唾液作为寄生虫病诊断标本的研究.docx

唾液作为寄生虫病诊断标本的研究唾液作为标本诊断某些疾病已受到很多学者的重视，在病毒如HIV、HBV、麻疹、风疹病毒1,2,3和细菌如百日咳杆菌等病原体引起的感染性疾病中已见实际应用。在寄生虫感染的诊断中虽然目前的研究尚不多见，但因唾液具标本收集较为方便、非损伤性、易为病人接受等优点，也引起了寄生虫学界的重视。本文旨在将近年来国外有关唾液标本用于寄生虫病诊断的研究进展作一简要综述。1唾液标本的组成及收集处理唾液为口腔中的三对大唾液腺(腮腺、颌下腺、舌下腺)及分布于上下唇、颊部等处的小唾液腺所分泌的液体，包含有水、糖蛋白、溶菌酶、过氧化物酶、乳铁蛋白、碳酸氢盐和磷酸盐构成的缓冲系统及免疫球等蛋白多种成分。寄生虫病检测所有标本多为取自口腔的全唾液，其中不仅包括来自各种诞腺的混合的分泌物，亦包括脱落的上皮细胞、软组织的微生物及来自龈裂内的液体等17。正常人每日全唾液的分泌量约为1升，其pH值在之间，唾液中的蛋白质浓度为1g/100ml，较血浆中低100倍左右。唾液中含有多种免疫球蛋白，主要为由唾液腺局部的浆细胞产生的分泌型IgA(SIgA)，由血清经龈沟渗入口腔的IgG、IgA和少量IgM与IgE4,5。每100ml唾液中IgA、IgG与IgM的含量分别为、，大约为血清浓度的1/10，1/800与1/4001。唾液中的免疫球蛋白的含量虽远低于血清，但Parry1用放射免疫分析(RIA)与酶联免疫吸附试验(ELISA)等方法检测免疫缺陷病毒、甲型肝炎与风疹病毒感染者唾液中的特异性抗体后认为，唾液中的抗体的水平已足够用于一些免疫学诊断，唾液中的IgG一般多用来诊断组织及血液内的寄生虫。Challacombe将放射性125I标记IgG注入恒河猴体内，30分钟后标记物便可出现于口腔唾液中，从而证实唾液中IgG可及时反应体内IgG的存在。此外，Ascota发现无牙或牙齿较少者唾液中IgG含量下降而牙周病患者中唾液IgG水平上升。对肠道寄生虫病的诊断多采用检测唾液中的SIgA。有研究者发现肠道粘膜相关淋巴组织抗原刺激后产生的免疫反应，可表现在全身各粘膜部位，在唾液等处可检测的分泌性免疫反应物质在血液可能缺如。非刺激性的全唾液的收集可以通过使唾液从下唇滴入漏斗，然后放进刻度管内。刺激后唾液的收集，可使受试者咀嚼一些对实验结果无影响的物质如橡皮圈等，以刺激唾液的分泌。目前广泛使用的方法是让病人将棉花球放入口中，用舌翻动，特别是使之接触齿龈的部位，待浸湿后取出抗出唾液。在动物实验中，可用电流刺激分泌神经或使用药物增强唾液分泌，以助采集。由于有细胞碎屑及沉淀的粘液素，全唾液往往很粘稠且为非均质，用于免疫诊断时需于低温下经14000g以上的高速离心以去除杂质。需长期促存时可使用硫柳汞防腐，但不宜使用叠氮纳以免干扰实验结果。唾液中的许多有机成分会因细菌酶和低渗唾液中白细胞分解后放出的酶作用而很快分解，故唾液在收集后应立即进行分析或冰冻保存。亦有研究者将收集后的唾液于56温育45分钟，以减少唾液中的酶类对有机成分的分解作用。2检测方法由于唾液中免疫球蛋白的含量较低，故宜采用较敏感的方法。在免疫诊断方法中，ELISA因其操作简便、费用较低而应用较多，特别是间接ELISA已在猪囊尾蚴、阿米巴原虫、刚地弓形虫等寄生虫引起的疾病中广泛应用。近年来，研究者对抗原进行了改进，如在脑囊尾蚴病诊断中，Planlarte通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离猪囊尾蚴的蛋白质抗原，以免疫印迹试验(Western blotting)筛选出组分抗原GP24，用于检测猪囊虫病，特异性良好。蓝氏贾第鞭毛虫膜蛋白经SDS-PAGE分离出的24个抗原片段，经唾液标本的筛选，分子量为120，105，92，66，32，29，14kDa的片段被认为有特异性，具诊断潜力。由于新型诊断抗原的使用，间接ELISA的特异性与敏感性都有所提高。酶联免疫转移印迹试验(EITB)在唾液样本的检测中亦被使用，此种方法敏感性与特异性均较高，但操作复杂，费用较高，需一定的设备，多用于研究工作。Feldmen10和Flisser11曾用EITB技术检测患者唾液中的特异性IgG抗体以诊断脑囊虫病。Feldmen发现其中抗原片段GP24最易被唾液中的IgG所识别。直接凝集试验(DAT)检测唾液特异性IgG抗体曾Musum mA12用来诊断黑热病，因其操作简单、唾液标本用量较少，而适用于内脏利什曼病的流行病学的调查12。此外，亦将有染料试验(DT)用于诊断唾液中抗刚地弓形虫抗体的报道13。3在寄生虫病诊断中的应用阿米巴病阿米巴病的诊断多依靠在粪便中查找病原体。但粪便检查费时、费力，需有经验的工作人员，且不适于大规模的普查。Muro14在墨西哥阿米巴病流行区，以粪检病原体、ELISA方法检测粪便中溶组织内阿米巴物异性膜抗原与唾液中检测特异性抗体三种方法，对223名514岁学生进行普查后发现，唾液中特异性IgA检测的敏感性为85，特异性达98。此结果与粪中抗原检测的结果无差异(r，P)，也与粪便中病原体检查的结果一致。由于唾液检测较为方便，且比血清与粪便检查便宜，认为可适用于流行病学调查。Muro同时发现人群中阿米巴原虫的感染率与唾液中IgA检测的敏感性呈正相关，与特异性负相关。当人群感染率5时，其特异性99，敏感性60，感染率70时的特异性为70，敏感性达99。Aceti15检测了阿米巴病患者、阿米巴带虫者和健康人唾液中的特异性抗体后发现，IgA在侵袭性阿米巴病患者唾液中显着升高，而无症状带虫唾液中的IgA水平与健康人无差异。故认为唾液中IgA抗体仅适合于诊断侵袭性阿米巴病，对阿米巴带虫者无价值。此外，研究者亦有报道唾液中抗溶组织内阿米巴IgA抗体在治疗后45天可消失，成人与儿童感染阿米巴后分泌性免疫应答相似。Brian16以260kDa半乳糖抑制性粘附蛋白(GIAP)为诊断抗原，用ELISA方法检测了13名阿米巴肝脓肿患者(其中4名为经甲硝唑治疗病人)唾液中抗GIAP抗体IgA与血清中的IgG。发现两者均明显升高，但两者之间不相关，而治疗与未治疗病人唾液中的IgA水平无差异。弓形虫病Hajeer12经人体实验后发现人们感染弓形虫后，唾液中11天即可查见IgM抗体，27天后查见IgG抗体，两者在81天后转阴。而IgA可在急性、慢性感染，及血清检测阴性感染有唾液中均可查见，从而认为唾液中IgG、IgM对急性弓形虫病具有诊断潜力，而唾液中IgA的水平对急、慢性弓形虫病无鉴别意义。Loyela对60人进行流行病学调查后证实唾液中抗弓形虫IgA水平可反映血清IgG水平。唾液中的IgA检测可用于弓形虫病的检测，而唾液中的IgG不适于慢性弓形虫感染的流行病学调查。唾液标本除用于免疫学诊断外，还可用于病原学检查。Amendoeira17曾在一名3岁幼童唾液及扁桃体中查找到刚地弓形虫的滋养体。而Terragna18将弓形虫感染兔的唾液接种小鼠后发现，在33感染兔的唾液中有病原体存在，从面证实唾液在弓形虫传播中的媒介作用。但Amesto19在检测了26位艾滋病人(其中6例明确诊断并发弓形虫病)的唾液，结果均未发现弓形虫，故认为在艾滋病人唾液中寻找弓形虫病原体以诊断弓形虫病的意义不大。杜氏利什曼原虫病杜氏利什曼原虫感染引起的内脏利肝什曼病的免疫诊断多依靠血清学检查。Masum12以DAT检测了19例黑热病人唾液中的特异性抗体，18例唾液检测呈阳性结果，且特异性为100。由于唾液标本检测较为方便及安全，作者认为可代替血清进行免疫诊断。蓝氏贾第鞭毛虫病Disney20用ELISA法检测24名蓝氏贾第鞭毛虫患者唾液中SIgA后发现，其SIgA水平与健康人有显着性差异(P)。猪囊尾蚴病本病的临床表现多样而无特异症状，临床诊断较为困难。目前较为有效的诊断方法包括计算机断层扫描、核磁共振(MRI)、检测脑积液与血清标本中抗囊尾蚴抗体。但CT及MRI费用较高，脑积液与血清检测具有损伤性。有鉴于此，唾液中特异性抗体的检测有望为本病提供较为理想的诊断方法。Acasta用猪带绦虫囊尾蚴的粗提物作为诊断抗原，用ELISA方法检测了43例脑囊病患者、34例非感染性脑部疾病患者及39名正常人唾液及血清中的特异性抗体后发现，唾液中特异性IgG的检测对脑囊虫具有较高的诊断价值，但IgA的检测无诊断意义。由于囊尾坳粗提物与扁虫有交叉抗原，故此方法仅适用于非血吸虫病及包虫病流行区。Feldman10用两种方法(ELISA、EITB)检测了28例脑囊虫病、29例非感染性脑部疾病及26名健康人唾液与血清中的特异性抗体后发现，ELISA检测唾液中IgG的敏感性为，高于血清标本检测结果()。Feldman认为EITB可作为血清诊断囊虫病较好的方法，而ELISA检测唾液中的IgG抗体，因其无痛、无损伤性可应用于临床及流行病学调查。绦虫病Kinder21分析了豆状绦虫(Tania pisiformis)感染犬唾液与血清中免疫球蛋白后认为，唾液中特异性IgA与血清中IgG抗体可反映带绦虫感染，这两种抗体在感染后两周上升，治疗4周即显着下降。由于唾液中IgA在绦虫产卵前已出现，治疗后可消失。故可用于区分新旧感染。kinder认为检测唾液中的IgA对肠道绦虫病具诊断潜力。参考文献1 Parry JV et ,1987;2(8550)72-752 Perry KR etMed Virol,1993;40(3):235-2403 Archibald DW etInf Dis,1987;155(4):793-7964 CohenHeinemann Medical Books Limited,19765 MandelOral Pathol Med,1990;1993):119-1256 Challacombe SJ etExp Immunol,1978;34(3):417-4227 AcostaClin Lab ;492):90-948 Loyoal AM etOral Pathol Med,1997;26(4):17-1919 Plancatre A etJ Parasitol,1994;24(5):733-73810 Feldman M etR soc T rop Med Hyg,1990;84(4):559-56211 Flisser A etParasitol Hum Comp,1990;65(Suppl 1):95-9812 Masum MA etR Soc Trop Med Hyg,1994;88(6):66013 Hajeer AH etImmuno,1994;16(1):43-5014 Del-Muro R etInt Dis,1990;162(6):1260-136415 Aceti A etInf Dis,1991;164(3):613-61416 Brian LK etJ Trop Med Hyg,11995;51(4):454-45917 Amendoeira MR etInf Dis,1982;145(4):58718 Terragna A etParasitol,1984;35(1);9-1019 Amato NV etHosp Clin Fac Med Sao Paulo,1990;45(4):171-17220 Borjas DM etImmunity,1998;66(2):756-75921 Kinder A etParasitol,1992;41(3-4):321-327