铁皮石斛茎中1个新的联苄衍生物_孟威同.pdf

年 月第 卷第 期.，.，收稿日期 基金项目 国家重点研发计划项目（）通信作者张雪，副教授，硕士生导师，主要从事中药和天然药物活性成分研究，：作者简介 孟威同，硕士研究生，：铁皮石斛茎中 个新的联苄衍生物孟威同，孟晓，牛丽婷，章思思，欧阳春杰，丁春花，朱玲娟，张雪（沈阳药科大学 中药学院，辽宁 沈阳；厦门鹰君药业有限公司，福建 厦门）摘要综合运用硅胶柱色谱、柱色谱、柱色谱、制备薄层色谱、反相 等多种现代色谱学分离手段，从铁皮石斛 茎水提后的 乙醇提取物中分离得到 个化合物。根据波谱学方法（、）结合旋光数据、计算 鉴定了上述化合物的结构，分别为 （）、，二羟基联苄（）、羟基，二甲氧基联苄（）、，二羟基甲氧基联苄（）、羟基，三甲氧基联苄（）、（）、格链孢醇（）、羟基甲氧基苯丙酮（）、羟基，二甲氧基苯丙酮（）、（）和（）。其中化合物 为新的联苄衍生物，化合物、为首次从石斛属植物中分离得到，化合物 为首次从铁皮石斛中分离得到。化合物 显示出较强的 自由基清除能力，为.，表明具有抗氧化活性。化合物 对 葡萄糖苷酶显示出明显的抑制作用，为.，表明具有降糖活性。关键词 铁皮石斛；化学成分；结构鉴定；抗氧化活性；降糖活性 ，（，；，），（），（），（）（）（，）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（）（），；.，.，；：.铁皮石斛 为兰科 石斛属 植物，在浙江、安徽、广东、广西、福建等地均有分布。铁皮石斛以干燥茎入药，自 年开始一直作为中药孟威同等：铁皮石斛茎中 个新的联苄衍生物“石斛”项下的 个品种收录在中国药典中。其性微寒、味甘，中医将其归为肾、胃、肺经，清热滋阴、益胃生津、名目强腰，可治口干食少、阴伤虚热等，是我国传统的名贵药材。由于铁皮石斛突出的功效，中国药典 年版开始将其作为“铁皮石斛”单独收载，与中药“石斛”区别开来。近十几年来，国内学者对铁皮石斛提取物的化学成分和生物活性进行了较为广泛的研究，从中分离得到了联苄类、菲类、黄酮类、木脂素类、酚酸类等丰富的芳香化合物以及少量有机酸、含氮化合物等，发现其具有抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力、保护胃黏膜、降血糖、降血压、神经保护等多方面的作用。为深入发掘铁皮石斛中的化学成分，为其核心功效功能因子的研究奠定物质基础，本文在课题组前期对不同产地铁皮石斛茎的水提取物的化学成分进行研究的基础上，对铁皮石斛茎水提后的乙醇提取物进行了系统的化学成分研究，从中分离并鉴定了 个化合物，其中化合物 为新的联苄衍生物，化合物、为首次从石斛属植物中分离得到，化合物 为首次从该植物中分离得到，见图。对分离得到的部分化合物（，图）分别采用 自由基清除能力法和 葡萄糖苷酶抑制模型考察其抗氧化活性和降糖活性，结果表明化合物 具有较强的 自由基清除能力，化合物 对 葡萄糖苷酶显示出明显的抑制作用。图 化合物、的结构.，材料 分析型高效液相色谱仪（配备 检测器，美国 公司）；制备型高效液 相 色 谱 仪（配 备 检 测 器，日 本 公司）；型旋光光谱仪（德国 公司）；型低分辨质谱仪（瑞士 公司）；型超导核磁共振仪（瑞士 公司）；型旋转蒸发仪（日本东京理化器械株式会社）；型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；型真空恒温干燥箱（上海精宏实验设备有限责任公司）；柱色谱硅胶（目，目，青岛海洋化工有限公司）；薄层色谱硅胶（青岛海洋化工有限公司）；（英国 公司）；柱色谱填料（，日本 公司）；色谱纯甲醇、分析纯甲醇（天津市康科德科技有限公司）；色谱纯乙腈（美国 公司）；氘代试剂（美国 公司）；其他所用试剂均为分析纯。铁皮石斛药材 年 月采自厦门鹰君药业有限公司种植基地，经中国医学科学院药用植物研究所齐东耀副研究员鉴定为兰科石斛属植物铁皮石斛 的茎，标本（）现保存于沈阳药科大学中药学院。方法.提取分离取铁皮石斛的干燥茎.，剪成段，用 水加热提取 次，每次 ，用纱布过滤提取液，减压浓缩得浸膏（.）。剩余药渣用 乙醇回流提取 次，每次 ，用纱布过滤提取液，减压浓缩得浸膏（.）。取浸膏 采用硅胶柱色谱（目）分离，依次用环己烷乙酸乙酯（）和二氯甲烷甲醇（）梯度洗脱，得到 个流分 。（.）经 柱色谱（二氯甲烷甲醇 ）得到 个流分 。（.）采用硅胶柱色谱（目）分离，用环己烷丙酮（）梯度洗脱得到 个流分 .。.（.）年 月第 卷第 期.，.，经 柱色谱分离，用甲醇水梯度洗脱得到 个流分 .。.（.）经半制备高效液相色谱（乙腈水）纯化得到化 合 物 （.，）。.（.）经 柱色谱分离，用甲醇水梯度洗脱得到 个流分.。.（.）经制备薄层色谱（环己烷乙酸乙酯 ）纯化得到化合物 （.）。（.）经 柱色谱分离，用甲醇水梯度洗脱得到 个流分 .。.（.）经半制备高效液相色谱（甲醇水）纯化得到化合物 （.，）。.（.）经 半 制 备 高 效 液 相 色 谱（乙 腈水）纯化得到化合物 （.，）、（.，）。（.）经 柱色谱（二氯甲烷甲醇 ）得到 个流分 。（.）经 柱色谱分离，用甲醇水梯度洗脱得到 个流分 .。.（.）经半制备高效液相色谱（甲醇水）纯化得到化合物 （.，）。.（.）经半制备高效液相色谱（甲醇水）纯化得到化合物（.，）、（.，）。（.）经 柱色谱分离，用甲醇水梯度洗脱得到 个流分.。.（.）经半制备高效液相色谱（甲醇.甲酸）纯化得到化合物 （.，）；.（.）经半制备高效液相色谱（乙腈水 ）纯化得到化合物 （.，）。（.）经 柱色谱（二氯甲烷甲醇 ）得到 个流分 。（.）采用硅胶柱色谱分离，用二氯甲烷甲醇（）梯度洗脱得到 个流分.。.（.）经 柱色谱分离，用甲醇水梯度洗脱得到 个流分.。.（.）经半制备高效液相色谱（乙腈水 ）纯化得到化合物 （.，）。.自由基清除能力法参考文献方法稍加调整，在 孔板中加入不同浓度的待测样品溶液 和 自由基工作液（在 波长下的吸光度为.），选择常用抗氧化剂 作为阳性对照，同时以不加 自由基（以 代替 自由基）的待测样品溶液作为样品空白对照以消除供试品本身颜色对测试结果的干扰，并设阴性对照（以 无水乙醇代替待测样品）和空白对照（只加入 无水乙醇和 ），每组平行设 个复孔。轻微振荡混合均匀，室温避光反应 ，在 下测定吸光度。按公式计算待测样品的自由基清除率。自由基清除率 （样品 样品空白）（阴性空白）.葡萄糖苷酶抑制活性测试参考文献方法稍加调整，在 孔板中加入 缓冲液、不同浓度待测样品溶液 与 葡萄糖苷酶溶液（.），轻微振荡混合均匀，于 恒温孵育 ；再加入 硝基苯基吡喃葡萄糖苷（，），于 恒温孵育 ；然后加入 溶液（.）终止反应，在 处读取吸光度。同时设不加 葡萄糖苷酶的样品空白对照组、不加待测样品的阴性对照组和不加 葡萄糖苷酶、待测样品、底物的空白对照组，每组平行设 个复孔。按公式计算待测样品的抑制率。抑制率（样品样品空白）（阴性空白）结构鉴定化合物 淡黄色油状物，.（.，）。.（，计 算 值 为.），分 子 式 为，不饱和度为。谱（）显示（）：（.）。（，）图谱中，在低场区可见.（，.），.（，.）为 组，二取代的苯环（偶合系统）上的氢信号，.（，），.（，.），.（，.）为 组，四取代苯环上的氢信号。在高场区可见 组甲氧基氢信号.（，），.（，）。此外，.（，.，.），.（，.，.）为 组连氧亚甲基氢信号，.（，.），.（，）为 个连氧次甲基氢信号，.（，），.（，）为 组苄基氢信号。（，孟威同等：铁皮石斛茎中 个新的联苄衍生物）谱结合 谱中，共显示 个碳信号，其中.，.，.，.，.，.，.，.为 个 杂化的季碳信号，.，.，.，.，.为 个 杂化的叔碳信号，.，.为 个 杂化的叔碳信号，.，.，.为 个 杂化的仲碳信号，.，.为 个甲氧基碳信号。将化合物 的 和 数据与已知化合物 的数据进行对比，发现非常相似，区别主要在于 和 的化学位移和偶合常数，提示化合物 和 在 和位的构型可能存在差异。图谱中.（）和.（）存在相关，结合 图谱中可见 ，；，；，；，的远程相关，提示化合物 中存在 个联苄单元，见图。图谱中.（）和.（），.（）存在相关，结合 图谱中 与，存在远程相关，与 存在远程相关，以及与，存在远程相关，证明了 个苯丙素单元的存在。图谱中可见 ，的远程相关，结合化合物的分子式和不饱和度，可以确定联苄单元与苯丙素单元是通过 个二氧六环相连。图谱中.（）与.（）、.（）与.（）存在远程相关，确定 个甲氧基分别连接在 和 上，至此确定了化合物 的平面结构，与已知化合物 相同。图 化合物 的主要 和 相关.根据文献报道，可以用来判断二氧 六环中 与 的相对构型（或），为.时，与 为 构型；，为.时，与 为 构型。根据化合物 氢谱中 与 之间的偶合常数（.）确定化合物 的 和 为 构型。对该构型的一对对映异构体（，）和（，）进行含时密度泛函理论电子圆二色谱（）计算，通过对比发现化合物 的实测 图谱与异构体（，）的计算 图谱接近，表明化合物 的绝对构型为，见图。化合 物 为 个 新 的 联 苄 衍 生 物，命 名 为。其 和 数 据 见表。图 化合物 的实测 和计算 图谱.化合物 淡黄色油状物，分子式为；（，）：.（，.，），.（，.，），.（，）；（，）：.（，），.（，），.（，），.（，），.（，）。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物 为，二羟基联苄。化合物 黄色油状物，分 子 式 为；（，）：.（，.，），.（，.，），.（，），.（，.，），.（，.，），.（，），.（，），.（，）；年 月第 卷第 期.，.，表 化合物 的 和 数据（，）（，）（，）.（.）.（.）.（.）.（.）.（.）.（.）.（.）.（.，.）.（.，.）.（，）：.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（，），.（，），.（），.（），.（），.（）。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物 为 羟基，二甲氧基联苄。化合物 黄色油状物，分子式为；（，）：.（，），.（，），.（，），.（，），.（，），.（，.，），.（，.，），.（，.，），.（，），.（，）；（，）：.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（）。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物 为，二羟基甲氧基联苄。化合物 黄色油状物，分子式为；（，）：.（，.，），.（，.，），.（，.，），.（，.，），.（，.，.，），.（，），.（，），.（，），.（，）；（，）：.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（）。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物 为 羟基，三甲氧基联苄。化合物 无色油状物，分子式为；（，）：.（，），.（，.，），.（，.，），.（，.，.，），.（，），.（，），.（，），.（，）；（，）：.（），.（，），.（，），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（，），.（），.（）。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物 为。化合物 白色无定形粉末，孟威同等：铁皮石斛茎中 个新的联苄衍生物，分子式为；（，）：.（，.，），.（，.，），.（，.，），.（，.，），.（，）；（，）：.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（）。以上数据与文献报道基本一致，故鉴定化合物 为格链孢醇。化合物 无色油状物；，分子式为；（，）：.（，.，），.（，.，），.（，.，.，），.（，.，），.（，.，），.（，）；（，）：.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（）。以上数据与文献报道基本一致，故确定化合物 为 羟基甲氧基苯丙酮。化合物 无色油状物；，分子式为；（，）：.（，.，），.（，.，），.（，.，），.（，.，），.（，），.（，）；（，）：.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（）。以上数据与文献报道基本一致，故确定化合物 为 羟基，二甲氧基苯丙酮。化 合 物 淡 黄 色 油 状 物，分 子 式 为；（，）：.（，），.（，），.（，.，），.（，），.（，），.（，），.（，.，），.（，），.（，），.（，），.（，），.（，），.（，.，），.（，.，）；（，）：.（），.（），.（，），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（），.（）。以上数据与文献报道基本一致，故确定化合物 为 。化合 物 无 色 油 状 物，.（），分子式为；（，）：.（，.，.，），.（，.，.，），.（，.，.，），.（，），.（，），.（，）；（，）：.（，），.（，），.（，），.（，），.（，），.（，）。以上数据与文献报道基本一致，确定化合物 为。活性测试对分离得到的联苄类化合物（其余化合物因量少未进行测试）分别采用 自由基清除能力法和 葡萄糖苷酶抑制模型考察其抗氧化活性和降糖活性。在 自由基清除活性测试中，所测的 个化合物均表现出较强的 自由基清除能力，分别为（.）、（.）、（.）、（.），清除能力接近阳性药 常用抗氧化剂 为（.），表明具有抗氧化活性。在 葡萄糖苷酶抑制活性测试中，只有化合物 具有 葡萄糖苷酶抑制作用，为（.），明显强于阳性药阿卡波糖为（.），而其余的测试化合物均未显示出抑制作用，表明化合物 具有降糖活性。结果与讨论本研究综合运用多种现代色谱学分离手段和波谱学鉴定方法，从铁皮石斛茎水提后的 乙醇提取物中分离鉴定了 个化合物，其中化合物 为新的联苄衍生物，化合物、为首次从石斛属植 年 月第 卷第 期.，.，物中分离得到，化合物 为首次从铁皮石斛中分离得到。化合物 在 自由基清除能力活性测试中显示出接近阳性药 的抗氧化活性。化合物 在 葡萄糖苷酶抑制活性测试中显示出明显强于阳性药阿卡波糖的降糖活性。研究结果填补和丰富了石斛属植物化学分类学研究的内容，为铁皮石斛核心功效功能因子的研究奠定了物质基础。在 自由基清除能力测试中，所测的 个联苄类化合物（）均表现出较强的 自由基清除能力。对活性化合物的结构和测试结果进行初步分析，发现在 个苯环上均有羟基取代的化合物 活性最强，只有 个苯环上有羟基取代且羟基邻位有甲氧基取代的化合物 活性次之，只有 个苯环上有羟基取代且羟基邻位无取代基的化合物 和 活性进一步下降，具体的构效关系还有待深入研究。参考文献 国家药典委员会 中华人民共和国药典 一部 北京：中国医药科技出版社，：孙恒，胡强，金航，等 铁皮石斛化学成分及药理活性研究进展 中国实验方剂学杂志，（）：陈晓梅，田丽霞，单婷婷，等 铁皮石斛种质资源和遗传育种研究进展 药学学报，（）：，（）：李榕生，杨欣，何平，等 铁皮石斛根茎中菲类化学成分分析 中药材，（）：管惠娟 铁皮石斛的化学成分及指纹图谱研究 沈阳：沈阳药科大学，王芳菲，李燕，董海玲，等 铁皮石斛中一个新化合物 中国药学杂志，（）：李燕，王春兰，王芳菲，等 铁皮石斛中的酚酸类及二氢黄酮类成分 中国药学杂志，（）：刘小敏，易陈颖，彭有娃，等 铁皮石斛抗氧化活性及抑制亚硝化作用研究 广东化工，（）：，：，：王云威，王景雪 铁皮石斛多糖对 型糖尿病小鼠降糖降脂的作用 食品科学，（）：吴悦，赵文慧，朱冰儿，等 铁皮石斛不同温度的提取物对自发性高血压大鼠降压作用研究 中国现代应用药学，（）：，（）：管惠娟，张雪，屠凤娟，等 铁皮石斛化学成分的研究 中草药，（）：，（）：牛丽婷 铁皮石斛的化学成分和生物活性研究 沈阳：沈阳药科大学，：，：卫强，刘瑞杰，刘娣，等 樱花化学成分及抑制 葡萄糖苷酶活性研究 井冈山大学学报，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：李燕，王春兰，王芳菲，等 铁皮石斛化学成分的研究 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