群对碳水化合物和氮的代谢利用。是反刍动物肠道中常见的有益菌，本研究显示，的相对丰度在 组中提高，说明 组的尿素水平可能更有助于有益菌的生长增殖和维持肠道微生态稳定。在本试验中，和 的丰度随尿素添加量的增加呈逐渐升高的趋势。是常见的产丁酸细菌，其相对丰度与肠道中短链脂肪酸的水平直接相关；本试验中 组的丁酸含量在所有处理组中最高也可说明这一点。从本试验还发现，空肠中存在很大比例的未分类细菌（相对丰度），针对这部分细菌的具体组成与功能都还未知，对于其是否在反刍动物的尿素利用与氮代谢过程中扮演重要角色还有待进一步试验。以上结果表明，湖羊空肠内菌群对不同剂量尿素的响应程度存在差异，低剂量尿素可提高氮利用细菌和有益菌的生长增殖，在一定程度上有利于维持肠道健康，而高剂量尿素使这些菌群的丰度降低。日粮添加尿素对育肥湖羊空肠氨和尿素转运蛋白 表达的影响尿素转运蛋白（）在反刍动物胃肠道上皮细胞中主要承担着介导尿素跨膜扩散的生理功能，在促进机体对尿素氮的回收再利用和提供胃肠微生物生长所需的氮源等方面发挥关键作用。目前已克隆的尿素转运蛋白家族包括 和。主要分布在肾脏，而 已被发现在反刍动物（牛和羊）和单胃动物（猪）的整个胃肠道中均有表达。日粮氮水平的高低在很大程度上会影响反刍动物胃肠道上皮 的表达。等研究指出，奶牛瘤胃背囊乳头 基因的表达水平因日粮氮水平的不同而存在差异，其在高氮日粮中粗蛋白（）的表达水平显著高于低氮日粮（）。而 等发现，日粮氮水平的高低（和 ）并不影响牛瘤胃乳头中 基因的表达。等在羔羊试验中发现，饲喂低蛋白日粮组（）瘤胃上皮 基因表达水平显著高于饲喂高蛋白日粮组（）。杜建文等对山羊研究后发现，日粮高氮水平（）会促进前胃、回肠及盲肠中 基因的表达，但抑制十二指肠中 基因的表达。在本试验中，空肠上皮 基因 表达水平在数值上随尿素添加水平的升高逐渐下调。此结果与 等和 等在南 京 农 业 大 学 学 报第 卷瘤胃上皮的结果不完全一致，可能是由于日粮氮水平不同或研究部位不同所致。前人已证实氨态氮含量在很大程度上会影响尿素氮向胃肠道的转移。等分别在奶牛瘤胃和皱胃灌注尿素，结果均发现尿素灌喂会下调瘤胃上皮 基因 的表达，本试验结果与之一致。因此，推测本试验中 基因表达水平降低的原因可能是由于尿素添加造成空肠氨态氮含量升高，从而导致空肠上皮 基因 表达水平降低，但具体机制有待进一步的试验验证。氨转运蛋白家族成员 糖蛋白（）和 糖蛋白（）对介导反刍动物胃肠道中氨的转运和代谢至关重要。已有研究者发现 和 在动物胃肠道中表达，如 等使用实时 反应技术发现 和 在小鼠的胃、小肠（十二指肠、空肠、回肠）和结肠中均有表达，且在小肠绒毛上皮细胞中高表达。本研究同样也发现 和 在空肠上皮表达。小肠是氨吸收的主要场所之一，其可通过肠上皮的氨转运蛋白吸收氨经门脉转移入肝，从小肠吸收的氨可占门静脉吸收氨的 ，。因此，氨转运蛋白 和 的存在有助于小肠上皮对氨的转运和吸收。此外从本研究还发现，与对照组相比，组空肠上皮 表达水平显著上升而 组无显著变化，和 组 表达水平下降但均未产生显著影响。造成此结果的具体原因尚不明确，推测与 和 对日粮氮水平的应答存在差异有关。李树平等曾在大鼠肾脏的研究中发现，低蛋白日粮（）可明显增加 在大鼠肾脏皮质的表达，但未改变 在大鼠肾脏皮质的表达。因此，对于尿素添加引起氨转运蛋白 和 上调和下调的具体机制有待进一步探究。以上结果表明，日粮添加尿素会影响空肠上皮氨和尿素转运蛋白的表达，并且氨和尿素转运蛋白的表达水平对不同剂量的尿素添加存在差异，低剂量尿素会增加 在湖羊空肠上皮的表达，而高剂量尿素添加会在一定程度上降低湖羊空肠上皮、和 表达。综合本试验结果，日粮补充适宜尿素（）使空肠内总菌数量增加，改善菌群结构，在一定程度上有利于维持肠道健康，而高剂量尿素（）反而使空肠细菌数量降低。参考文献：，（）：，（）：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：第 期孙美杰，等：日粮添加尿素对育肥湖羊空肠菌群结构及氨和尿素转运蛋白表达的影响 ，（）：秦为琳 应用气相色谱测定瘤胃挥发性脂肪酸方法的研究改进 南京农学院学报，（）：，（）：（），（）：申军士，刘壮，陈亚迎，等 乳酸链球菌素对瘤胃体外发酵、甲烷生成及功能菌群数量的影响 微生物学报，（）：，（）：（），（）：，（）：，（）：，：，：，（）：，：，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：杜建文，孙海洲，赵存发，等 饲粮结构对山羊消化系统尿素转运蛋白 表达的影响 动物营养学报，（）：，（）：（），（）：，（）：王丽娟，张永根 不同产地羊草蛋白质和氨基酸瘤胃降解特性及小肠消化率评定研究 畜牧与兽医，（）：，（）：（）李树平，罗静 氨转运蛋白 和 在低蛋白饮食大鼠肾脏的表达 中国药物与临床，（）：，（）：（）责任编辑：周广礼