鼠作为猪繁殖与呼吸综合征病毒媒介动物的基本特性_吴晓傲.pdf

动物医学进展,2 0 2 3,4 4(2):1 5-2 3P r o g r e s s i nV e t e r i n a r yM e d i c i n e鼠作为猪繁殖与呼吸综合征病毒媒介动物的基本特性 收稿日期:2 0 2 2-0 1-0 7 基金项目:国家自然基金青年基金项目(3 1 5 0 2 0 7 0);辽宁省兴辽英才计划项目(X L Y C 2 0 0 5 0 2 0)作者简介:吴晓傲(1 9 9 7-),女(满族),辽宁铁岭人,硕士研究生,主要从事猪繁殖与呼吸综合征研究。*通讯作者吴晓傲1,刘婉葶1,单栢强1,冯寿华1,冯晓慧1,魏 澍2,吴洪涛2,张 飞1,沈国顺1,陈泽良1,刘金玲1*(1.沈阳农业大学畜牧兽医学院,辽宁沈阳1 1 0 8 6 6;2.辽宁省农业发展服务中心,辽宁沈阳1 1 0 1 6 4)摘 要:为了解家鼠在P R R S V传播中的特点和作用,进而初步评估环境生物传播P R R S V的潜在风险。捕捉猪场家鼠,收集鼠肠道粪便,提取R NA后采用R T-P C R技术扩增P R R S V的N S P2、O R F 5、N S P9、N S P1 0基因,然后与来源于同一猪场猪源P R R S V以及其他P R R S V代表株相应的基因进行生物学信息比较,并结合S w i s s-M o d e l和P r o t S c a l e等软件对其中主要差异基因编码蛋白的三维结构及理化特点做进一步分析。结果显示,鼠肠道粪便中的P R R S VN S P2、O R F 5、N S P9和N S P1 0基因与来源同一猪场感染猪样本中相应的P R R S V基因同属于美洲型毒株,且与高致病性P R R S VG D株亲缘关系最近,但鼠源和猪源P R R S V的N S P 2、O R F 5、N S P 9、N S P 1 0之间有多个氨基酸的替换和缺失。尤其是主要差异基因N S P1 0所编码的N S P 1 0蛋白,三维结构分析结果显示二者具有较高的相似性,主要由疏水性氨基酸组成,但它们的无规则卷曲区和腺苷三磷酸酶结构域的AT P结合位点在氨基酸组成存在差异。研究表明鼠肠道粪便中P R R S VN S P9、N S P1 0、N S P2和O R F 5基因和来源于同一猪场感染猪样本中的P R R S V,与其他P R R S V代表株之间存在不同程度的差异,这些差异是否会影响P R R S V生物学特性需要进一步验证。关键词:鼠;媒介动物;猪繁殖与呼吸综合征病毒;基因变异中图分类号:S 8 5 2.6 5 9.6文献标识码:A文章编号:1 0 0 7-5 0 3 8(2 0 2 3)0 2-0 0 1 5-0 9 猪繁殖与呼吸综合征病毒(P o r c i n er e p r o d u c-t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m ev i r u s,P R R S V)能够引起猪繁殖与呼吸综合征(P o r c i n e r e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m e,P R R S),是目前危害养猪业的主要病毒性传染病。感染猪耳部发绀呈紫色,又称“猪蓝耳病”,首次报道于2 0世纪8 0年代,可感染不同年龄段的猪群,以妊娠母猪和初生仔猪最易感1。P R R S V分为基因型和基因型2个基因型,欧洲L e l y s t a dv i r u s和美洲的V R 2 3 3 2分别是2个基因型的代表毒株。虽然2个基因型的基因组结构相似,但它们的核苷酸有着明显差异2。P R R S V的基因组片段大约1 5k b,5 端有帽子结构以及非编码区(UT R),3 端有p o l y(A)尾巴和UT R。从5 端到3 端有8个开放阅读框(O R F s),分别是编码非结构蛋 白 的O R F 1 a和O R F 1 b,编 码 结 构 蛋 白 的O R F 2-O R F 7。其中G P 2-G P 5编码4种囊膜蛋白,O R F 6编码非糖基化的M蛋白,O R F 7编码N蛋白。G P 5由O R F 5编码,是一种由2 0 0个氨基酸组成的高度糖基化蛋白,具有很强的免疫原性,能够诱导中和抗体的产生。G P 5与M蛋白形成异源二聚体,作用到唾液酸受体(S n),参与P R R S V对猪肺泡巨噬 细 胞 的 吸 附 与 入 侵3。因 此,G P 5常 作 为P R R S V新型疫苗的后选蛋白应用于P R R S V防控等研究中。N S P 2是P R R S V粒子中由O R F 1 a编码的最易变异的最大非结构蛋白,参与病毒的复制过程4。2 0 0 6年,几乎遍布全国各养猪场的“猪高热病”,就是P R R S V的N S P2基因有3 0个不连续氨基酸的缺失,演变成高致病性P R R S V,导致较高的生猪死 亡 率,给 养 猪 业 造 了 巨 大 的 经 济 损 失5。N S P 9和N S P 1 0是P R R S V粒子中由O R F 1 b自身酶分割多聚蛋白p p 1 a b后形成的非结构蛋白,N S P 9是P R R S V唯 一 的R NA依 赖 性R NA聚 合 酶(R d R p),P R R S V N S P 1 0含有NT P a s e/R NA解旋酶活性。研究发现,H P-P R R S VN S P 9和N S P 1 0与病毒的毒力相关,并且与病毒的复制具有十分紧密的联系,二者协同作用能够促进P R R S V的转录复制6-7。P R R S V可经口、空气、接触及流产母猪的子宫DOI:10.16437/ki.1007-5038.2023.02.017内容物等多种途径感染易感猪,在病猪的鼻腔、粪便和尿液 中 均 可 检 测 到 该 病 毒,因 此 有 效 的 切 断P R R S V的传播途径彻底根治P R R S面临的重要问题。为了降低P R R S V的传入风险,养殖企业采取严格的防控措施以增强猪场的生物安全性。然而,在全进全出的猪场中仍然经常发生P R R S V的感染,并且某些生物安全措施如在猪场的建筑物附近开口处放置防鸟网,并不能阻止小型啮齿类、昆虫等进入猪场。相关研究表明鼠、禽、蚊子和蝇能够携带P R R S V并能从其粪便中分离出P R R S V,使其成为P R R S V的新传播者或携带者8。因此,小型啮齿类、昆虫类等环境生物能否在猪群中传播P R R S V需要进一步的研究。为了初步评估环境中动物媒介传播P R R S V的潜在风险以及传播病原的分子生物学特点,本研究捕获猪场家鼠,收集小鼠粪便,提取R NA反转录后采用P C R方法,检测N S P 1 0、O R F 9、N S P 5和N S P 2等P R R S V目的基因,测序后采用生物信息学软件分析鼠源和来源于同一猪场感染猪P R R S VN S P 2、O R F 5、N S P 9和N S P 1 0基因的遗传特性,从易感和非易感动物角度深入了解P R R S V的传播特性,为P R R S V的综合防控提供理论依据。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 主要试剂及仪器设备 T r i z o l r e a g e n t试剂盒、2T a qP l u sM a s t e rM i x,诺唯赞工程(南京)有限公司产品;氯仿、无水乙醇,全式金(北京)生物有限公司产品;H a n k s溶液,普洛恩(天津)科技有限公司产品;D E P C处理水、琼脂糖,电泳液,北京索莱宝科技有限公司产品;D NA分子质量标准D L20 0 0、反转录试剂盒(R R 0 4 7 A),T a k a r a宝生物有限公司产品;P C R仪,赛默飞世尔科技公司产品;凝胶成像仪A P L E G E NC A 9 4 1 0 7,G e l公司产品;电泳仪,美国伯乐公司产品。1.1.2 样品 猪场猪源P R R S V阳性(R P V,C S F V和P C V阴性)病料、猪场家鼠肠道粪便,由沈阳农业大学畜牧兽医学院保存。1.2 方法1.2.1 引物设计与合成 N S P 9、N S P 1 0特异性引物参照文献9,用P r i m e r5.0软件参考N C B IG e n-B a n k登陆的P R R S V基因序列,设计N S P 2、O R F 5特异性引物、O R F 5、N S P 9、N S P 1 0的套式引物,并送往鸿讯生物(苏州)有限公司合成。1.2.2 猪场猪源和鼠源P R R S V R NA基因组的提取、反转录及目的基因扩增 将收集的家鼠肠道粪便样经H a n ks浸泡后取上清2 0 0L,小鼠的组织脏器和猪场猪源P R R S V阳性的猪淋巴组织各约0.5 2 8g和2.0 1 6g用液氮研磨成粉沫后分别置于1.5m L除酶离心管,按照T r i z o l r e a g e n t试剂盒说明书提取样品R NA并进行反转录。参考R 2 1 1-0 1/0 2反转录酶说明书将模板R NA反转录成c D NA后进行P R R S VN S P2、O R F 5、N S P9、N S P1 0基 因 的P C R扩增。再分别取第一次P C R产物1L为模板,采用二次P C R方法或套式P C R扩增P R R S VN S P2、O R F 5、N S P9和N S P1 0基因。取5L扩增产物,1 0g/L琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像系统检测P R R S V目的条带,对P R R S V的P C R阳性产物送上海生工生物工程有限公司测序。1.2.3 猪场猪源和鼠源P R R S V主要基因生物信息学分析 将 测 序 获 得 的 鼠 源、猪 场 猪 源P R R S VN S P2、O R F 5、N S P9和N S P1 0基因序列与G e n-B a n k中 登 录 的P R R S V毒 株 的 相 应 基 因,采 用ME GA5.0生物软件构建系统进化树,使用D NA S-T A R等生物软件分析氨基酸位点的变异情况。1.2.4 猪场猪源和鼠源P R R S V主要差异基因编码蛋白的三维结构及理化特点分析 结合1.2.3的分析结果对猪源和鼠源P R R S V变异较大的差异基因用I n t e r p r o(h t t p s:/www.e b i.a c.u k/i n t e r p r o/)进一步分析氨基酸序列,并提交序列至S w i s s-M o d e l服务器预测蛋白三级结构,以S w i s s-M o d e l从蛋白质数据库(www.r c s b.o r g)获取适宜的晶体结构作为模板,结合V i s u a lM o l e c u l a rD y n a m i c s 1.9.3软件展示和比较鼠源和猪源P R R S V主要差异蛋白的三维结构,通过计算蛋白结构域氨基酸组成的均方根偏差(R o o t-M e a n-S q u a r eD e v i a t i o n,RM S D)值评估结构的相似性,当2RM S D0,说明两个蛋白的结构相似。采用P r o t s c a l e(h t t p s:/w e b.e x p a s y.o r g/)软件评估鼠源和猪源P R R S V主要差异蛋白的疏水性、亲水性以及功能性氨基酸的特点。2 结果2.1 猪场猪源和鼠源P R R S V目的基因R T-P C R扩增结果 猪场猪源P R R S V阳性样本的N S P2、O R F 5、N S P9、N S P1 0基因的R T-P C R产物琼脂糖凝胶电泳结果显示,分别在2 5 0、3 8 5、2 0 2 5、1 4 0 4b p出现目的片段,与预期片段大小一致(图1)。鼠源肠道粪便以 及 粪 便 样 本P R R S VN S P2、O R F 5、N S P9、N S P1 0基因二次和套式P C R产物琼脂糖凝胶电泳结果显示分别在2 5 0、2 5 8、5 2 9、4 9 8b p出现目的片段,与预期片段大小一致(图2)。61动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)M.D NA标准D L20 0 0;A.12.猪源P R R S VN S P2和O R F5基因片段;3.空白对照;4.猪源P R R S VN S P1 0基因片段;5.空白对照。B.1.空白对照;23.猪源P R R S VN S P9基因片段M.D NA M a k e rD L20 0 0;A.1-2.N S P2a n dO R F5g e n e f r a g m e n t so fP R R S Vf r o mp i g;3.B l a n kc o n t r o l;4.N S P1 0g e n e f r a g m e n to fP R R S Vf r o mp i g;5.B l a n kc o n t r o l;B.1.B l a n kc o n t r o l;2-3.N S P9g e n e f r a g m e n to fP R R S Vf r o mp i g图1 猪源P R R S VN S P2、O R F5、N S P9、N S P1 0基因R T-P C R结果F i g.1 R T-P C Ri d e n t i f i c a t i o no fP R R S VN S P2,O R F5,N S P9,N S P1 0g e n e s f r o mp i gA.M.D NA标准D L20 0 0;1.鼠粪便源P R R S VN S P 2基因片段;2.鼠肠道粪便源P R R S V N S P 2基因片段;3.空白对照;B.M.D NA标准D L10 0 0;1.鼠粪便源P R R S VO R F 5基因片段;2.鼠肠道粪便源P R R S VO R F 5基因片段;3.空白对照;C.13.鼠粪便源P R R S V N S P 9基因片段;45.鼠肠道粪便源P R R S VN S P 9基因片段;6.空白对照;D.1.鼠源粪便P R R S VN S P 1 0基因片段;2.空白对照;34.正常鼠粪便A.M.D NA M a r k e rD L 20 0 0;1.N S P 2g e n e f r a g m e n t so fP R R S Vf r o m m o u s e f a c e s;2.G e n e f r a g m e n t so fP R R S VN S P 2f r o m m o u s e i n t e s t i n a lf a c e s;3.B l a n kc o n t r o l;B.1.G e n ef r a g m e n t so fP R R S V O R F 5f r o m m o u s ef a c e s;2.G e n ef r a g m e n t so fP R R S V O R F 5f r o m m o u s ei n t e s t i n a lf a c e s;3.B l a n kc o n t r o l;C.1-3.G e n e f r a g m e n t so fP R R S VN S P 9f r o m m o u s e f a c e s;4-5.G e n e f r a g m e n t so fP R R S VN S P 9f r o m m o u s e i n t e s t i n a lf a c e s;6.B l a n kc o n t r o l;D.1.G e n e f r a g m e n t so fP R R S VN S P 1 0f r o m m o u s e f a c e s;2.B l a n kc o n t r o l;3-4.N o r m a lm o u s e f e c e s图2 鼠粪便源P R R S VN S P 2、O R F 5、N S P 9、N S P 1 0基因套式R T-P C R结果F i g.2 N e s t-R T-P C Ri d e n t i f i c a t i o no fP R R S VN S P 2,O R F 5,N S P 9,N S P 1 0g e n e s f r o m m o u s e f a e c e s2.2 猪场猪源和鼠源P R R S V基因系统进化树分析结果 鼠源和猪场猪源P R R S V基因与G e n B a n k登陆的P R R S V代表株进行遗传进化树分析(图3),鼠源与猪源P R R S VN S P 2、O R F 5、N S P 9和N S P 1 0基因均为美洲基因型分支,与高致病性G D Z Q、F Z A 0 6等毒株属于同一分支群,亲缘关系较近。而E u r o-P R R S V和L e l y s t a dv i r u s成独立分支群为欧洲基因型分支。2.3 猪场猪源和鼠源P R R S V基因氨基酸序列位点比较结果 鼠源、猪源以及其他P R R S V代表株基因编码的氨基酸序列比对结果显示,与其他P R R S V代表株相比,鼠源P R R S V N S P 2基因第4 8 6位发生4 8 6L e u I L e替换,第4 8 7位氨基酸缺失,猪源P R R S VN S P 2基因与其他P R R S V代表株相比第4 8 6、4 8 7位氨基酸缺失(图3 A);鼠源P R R S V O R F 5基因第3 6位氨基酸缺失,第2 7-2 8、3 0-3 5、1 0 1位发生2 7V a lA l a、2 8L e uA l a、3 0A s nT h r、3 1A l aP r o、3 2S e r I l e、3 3A s n A l a、3 4A s n P h e、3 5A s n P h e、1 0 1T y rP h e替 换;猪 源P R R S V O R F 5基 因 与F Z 0 6、J X A 1、G D、HUN 4、J XWn 0 6株氨基酸序列一致,无缺失替换(图3 B);鼠源P R R S V N S P 9基因与猪源以及其他P R R S V代表株N S P 9相比第1 5 1位氨基酸缺失;1 4 4-1 4 6位氨基酸发生1 4 4L e uL y s、1 4 5H i sL e u和1 4 6C y s T y r的替换(图4 C);鼠源P R R S V71吴晓傲等:鼠作为猪繁殖与呼吸综合征病毒媒介动物的基本特性N S P 1 0基因第1 2 0位氨基酸缺失,第1 1 5-1 1 7、1 2 3、1 3 1、1 3 3位发生1 1 5G l nL e u、1 1 6T r pP r o、1 1 7T h r A s p、1 2 3T h r S e r、1 3 1G l uG l y、1 3 3A s nA s p替换,第2 6 9位有一个P r o氨基酸的插入;猪源P R R S VN S P 1 0基因与其他P R R S V代表株相比第2 0 4、2 1 6位发生2 0 4A r g H i s、2 1 6T r p A r g替换(图4 D)。2.4 猪场猪源和鼠源P R R S VN S P 1 0蛋白3 D结构组成及无规则卷曲环差异分析 结合氨基酸分析的结果,选择变异差异比较大的P R R S V N S P 1 0利用SW I S S-MO D E L模拟构建猪源和鼠源P R R S VN S P 1 0蛋白的3 D结构进行差异分析。结果显示猪场猪源和鼠源P R R S V N S P 1 0蛋白均包含4个折叠片和5个螺旋(图5),经VMD 1.9.3计算2个P R R S V N S P 1 0蛋白整体碳骨架的RM S D值是1.6 72,提示氨基酸变异位点使二者在该结构区域存在较大的差异,图5 A)。AD.鼠源和猪场猪源P R R S VN S P 2、O R F 5、N S P 9和N S P 1 0基因与其他P R R S V代表株进化树分析A-D.E v o l u t i o n a r yt r e e a n a l y s i s o f P R R S Vg e n e s o fN S P 2,O R F 5,N S P 9a n dN S P 1 0 f r o mm o u s e,p i g i np i g f a r ma n d t h e o t h e rP R R S Vr e p r e s e n t-a t i v es t r a i n s图3 鼠源和猪场猪源P R R S V基因与其他P R R S V代表株遗传进化树分析F i g.3 E v o l u t i o n a r yt r e ea n a l y s i so fP R R S Vg e n e s f r o m m o u s e,p i g i np i gf a r ma n dt h eo t h e rP R R S Vr e p r e s e n t a t i v es t r a i n s2.5 猪场猪源和鼠源P R R S VN S P 1 0蛋白3 D结构域特点比较 I n t e r p r o对N S P 1 0序列进一步分析的结果显示猪场猪源和鼠源的P R R S VN S P 1 0蛋白由腺苷三磷酸酶和解旋酶2个结构域以及2个非酶结构域组成(图6),非酶结构域通常具有调节H e l i的功能。猪场猪源和鼠源P R R S V N S P 1 0蛋白的G l n 2 5 2、P r o 1 5 1、G l y 1 5 2、A l a 1 5 3、G l y 1 5 4、L y s 1 5 5、T h r 1 5 6、H i s 1 5 7分别构成了相应蛋白的AT P结合位点,其中两者间1 5 1-1 5 7位氨基酸的RM S D值为0.0 9 42,位点2 2 5-2 2 9氨基酸组成D E A D样H e l i x超级R NA解旋酶结构域,其两者间RM S D值是0.4 92,表明该部分结构域具有相似的拓扑结构,有着较高的相似度(图6 B,6 C)。但是二者间的G l n 2 5 2骨架原子C 的原子距离是0.6 6 4n m,表明猪源和鼠源P R R S VN S P 1 0蛋白的G l n 2 5 2存在较大的位置差异(图6 A)。81动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)A.P R R S VN S P 2基因氨基酸序列比对结果;B.P R R S VO R F 5基因氨基酸序列比对结果;C.P R R S VN S P 9基因氨基酸序列比对结果;D.P R R S VN S P 1 0基因氨基酸序列比对结果A.Am i n oa c i ds e q u e n c ea l i g n m e n to fP R R S VN S P 2g e n e;B.Am i n oa c i ds e q u e n c ea l i g n m e n to fP R R S VO R F 5g e n e;C.Am i n oa c i ds e q u e n c ea-l i g n m e n to fP R R S VN S P 9g e n e;D.Am i n oa c i ds e q u e n c ea l i g n m e n to fP R R S VN S P 1 0g e n e图4 鼠源、猪场猪源以及其他P R R S V代表株N S P 2、O R F 5、N S P 9、N S P 1 0基因氨基酸差异位点分析F i g.4 D i f f e r e n t s i t ea n a l y s i so f a m i n oa c i d s f o rN S P 2,O R F 5,N S P 9a n dN S P 1 0g e n e so fP R R S Vo r i g i nf r o m m o u s e,p i g i np i gf a r ma n dr e p r e s e n t a t i v es t r a i n s2.6 猪场猪源和鼠源P R R S V N S P 1 0蛋白亲疏水性特点 猪场猪源和鼠源P R R S VN S P 1 0蛋白总平均亲水性系数分别为0.0 4 7和0.0 4 3,属于疏水蛋白,表明二者具有相同的亲疏水性组成(图7)。91吴晓傲等:鼠作为猪繁殖与呼吸综合征病毒媒介动物的基本特性A.鼠源和猪源P R R S VN S P 1 0蛋白无规则卷曲;B-C.鼠源和猪源P R R S VN S P 1 0蛋白螺旋和折叠片A.L o o p so fP R R S VN S P 1 0p r o t e i nf r o m m o u s ea n dp i g;B-C.-h e l i xa n d-f o l d e ds h e e to fP R R S VN S P 1 0p r o t e i nf r o m m o u s ea n dp i g图5 鼠源、猪源P R R S VN S P 1 0蛋白3 D结构图F i g.5 3 Ds t r u c t u r eo fP R R S VN S P 1 0p r o t e i nf r o m m o u s ea n dp i gA-B.鼠源和猪源P R R S VN S P 1 0A T P结合位点;C.鼠源和猪源P R R S VN S P 1 0蛋白解旋酶蛋白结构A-B.A T Pb i n d i n gs i t e so fP R R S VN S P 1 0p r o t e i nf r o m m o u s ea n dp i g;C.D E A Db o xh e l i xo fP R R S VN S P 1 0p r o t e i nf r o m m o u s ea n dp i g图6 鼠源、猪源P R R S VN S P 1 0蛋白预测结构图F i g.6 P r e d i c t i o ns t r u c t u r eo fP R R S VN S P 1 0p r o t e i nf r o m m o u s ea n dp i g3 讨论P R R S V具有高变异、多样性的特点。变异产生的P R R S V变异株会改变病毒的生物学特性,也极易造成P R R S的大面积暴发。2 0 0 6年4月我国各地养猪场广泛出现的高致病性猪蓝耳病变异毒株、2 0 1 0年白俄罗斯出现的“丽娜”基因型新型变异P R R S V毒 株,均 导 致 了4 0%的 仔 猪 发 热 死亡1 0-1 1。此外,在P R R S V传播途径的相关研究中表明,P R R S V的自然感染宿主猪、带毒猪、公猪精液和污染器具均可传播P R R S V。并且,三带喙库蚊也可传播或携带P R R S V,其他在动物体内还发现了P R R S V1 2。本研究以此为切入点,针对来源于猪场家鼠和同一猪场感染猪的P R R S V基因开展遗传特征分析,初步探讨小型啮齿类媒介动物在P R R S V传播中的特点和作用,为初步评价环境中动物性生物媒介机械传播P R R S V的潜在风险提供依据,这对提高动物健康水平具有重要的现实意义。02动物医学进展 2 0 2 3年 第4 4卷 第2期(总第3 5 6期)AB.鼠源P R R S VN S P 1 0蛋白亲疏水性;CD.猪源P R R S VN S P 1 0蛋白亲疏水性A-B.H y d r o p h o b i c i t yo fP R R S VN S P 1 0p r o t e i nf r o m m o u s e;C-D.H y d r o p h o b i c i t yo fP R R S VN S P 1 0p r o t e i nf r o mp i g图7 鼠源、猪源P R R S VN S P 1 0蛋白亲疏水性F i g.7 H y d r o p h i l i c i t yo fP R R S VN S P 1 0p r o t e i n s f r o m m o u s ea n dp i g 从P R R S V的起源分析,感染鼠类的小鼠乳酸脱氢酶病毒(L l a c t i cd e h y d r o g e n a s ev i r u s,L D V)突变后成为L D V变异体,感染野猪后成为P R R S V的前 体,经 过 若 干 年 的 进 化 成 为 能 够 感 染 猪 的P R R S V,因此P R R S V有可能在鼠类体内复制1 3。基于此点推测,不同物种P R R S V细胞特异性受体的情况,表明不同物种的唾液酸受体(S n)和C D 1 6 3受体没有严格的宿主特异性,而且猪S n与人和鼠S n的同源性分别为7 8%和6 9%,说明鼠S n和人S n具备结合P R R S V的能力,进一步证实了不同物种S n具有介导P R R S V进入细胞的可能性1 4。结合上述研究,本试验捕捉了猪场家鼠,在其肠道粪便中检测到了P R R S V的基因。测序分析结果显示,从进化树的关系来看来源于家鼠的P R R S V与来源于猪的P R R S V同属美洲群分支,且与高致病 性P R R S V毒 株 同 源 关 系 最 近。但 来 源 于 家 鼠 的P R R S VN S P 2、O R F 5、N S P 9、N S P 1 0基因与来源于同一猪场感染猪的P R R S V以及其他P R R S V代表株氨基酸之间存在不同程度的变异,有多个氨基酸位点的替换和缺失。初步认为P R R S V虽然与鼠乳酸脱氢酶病毒(L D V)具有较近的遗传关系,但在长期进化的过程中鼠并没有成为P R R S V的感染宿主,所以P R R S V在家鼠非易感宿主体内复制过程中产生了不同程度的变异,当然也不能排除P C R扩增过 程 中 的 错 配 现 象。另 外,本 研 究 对 猪 场P R R S V阳性的猪淋巴组织采用R T-P C R方法分别扩增出了P R R S V的N S P2、O R F5、N S P9、N S P1 0基因,然而却采用套式P C R从鼠肠道粪便中检测到了P R R S VN S P2、O R F5、N S P9、N S P1 0基 因。套式P C R本身是一种特异性高、灵敏性好的检测方法,检测病毒量可达到n g,比常规P C R灵敏度高1 0 0倍1 5。综上一步说明,虽然鼠S n和猪S n具有较高的同源性,但家鼠不是P R R S V的生物宿主,P R R S V在非猪宿主体内增殖复制力有限,导致病毒载量不高。蛋白质三级结构是在二级结构的基础上按照一定的空间结构进一步盘绕折叠形成的特征三维结构。本研究对来源于家鼠和同一猪场感染猪样本中P R R S V两者之间变异较多的N S P 1 0基因所编码蛋白的理化特性和三维结构进一步分析,结果显示来源于家鼠和猪的P R R S V N S P 1 03 D结构的结构域在组成上具有非常高的相似性。但位于L o o p环的1 1 5-1 3 3位氨基酸的RM S D值是3.3 2,由此说明猪源和鼠源P R R S VN S P 1 0蛋白的L o o p区存在较大的结 构 组 成 差 异,并 且 两 者AT P结 合 位 点 的G l n 2 5 2氨基酸的骨架原子C 的原子距离是6.6 4,表明来源于家鼠和猪的P R R S V N S P 1 0蛋白AT P区的G l n 2 5 2间也存在较大的空间位置差异。L o o p12吴晓傲等:鼠作为猪繁殖与呼吸综合征病毒媒介动物的基本特性环突变是某些疾病早期诊断的重要指标,而G l n 2 5 2是组成AT P结合位点的主要氨基酸1 6,这些差异是否会影响G l n 2 5 2参与AT P的合成以及P R R S V生物学特性仍需要进一步研究。任何生命都编码解旋酶,而编码解旋酶的基因具有相同起源。解旋酶与许多生物代谢过程有关,细胞可通过调控解旋酶来复制遗传物质,如病原体在细胞核中的复制等。P R R S V的N S P 1 0具有解旋酶的特点。鼠、猪的生物内环境对解旋酶是否具有不同的调控特点,是否可能影响P R R S V的复制,这些具体调控机制还需要后续进一步深入研究。此外,相关研究表明,H P-P R R S V的致病性和毒力与N S P 9、N S P 1 0具 有 相 关 性1 7-1 8。而 在 本 研 究 中P R R S V基因序列中N S P 9、N S P 1 0的氨基酸存在不同程度的突变,这些突变是否会影响N S P 9、N S P 1 0毒力还不清楚,因为我们未曾从家鼠肠道粪便中分离出P R R S V验证P R R S V致病性的特点,但本研究结果是对媒介动物携带的P R R S V相关生物学特性研究的进一步补充。此外,课题组对多种媒介动物源P R R S V基因的分析结果发现,来源于其他物种的P R R S V基因的突变主要集中于结构域的功能位点(数 据 整 理 中,未 发 表)。家 鼠 虽 然 不 是P R R S V的 天 然 感 染 宿 主,但 家 鼠 能 够 携 带P R R S V,P R R S V在家鼠体内产生的基因、氨基酸的突变、缺失是否会使P R R S V的生物学特性发生改变,并且这种P R R S V基因在自然环境、媒介动物体内的变异一旦整合鼠类等小型啮齿动物携带并传播病原的特性,是否会给公共卫生安全带来潜在危害,是值得进一步思考的问题。参考文献:1 庞 恒.P R R S V再感染诱导猪I L-4体外细胞共培养表达系统及小鼠模型构建D.山东泰安:山东农业大学,2 0 2 1.2 MA H,L IX,L IJ,e ta l.I mm u n i z a t i o nw i t har e c o m b i n a n t f u-s i o no fp o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m ev i r u sm o d i f i e dG P 5a n d f e r r i t i ne l i c i t se n h a n c e dp r o t e c t i v e i mm u n i t yi np i g sJ.V i r o l o g y,2 0 2 1,5 5 2:1 1 2-1 2 0.3 ME LME RDJ,O S U L L I VAN TL,G R E E R A,e ta l.T h e i m-p a c to fp o r c i n er e p r o d u c t i v ea n dr e s p i r a t o r ys y n d r o m ev i r u s(P R R S V)g e n o t y p e s,e s t a b l i s h e do nt h eb a s i so fO R F-5n u c l e-o t i d e s e q u e n c e s,o n t h r e ep r o d u c t i o np a r a m e t e r s i nO n t a r i o s o wf a r m sJ.P r e vV e tM e d,