非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范.docx

附件非洲猪瘟病毒流行株与基因缺失株鉴别检测规范 本规范适用于非洲猪瘟病毒流行毒株与非洲猪瘟病毒CD2v和MGF 360-505R基因缺失株的荧光PCR方法鉴别检测。1. 主要试剂1.1 核酸提取试剂盒。1.2 无核酸酶水。1.3 荧光PCR预混液（2）。1.4 引物和探针：P72、CD2v、MGF360-505R基因扩增引物和探针由国家非洲猪瘟参考实验室设计并提供（联系人：李林，电话：[phone]）。 1.5 阳性和阴性对照：阳性对照样品为ASFV基因组DNA标准物质（用无核酸酶水稀释1000倍后使用），由国家非洲猪瘟参考实验室提供；阴性对照样品为无核酸酶水。2. 主要仪器设备2.1 荧光PCR扩增仪。2.2 台式低温高速离心机。2.3 组织匀浆机。2.4 微量可调移液器（2.5 L、10 L、100 L、200 L、1000 L等不同规格）。2.5 无核酸酶离心管与吸头。2.6 PCR扩增管。3. 样品采集和运输保存 对活猪，可采集抗凝全血（EDTA抗凝）、口鼻拭子或血清等；对病死猪或已屠宰猪，可采集脾脏、淋巴结、扁桃体、肝脏等组织。尽快送至实验室进行病毒核酸检测。 样品的运送与保存应满足NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范相关要求。上述样品可在4C最长保存2天；如需长时间保存，应置于-20C以下。4. 样品处理4.1 组织样品 取0.1 g0.2 g样品，加入1 mL2 mL预冷的PBS（pH 7.4），用组织匀浆机高速匀浆，制成10%组织匀浆液，以5000 r/min离心10 min，取200 L上清液进行核酸提取。4.2 液体样品抗凝全血、血清等液体样品不需进行特殊处理，直接取200 L进行核酸提取。5. 病毒核酸的提取和纯化 取已进行前处理的样品200 L，可按传统方法提取病毒核酸，也可采用病毒核酸提取试剂盒、自动化核酸提取仪提取病毒核酸。提取后的病毒核酸应立即使用或置于-20C以下冷冻保存。每次抽提核酸，应包括一个阳性对照样品和一个阴性对照样品。6. 荧光PCR检测6.1 荧光PCR反应液制备 在灭菌的离心管中制备符合检测样品数量（包括阳性、阴性对照）要求的荧光PCR反应混合液，至少额外制备两个样品的量。每个样品配制20 L PCR反应混合液，组成如下：7.5 mL P72、CD2v、MGF360-505R基因引物、探针预混液（P72、CD2v、MGF360-505R基因探针分别用FAM、VIC和Cy5进行标记）、12.5 mL 2探针法荧光PCR预混液。 分别取20 L PCR反应混合液加至每个PCR扩增管中；再分别取5 L DNA模板加入到PCR扩增管中。每次进行荧光PCR扩增时均应设立阳性、阴性对照。阳性对照应用阳性对照样品所提取核酸作为模板，阴性对照应用阴性对照样品所提取核酸作为模板。加入模板后，密封PCR扩增管，瞬时离心。将所有PCR扩增管放在荧光PCR仪中。按下述条件运行扩增程序。6.2 荧光PCR扩增条件 50C孵育2min；95C预变性5min；95C变性15s，60C退火延伸1min，45个循环，在每一循环的60C时收集FAM、VIC和Cy5通道中的荧光信号。6.3 结果分析 Ct值由荧光PCR仪的软件自动确定。6.3.1 试验成立条件 阳性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因的Ct值均35且出现特异性扩增曲线，阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因无Ct值或阴性对照P72、CD2v、MGF 360-505R基因Ct值40且无特异性扩增曲线，判为试验有效。试验无效时应重新进行试验。6.3.2 P72、CD2v、MGF 360-505R基因检测结果判定6.3.2.1 P72基因检测结果判定（FAM通道） 被检样品Ct值38且出现特异性扩增曲线，判为ASFV P72基因检测阳性；无Ct值或Ct值40，判为ASFV P72基因检测阴性；38Ct值40且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，再进行1次复检，做3个重复；至少2个重复Ct值40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV P72基因检测阳性，否则判为ASFV P72基因检测阴性。6.3.2.2 CD2v基因检测结果判定（VIC通道） 被检样品Ct值38且出现特异性扩增曲线，判为ASFV CD2v基因检测阳性；无Ct值或Ct值40，判为ASFV CD2v基因检测阴性；38Ct值40且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，再进行1次复检，做3个重复；至少2个重复Ct值40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV CD2v基因检测阳性，否则判为ASFV CD2v基因检测阴性。6.3.2.3 MGF 360-505R基因检测结果判定（Cy5通道） 被检样品Ct值38且出现特异性扩增曲线，判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性；无Ct值或Ct值40，判为ASFV MGF 360-505R基因检测阴性；当38Ct值40且出现特异性扩增曲线，判为疑似。对疑似样品，再进行1次复检，做3个重复；至少2个重复Ct值40且出现特异性扩增曲线即判为ASFV MGF 360-505R基因检测阳性，否则判为ASFV MGF 360-505R基因检测阴性。6.3.3 综合判定结合P72、CD2v、MGF 360-505R等3个基因的检测结果进行综合判定。具体判定标准见附表。附表 综合判定标准综合判定结果检测结果P72-FAMCD2v-VICMGF-Cy5ASFV流行株阳性+ASFV CD2v基因缺失株阳性+-+ASFV MGF基因缺失株阳性+-ASFV CD2v与MGF基因双缺失株阳性+-ASFV阴性-注：“+”代表检测阳性；“-”代表检测阴性