睡眠剥夺对小鼠大肠组织炎症反应和氧化应激的影响_王鑫梅.pdf

实验研究睡眠剥夺对小鼠大肠组织炎症反应和氧化应激的影响王鑫梅梁樱杨帅许可刘琪张津玮薄靳华DOI:1012089/jca202301014基金项目:国家自然科学基金(81600958，81701102);南京大学医学院附属鼓楼医院临床试验基金(2022-LCYJ-PY-37)作者单位:210008中国药科大学南京鼓楼医院药学部(王鑫梅);南京大学医学院附属鼓楼医院麻醉科(梁樱、杨帅、许可、刘琪、张津玮、薄靳华)通信作者:薄靳华，Email:bojinhua8888 126com【摘要】目的探讨睡眠剥夺对小鼠大肠组织炎症反应和氧化应激的影响。方法选择 SPF级雄性 C57 小鼠 32 只，812 周龄，体重 1822 g。采用随机数字表法分为四组:空白对照组(C 组)、切口组(I 组)、睡眠剥夺组(A 组)和睡眠剥夺+切口组(AI 组)，每组 8 只。C 组正常饲养，I 组建立切口模型，A 组使用睡眠剥夺箱睡眠剥夺 48 h，AI 组使用睡眠剥夺箱睡眠剥夺 48 h 后建立切口模型。取小鼠大肠组织，采用 Western blot 法检测白细胞介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-(TNF-)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 2(NOX2)和超氧化物歧化酶 2(SOD2)蛋白含量，超氧化物阴离子荧光探针法检测活性氧(OS)荧光强度，免疫荧光染色法检测 NOX2 荧光强度。结果与 C组比较，I 组、A 组和 AI 组大肠组织 IL-1、TNF-和 NOX2 蛋白含量明显升高(P0.05)，SOD2 蛋白含量明显降低(P0.05)，OS 和 NOX2 荧光强度明显增强(P0.05)。与 I 组比较，A 组和 AI 组大肠组织 IL-1、TNF-和 NOX2 蛋白含量明显升高(P0.05)，AI 组大肠组织 SOD2 蛋白含量明显降低(P0.05)，OS 和 NOX2 荧光强度明显增强(P0.05)。与 A 组比较，AI 组大肠组织 IL-1、TNF-和 NOX2 蛋白含量明显升高(P0.05)，SOD2 蛋白含量明显降低(P0.05)，OS 和 NOX2 荧光强度明显增强(P0.05)。结论睡眠剥夺会引起小鼠大肠组织炎症反应和氧化应激，睡眠剥夺下行切口手术会进一步加重炎症反应与氧化应激。【关键词】睡眠剥夺;炎症反应;氧化应激;活性氧;小鼠Effects of sleep deprivation on intestinal inflammatory response and oxidative stress in miceWANGXinmei，LIANG Ying，YANG Shuai，XU Ke，LIU Qi，ZHANG Jinwei，BO Jinhua Department of Phar-macy，China Pharmaceutical University Nanjing Drum Tower Hospital，Nanjing 210008，ChinaCorresponding author:BO Jinhua，Email:bojinhua8888 126com【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of sleep deprivation on intestinal oxidative stressand inflammatory response in mice MethodsThirty-two SPF male C57 mice，aged 812 weeks，weighing1822 g，were divided into four groups using random number table method:blank control group(groupC)，incision group(group I)，sleep deprivation group(group A)，and sleep deprivation+incision group(group AI)，eight mice in each group Group C were kept normally，group I were established into incisionmodel，group A were established into sleep deprivation model by depriving for 48 hours in a sleep depriva-tion chamber，and group AI were established into incision and sleep deprived models The expression of in-terleukin-1(IL-1)，tumor necrosis factor-(TNF-)，nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxi-dase 2(NOX2)and superoxide dismutase 2(SOD2)protein were detected by Western blot The fluores-cence intensity of reactive oxygen species(OS)was detected bydihydroethidium and NOX2 fluorescenceintensity was detected by immunofluorescence esultsCompared with group C，the expression of IL-1，TNF-and NOX2 protein were significantly increased(P 0.05)，the expression of SOD2 protein was sig-nificantly decreased(P 0.05)，and OS and NOX2 fluorescence intensity were significantly enhanced(P 0.05)in colonic tissues in groups I，A and AI Compared with group I，the expression of IL-1，TNF-and NOX2 protein of colonic tissues in groups A and AI were significantly increased(P 0.05)，the expression of SOD2 protein in group AI was significantly decreased(P 0.05)，and the fluorescenceintensity of OS and NOX2 in group AI were significantly enhanced(P 0.05)Compared with group A，the expression of IL-1，TNF-and NOX2 protein were significantly increased(P 0.05)，the expression27临床麻醉学杂志 2023 年 1 月第 39 卷第 1 期J Clin Anesthesiol，January 2023，Vol39，No1of SOD2 protein was significantly decreased(P 0.05)，and OS and NOX2 fluorescence intensity weresignificantly enhanced(P 0.05)in colonic tissues in group AI ConclusionSleep deprivation can causeintestinal inflammatory response and oxidative stress in mice，and the inflammatory response and oxidativestress will be further aggravated by sleep deprivation and surgery【Key words】Sleep deprivation;Inflammatory response;Oxidative stress;eactive oxygen spec-ies;Mice术前睡眠剥夺在手术患者中尤为常见，约70%以上的手术患者均存在一定程度的睡眠剥夺12。睡眠剥夺的发生原因包括术前或术后的焦虑状态、恶心、呕吐、疼痛等。睡眠剥夺会导致低度炎症反应和氧化应激，不利于患者术后恢复。OS 与睡眠剥夺密切相关，睡眠剥夺会导致肠道内的 OS 大量积累，从而导致机体产生氧化应激反应34。本实验研究拟通过构建不同模型小鼠，观察睡眠剥夺后小鼠大肠组织中炎性因子及氧化应激蛋白的表达变化，从分子水平探讨其在睡眠剥夺中的作用。材料与方法实验动物SPF 级雄性 C57 小鼠 32 只，812周龄，体重 1822 g，北京维通利华实验动物中心提供(SYXK 苏 20190059)。饲养条件:室温 18 22，12 h/12 h 昼夜节律，自由饮食水。实验分组与处理采用随机数字表法分为四组:空白对照组(C 组)、切口组(I 组)、睡眠剥夺组(A 组)和睡眠剥夺+切口组(AI 组)。C 组正常饲养，I 组建立切口模型，A 组使用睡眠剥夺箱睡眠剥夺 48 h，AI 组使用睡眠剥夺箱睡眠剥夺 48 h 后建立切口模型。建立切口模型小鼠吸入 2%七氟醚麻醉后，三头肌肌注青霉素 30 000 IU 建立切口模型。后爪趾肌外使用 10%碘伏消毒，铺无菌洞单。11 号刀片在后爪趾肌位置切开皮肤和筋膜后，纵行切开一个1 cm 的切口，从离脚后跟 0.5 cm 处一直延伸到脚趾。轻压迫止血后，用 FS-2 针 50 尼龙丝线行褥式缝合，切口用金霉素软膏覆盖5，产生切口即为建模成功。16 只小鼠均建模成功。建立睡眠剥夺模型参照文献 6描述的方法，使用睡眠剥夺箱(X-XS108 型)建立睡眠剥夺模型，将小鼠放入睡眠剥夺箱，箱内放置一根旋转杆，并保持恒定运动(7 圈/分，顺时针和逆时针交替旋转)进行睡眠剥夺，睡眠剥夺 48 h，期间小鼠自由饮食水。使用脑电睡眠电极进行监测，监测清醒时间、快速动眼睡眠时间、非快速动眼睡眠时间。非睡眠剥夺小鼠清醒时间占整体时间 50%，快速动眼睡眠时间占整体时间 42%，非快速动眼睡眠时间占整体时间 8%;睡眠剥夺小鼠清醒时间占整体时间73%，快速动眼睡眠时间占整体时间 25%，非快速动眼睡眠时间占整体时间 2%，睡眠时间较非睡眠剥夺小鼠缩短，清醒时间延长，提示建模成功。16 只小鼠均建模成功。Western blot 法取大肠组织(回盲部)加入胰酶消化并提取总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，煮沸 5min。上样 80 g 至 8%SDS-PAGE 进行电泳后，将蛋白质电转到 PVDF 膜。5%脱脂奶粉室温封闭 2h，加入一抗白细胞介素-1(interleukin-1，IL-1)(货号:ab254360，11 000)、肿瘤坏死因子-(tumornecrosis factor-，TNF-)(货 号:ab215188，1 1 000)、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶 2(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases2，NOX2)(货号:ab129068，11 000)、超氧化物歧化酶 2(superoxidedismutase 2，SOD2)(货 号:ab68155，11 000)和-actin 抗体(货号:ab6276，15 000)，4 孵育过夜，TBST 漂洗 3 次，每次 5 min，加入 HP 标记的山羊抗兔 IgG(货号:SA00001-1，15 000)，室温震荡孵育 2 h，TBST 漂洗3 次，每次5min，ECL 化学发光液作用 1 min，压片、显影和定影。采用 Adobe Photoshop CS2 软件分析，检测 IL-1、TNF-、NOX2 和 SOD2 蛋白含量。超氧化物阴离子荧光探针法包埋小鼠大肠组织(回盲部)，用冰冻切片机将组织切成厚度为 25m 的薄片，置于载玻片中，室温下使用超氧化物阴离子荧光探针 10 mol/L 染色 10 min，在荧光显微镜下观察拍片(20 倍)。采用 ImageJ 软件检测OS 荧光强度。免疫荧光染色法10%水合氯醛麻醉小鼠后，行左心室主动脉插管，依次用 4 生理盐水 20 ml及含 4%多聚甲醛 100 ml 灌流。取小鼠大肠组织(回盲部)，4%多聚甲醛后固定，30%蔗糖脱水至组织沉底后，冰冻切片，厚度 25 m。PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，山羊血清封闭 1 h 后加入兔抗鼠 NOX2受体(货号:ab129068，1 200)，4 过夜。PBS 漂37临床麻醉学杂志 2023 年 1 月第 39 卷第 1 期J Clin Anesthesiol，January 2023，Vol39，No1洗 3 次，每次 5 min，加入 FITC 标记的羊抗兔二抗(货号:A0277，11 500)孵育 1 h，PBS 漂洗 3 次，每次 5 min，荧光显微镜下观察拍片(20 倍)。采用ImageJ 软件检测 NOX2 荧光强度(平均荧光强度=该区域荧光强度总和/该区域面积)。统计分析采用 SPSS 25.0 统计分析软件进行数据处理。正态分布计量资料以均数 标准差(?xs)表示，组间比较采用单因素方差分析，组内两两比较采用 LSD-t 法。P0.05 为差异有统计学意义。结果大肠组织 IL-1、TNF-、NOX2 和 SOD2 蛋白含量与 C 组比较，I 组、A 组和 AI 组 IL-1、TNF-和 NOX2 蛋白含量明显升高(P0.05)，SOD2 蛋白含量明显降低(P0.05)。与 I 组比较，A 组和 AI组 IL-1、TNF-和 NOX2 蛋白含量明显升高(P0.05)，A 组 SOD2 蛋白含量明显升高(P0.05)，AI组 SOD2 蛋白含量明显降低(P0.05)。与 A 组比较，AI 组 IL-1、TNF-和 NOX2 蛋白含量明显升高(P0.05)，SOD2 蛋白含量明显降低(P0.05)(图14)。注:与 C 组比较，aP0.05;与 I 组比较，bP0.05;与 A 组比较，cP0.05图 1四组小鼠大肠组织 IL-1蛋白含量的比较大肠组织 OS 和 NOX2 荧光强度与 C 组比较，I 组、A 组和 AI 组肠道 OS 和 NOX2 荧光强度明显增强(P0.05)。与 I 组比较，AI 组肠道 OS和 NOX2 荧光强度明显增强(P0.05)。与 A 组比较，AI 组肠道 OS 和 NOX2 荧光强度明显增强(P0.05)(表 1，图 56)。注:与 C 组比较，aP0.05;与 I 组比较，bP0.05;与 A 组比较，cP0.05图 2四组小鼠大肠组织 TNF-蛋白含量的比较注:与 C 组比较，aP0.05;与 I 组比较，bP0.05;与 A 组比较，cP0.05图 3四组小鼠大肠组织 NOX2 蛋白含量的比较注:与 C 组比较，aP0.05;与 I 组比较，bP0.05;与 A 组比较，cP0.05图 4四组小鼠大肠组织 SOD2 蛋白含量的比较47临床麻醉学杂志 2023 年 1 月第 39 卷第 1 期J Clin Anesthesiol，January 2023，Vol39，No1表 1四组小鼠大肠组织 OS 和 NOX2 荧光强度的比较(Au，?xs)组别只数OSNOX2C 组8122.429.310.22.8I 组8157.413.3a19.52.5aA 组8153.633.1a12.51.5aAI 组8189.15.6abc35.23.1abc注:与 C 组比较，aP0.05;与 I 组比较，bP0.05;与 A组比较，cP0.05图 5四组小鼠大肠组织 OS 荧光染色图(20)图 6四组小鼠大肠组织 NOX2 荧光染色图(20)讨论睡眠是人体必不可缺的生理过程，其对机体有不可忽视的调节作用67。严重睡眠不足可引发机体炎症反应与氧化应激，上调患者对术后疼痛的敏感性，从而降低患者术后恢复89。机体处于创伤或应激状态下会产生大量炎性因子和 OS，IL-1和 TNF-作为多效的促炎因子，是炎性免疫反应的关键介体。当外界刺激增加时，IL-1 和 TNF-表达上调，促进炎症级联反应与趋化作用，加速疾病的进展1011。本实验研究结果显示，与正常小鼠比较，切口小鼠、睡眠剥夺小鼠与睡眠剥夺下行切口手术小鼠大肠组织中 IL-1、TNF-蛋白含量均明显升高，并且睡眠剥夺下行切口手术小鼠炎性因子含量远高于其他小鼠，提示睡眠剥夺会加重机体的炎症反应。OS 是需氧细胞代谢过程的产物，机体通过抗氧化途径来减少其生成或加速其转化，从而维持OS 在较低水平12。OS 过度累积可引起机体的氧化应激反应和组织损伤，因此，OS 常被认为是衡量机体氧化应激损伤程度的重要指标13。细胞OS 的产生与 NOX2、SOD2 密切相关，NOX2 是专用于生成 OS 的酶，其通过 OS 参与调节机体炎症反应与氧化平衡，而 SOD2 作为清除及催化 OS 的抗氧化酶，可以降低机体的 OS 水平，减少氧化应激损伤1314。本实验研究结果显示，睡眠剥夺可明显升高 NOX2 蛋白含量、降低 SOD2 蛋白含量，导致OS 大量累积，促进及加重炎症反应与氧化应激。此外，小鼠大肠组织荧光结果显示，切口小鼠、睡眠剥夺小鼠与睡眠剥夺下行切口手术小鼠大肠组织OS 和 NOX2 荧光强度均明显强于正常小鼠，睡眠剥夺下行切口手术小鼠大肠组织 OS 和 NOX2 荧光强度明显强于切口小鼠和睡眠剥夺小鼠，进一步提示睡眠剥夺可导致小鼠肠道 OS 和 NOX2 表达增加，引起小鼠的炎症反应与氧化应激。本实验研究不足之处在于:睡眠剥夺可使切口小鼠大肠组织产生 OS，加重炎症反应和氧化应激，本实验研究仅从分子水平观察了睡眠剥夺引起的机体变化，没有使用相应的拮抗剂或激动剂来探讨相关机制，未来仍需进一步研究。综上所述，睡眠剥夺会引起小鼠大肠组织炎症反应和氧化应激，睡眠剥夺下行切口手术会进一步加重炎症反应与氧化应激。57临床麻醉学杂志 2023 年 1 月第 39 卷第 1 期J Clin Anesthesiol，January 2023，Vol39，No1参考文献 1Wesselius HM，van den Ende ES，AlsmaJ，et al Quality andquantity of sleep and factors associated with sleep disturbance inhospitalized patients JAMA Intern 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