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基因工程的现状与发展趋势【实用文档】doc
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题目：基因工程的现状与发展趋势
专业：13食品科学与工程 　
　 　　学号：1３2701105
　 　姓名：盛英奇
日期: 2015／7/1

【摘要】从20世纪70 年代初发展起来的基因工程技术,经过４0多年来的进步与发展,已成为生物技术的核心内容.生物学成为2１世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研　究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域 。
【关键词】 基因工程技术；应用；前景；现状
一、墓因工程的原理及研究内容
　 　基因工程是人们在揭示生命之谜的过程中建立起来的。早在３00多年前，人们就发现，世界上生物尽管种类繁多,千姿百态,但都是细胞(如肉眼看不见的细菌等微生物）或者是由细胞构成的（如现存的200多万种多细胞动植物）。人们还发现,生物有遗传和变异的特征,遗传保证了生物种类的延续不断,变异则赋予生物种的进化,保证生物种类对环境的适应。而生物的所有特性及遗传变异都是由生物体细胞内的遗传物质所决定的,这种遗传物质就是被科学家称之为脱氧核糖核酸(简称DNＡ)的大分子物质，一般位于生物的细胞核内。DＮA是由许多核昔酸连接而成的高分子化合物,如把DNA比喻成长链条，核昔酸就是组成这链条的一个个环节。生物细胞核内的ＤNA分子是由两条成对的多核昔酸长链互相缠人类开始学会干预生物的变异，即通过杂交、筛选等方式改变生物物种的某些特性，使之有利于人类,如水稻、小麦等作物的育种，家禽家畜优良品系的培育等，它是通过动植物父、母本交配繁殖时，生殖细胞内ＤNA上相应性状基因互相间可能出现的交换来实现的，这种交换的概率是人们不能控制的，所以选种的过程较为缓慢,需几年乃至几十年的时间,而且亲缘关系相差较远的生物种之间很难杂交。而本世纪}ｏ年代初诞生的基因工程，则是按照人类的需要，从某种生物体的基因组中，分离出带有目的基因（即所需基因）的DＮA片段，运用重组DＮＡ技术，对这些ＤNA片段进行体外操作，把不同来源的基因按照设计的蓝图,重新构成新的基因组（即重组体）,再将重组DＮA分子插入到原先没有这类DＮＡ片段的受体细胞(亦称宿主细胞）的DNA上,并使其不仅能“安家落户"，而且能“传种接代"，即能准确地把该外源基因的遗传特性在新的细胞（宿主细胞）里增殖和表达出来.就像一台机器上的零部件拆下来安装到另一台机器上。在生物体中，这种生命零件就是基因。因为用的是工程技术的方法原理，故称基因工程,亦叫遗传工程。用这种方法所形成的杂种ＤＮA分子与神话中的那种狮首、羊身、蛇尾的怪物颇为相似。
由于细胞很小,DＮA分子更小，肉眼根本不可能看见,也无法用手或机械
工具操作,为此科学家发明了许多特殊的技术和工具，还有操作方法和程序,这
些都是基因再程研究的内容，这些工作都非常复杂而艰巨.
二、基因工程应用于植物方面　
农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。 农作物生物技术的目是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力.基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就.由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒　(TMV)的外壳蛋白基因导人烟草中， 在转基因植株上明显延 迟发病时间或减轻病害的症状，通过导人植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力,已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学　家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学　家协同作战，耐涝 、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种 (系）也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体 内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的 增长，　从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可 获得转基因植物 ，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中。 随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明,利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获　取蛋白质合成基因,成功地导入到马铃薯中，　培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆,大大提高了营养价值,得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究.另外,大豆转基因技术应用领域十分广泛,主要应用在抗除草剂改良大豆品质抗病虫及抗逆境等方面.从198１年Whｉtely克隆了Ｂt（苏云金芽孢杆菌）毒白基因 ｃrylＡ(b)以来,人们已从Bt中克隆出50多个毒素基因Benedict 等.认为虽 Bｔ 基因已转到大豆植物中，但表达量低抗虫效果不理想。从植物中分离出的昆虫的蛋白酶抑制基因,广泛应用的是豆胰蛋白酶抑制剂基因（ＣｐTi）)。对于许多给农业生产造成重大经济损失的害虫都具有抗性，由于 ＣｐTｉ 的作用部位是酶活中心，所以CｐTｉ所介导的抗性是比较稳定的Paｒrotｔ［4]。报道已将 CpＴi 转入大豆携有　CｐTｉ 抗虫基因的愈伤组织，已获得正进一步鉴定雷勃钧等［5］应用花粉管通道法将种内种间属间外源总 DNA 成功导入受体大豆植株并获得一些有价值的遗传变异徐香玲等［6]用质粒做介导已将 PKＴ54B７C5质粒上的Ｂtk—内毒素蛋白基因导入东北大豆黑农３7黑农39等品种大豆抗虫基因已取得一些可喜进展抗除草剂的大豆已被美国批准进入市场近年来转基因大豆层出不穷转基因大豆面积在全球转基因作物面积中高居榜首。目前大豆基因组研究突飞猛进随着更高信息量的分子标记技术的应用和发展基因组内缺乏的大量遗传多态性的限制将被克服大量基因及各种性状的　QTLｓ 的准确定位将分子标记辅助育种推向应用基因克隆也已实施对于转基因作物对人及动物带来的毒副作用我国已建立了对转基因作物进行安全性评价的专门机构　——　农业生物基因工程安全委员会并颁布了相关的管理条例使转基因作物的安全管理制度化在饱和遗传图谱和分子标记的基础上,尤其是 ＱＴLｓ 的分了标记基因定位,使操作单个　ＱTL 成为可能育种者可从单个主基因或单个 QTL 直接选择许多抗性基因被克隆转基因大豆数量也逐年增多，２00０ 年占主导地位的转基因大豆为全球转基因作物的 ５８％且均为抗除草剂大豆转基因大豆在 2０00 年达到 2580 万公顷种植面积位居各类转基因作物之首[2５］油分含量高蛋白含量高品质好营养丰富抗性强等性状将是大豆转基因研究方向因而转基因研究应从单基因的转化面向量基因转化向发展我国应加强国际间合作，充分利用我国的资源优势,充分利用现有成果, 用不同的分子标记来实现我们自己的研究目的利用分子标记,研究大豆的遗传多样性,为大豆种质资源收集保存和利用，为亲本选择大豆类群的划分和组建提供依据用分子标记分析育成品系用分子标记加速培育优质大豆种子的近等基因系使基因工程更好地服务于大豆遗传育种工作将基因工程与常规育种方法结合起来,可以准确地鉴定基因型可以先用常规方法把多个抗性基因组装在一起，然后利用分子标记技术快速准确地鉴定出多抗性基因型可见应用基因工程技术与常规育种方法紧密结合是大豆育种的一个突破方向而实现种间属间甚至动植物间的基因流动是另一个突破方。
三、基因工程应用于医药方面
　 　 我国的基因工程制药产业起步于八十年　代后期。在各级政府的重视支持和企业的积极参与下，我国的基因工程药物发展十分迅猛。从１989年批准的第一个基　因工程药物：基因重组人干扰素alb(外用 ）开始， 我 国的基 因工程制药产业实现了零的突破，并迅速发展壮大。据不完全统计,至199８年底,全国涉及基因工程技术的单位接近10０家,其中已申报基因工程药物并在有关部门登记立项 的单位约为60余家，已取得基因工　程药物或疫苗试生产或正式生产文号的单位有30余家.全国已批准上市的基因工程药物和疫苗产品共计15种,尚有近百种医药生物技术产品正在进行临床或临床前研究开发。1998年全国整个基因工程 制药产业的销售额已达到7.２亿元人民币,1９96年～19９8年的年增长率达到８０％.预计２000年我国的基因工程药物销售额将达到2２.８亿元。目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫苗、激素和寡核甘酸药物等.它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、 类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用.我们最为熟悉的干扰素（ＩFN)西还是新生事物,需要实践慢慢地检验.转基因生物和常规 繁殖生长的品种一样，是在原有品种的基础上对其部分性状进行修饰或增加新性状，或消除原来的不利性状，但常规育种是通过自然选择，而且是近缘杂交，适者生存下来，不适者被淘汰掉。而转基因生物远远超出了近缘的范围，人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验, 按目前的科学水平还不能完全精确地预测。 所以,我们要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理,充分重视转基因生物的安全性。在未来的十年内,我国发展基因工程药物的思路应是：准确把握国际生物技术的发展趋势。结合我国的实际情况，充分发挥我国基因工程药物方面的优势,重点发展重大关键技术的创新、引进和已有技术的集成应用，采取 “立足创新,创引结合，集成应用.需求导向，产学研三结合,优势互补,重点突破”的发展战略.战略目标是增强我国基因工程药品的创新能力和国际竞争力，使 我国的基因工程药物不仅要占领国内市场，还要在国际市场上有所突破,在未来的十年内大力提高我国基因工程技术研究开发的整体水平，促使基因工程制药产业成为整个制药产业的新的经济增 长点.
四、基因工程应用于化工方面
以基因工程为核心的生物技术在化工领域应用的研究也取得很大成绩，如研究用酶工程技术生产丙烯酞胺、环氧丙烷等基本化工产品，以便将化学法生产这些产品的高温高压环境改变为生物方法的常温常压环境。现在，应用微生物生产丙烯酞胺的技术已经研究成功，正进行产业化开发。用基因工程技术生产的工业酶制剂还可用于日常生活和工业生产，如洗涤用的脂肪酶、纤维素酶和蛋白酶，造纸用的脂肪酶,纺织用的淀粉酶等都已投放市场。
　此外,一些先进国家还把基因工程作为开发信息技术的新措施，使基因工程跟微电子技术攀亲,形成崭新的生物电子技术，它是利用基因重组技术原理，通过电子计算机设计出能进行信息处理的微型高分子元件（也叫生物集成块）,从而利用蛋白质生产一种只有细胞那么大小的生物电子计算机,现美国科学家已经研制成功生物集成块,并取得专利.这类措施还包括生物传感器的研究等。
五、基因工程应用于食品工业方面
酶是生物细胞产生的有催化活性的蛋白质,它参与生物体内各种化学变化.动物、植物、微生物都可作为酶的来源。由于酶具有专一性强，催化效率高,作用条件温和等特点。酶的应用可增加产量，提高质量，降低原材料和能源消耗，改善劳动条件,降低成本，甚至可以生产出其他方法难以得到的产品,促进新产品、新技术和新工艺的兴起和发展。可利用基因工程技术培育出新的酿酒酵母菌株，用以改进传统的酿酒工艺。经基因操作改造后的酵母还可生产出高产量的具全部天然活性的凝乳酶,这种酶用于干酪生产.它与从哺乳小牛胃中提取的传统方法相比，不但产量高,还可大大节约成本。应用基因工程还可以生产出新型的蛋白质，如制造面包用的淀粉酶、酿造用的乙酞乳酸脱氢酶等。
利用基因工程技术研究开发基因工程作物，基因工程作物可用于生产食品原料和配料成分,如蛋白质、酶、稳定剂、增稠剂、乳化剂、甜味剂、防腐剂、着色剂和调味剂等{In。有些遗传工程和天然存在的食品具有保健功能，称作营养保健品。这类食品不仅含有营养成分,而且还含有其它化合物（如抗氧化剂、低胆固酵油或聚不饱和脂肪酸油、类黄酮、果聚糖、维素、胡萝卜素、番茄红素等。具有防病，减轻症状,提高生活质量，减缓衰老的功能。这些用作医疗的食品将会有很好的发展。
六、基因工程应用于环保方面
　 　 现代工业生产带来了很多环境问题,基因工程技术为环境保护提供了新的手段.基因工程应用于环境保护起始于2０世纪80年代。目前己培养出能降解农药、除草剂、塑料、防治重金属污染、清除石油污染的基因工程菌.经基因改造的杨树在生长过程中，可清除土壤、地下水中重金属的污染，将可分解石油成分基因工程菌接种到海滩，可清除海滩的原油污染，其清除速度比天然细菌快得多.

【结语】
　 　由上所述,可见基因工程是一项带有革命性的、具有战略作用的高新技术,它的影响已经深入到人类生活的各个方面，而且对社会经济发展和增进人类健康必将发挥越来越大的作用。未来的前景是美好的,即将到来的2１世纪是生物世纪，基因工程亦将在新世纪中取得更大成就,并将实现更大规模的产业化。
在科技高速发展的时代，国际间的竞争也是异常激烈的。我国对于基因工程的研究起步稍晚,但发展很快.党和政府对此也十分重视。然而，我们与世界上发达国家相比,还有不小的差距。我们现在的任务,就是要充分认识以基因工程为核心的生物技术发展趋势,不失时机，制定发展策略,加大投入，组织研究力量,重点攻关，并且加快产业化的步伐，以期让基因工程在我国实现四个现代化，增强综合国力，提高人民生活中作出更大贡献,同时也为国争光、为人类造福。

参考文献
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《基因工程及其应用》教案
【教学目标】
知识目标
掌握基因工程的概念、原理;基因操作的工具及其操作过程.
能力目标
培养学生分析、推理、归纳、总结的能力。
德育目标
培养学生实事求是的科学态度从现象到本质的科学的研究方法。
【教学重点】
基因工程的基本原理，基因操作的工具，基本步骤及其应用.
【教学难点】
基因工程的基本原理,基因工程的应用及其安全性。
【课时安排】1课时
【教学过程】
一、情境创设
提问:各种生物间的性状千差万别这是为什么呢?
引导:生物体的不同性状是通过基因特异性表达而形成的.
列举：几种生物的不同性状：够吐出丝;豆科植物的根瘤菌能够固定空气中的氮气；青霉菌能产生对人类有用的抗生素——青霉素.
提问:人类能不能改造性状?能不能使本身没有某个性状的生物具有某个特定性状呢？
引导：让禾本科植物能够固定空气中的氮气;能否让细菌“吐出”蚕丝；让微生物生产出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物。(这种设想能实现吗？)定向改造生物的新技术——基因工程。
二、师生互动
（1）基因工程的原理
指导学生阅读教材P102页第二段,通过提问的方式指导学生找出概念中的关键词语，并让学生理解基因工程概念,引导学生独立完成。最后归纳列表，便于学生的记忆.
概念：在生物体外,通过对DNA分子进行人工“剪切”和“拼接”，对生物的基因进行改造和重新组合,然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物.
（2）基因操作的工具
利用多媒体课件演示抗虫棉培育过程示意图,同时提出讨论问题,进行分组讨论,最后交流讨论结果,教师进行归纳总结。
思考：在以上的基因工程培育的过程中,关键步骤或难点是什么?
引导：关键步骤的完成过程中都要用到基因操作工具,并使学生形象地记忆“工具”的作用。
A基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）。
通过演示多媒体动画,将限制酶的作用过程进行动态演示，使学生理解抽象的知识内容。 
①存在：主要是存在于微生物细胞中。②特性:一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列,并在特定的切点切割DNA分子。③作用结果：得到具有黏性末端或平末端的DNＡ片段,如大肠杆菌中的EcoＲ I，能够专一识别GＡATTＣ的序列,并在G和Ａ之间将这段序列切开.
Ｂ基因的针线——DNA连接酶
从DNＡ的结构入手,利用多媒体动画演示连接酶的连接部位，利用形象的比喻使学生更容易接受和理解.DNA连接酶的作用是在DNA分子的连接过程中，黏合脱氧核糖和磷酸之间的缺口，即将由同一种限制酶切割后的黏性末端（碱基互补）的脱氧核糖和磷酸连接起来。
C基困的运输工具——运载体
对于运载体的教学，应使学生形象地理解运载体的作用、种类及其所具备的条件。
目前常用的运载体有质粒、噬菌体、动植物病毒等。其中,质粒存在于细菌及酵母菌等生物中,是拟核或细胞核外能够自我复制的很小的环状DＮA分子。
学习完这些操作工具后,再来看看现有的基因工程的成果,大家一起思考下这些工具到底怎样操作才能完成基因工程的过程呢？
归纳:请学生写出基因工程操作的基本步骤和操作过程。
总结： 基本步骤：剪切→拼接→导入→表达
操作过程：提取目的基因→目的基因与运载体结合→目的基因导入受体→目的基因检测与鉴定
(3）基因工程的应用。
①基因工程与作物育种
作物育种：人们利用基因工程的方法获得了转基因抗虫棉，耐贮存的番茄，耐盐碱的棉花,抗除草剂的玉米、油菜、大豆等.抗虫基因作物的使用，不仅减少了农药的用量，大大降低了生产成本，而且还减少了农药对环境的污染。
②基因工程与药物研制
利用基因工程生产的药物有胰岛素、干扰素、白细胞介素、溶血栓剂、凝血因子,以及预防乙肝、霍乱、伤寒、疟疾的疫苗等.基因工程生产药品的优点是效率高、成本低、品质好。
③转基因生物和转基因食品的安全性
转基因生物和转基因食品的优点:解决粮食短缺问题;减少农药使用,从而减少环境污染；节省生产成本，降低粮食售价；增加粮食营养，提高附加价值;增加食物种类,提升食物品质；促进生产效率,带动相关产业发展。
转基因生物和转基因食品的缺点：可能产生新毒素和新过敏原，可能产生抗除草剂的杂草，可能使疾病的散播跨越物种障碍，可能威胁其他生物的生存，可能干扰生态系统的稳定性。
三、板书设计
一、基因工程的原理
基因工程的别名
操作对象
操作水平
原理
操作环境
结果（目的）
基因拼接技术或DNA重组技术
基因
DNＡ分子水平
基因重组
生物体外
定向地改造生物的遗传性状
二、基因操作的工具
1基因的剪刀—-限制性内切酶(简称限制酶）。
２基因的针线—-ＤNA连接酶
3基困的运输工具——运载体
三、基因工程的应用
四、课堂总结及布置作业
复习基因工程操作的基本步骤和重要工具，完成课后习题

一、简述基因研究所取得主要成就，及其与基因工程创立与发展的关系。
1、基因学说的创立
孟德尔提出遗传因子学说到后来的摩尔根染色体理论,揭示了在染色体上基因的线性排列.
2、DＮA是遗传物质
从Avery的细菌转化实验到沃森和克里克揭示了ＤＮA的双螺旋模型及半保留复制机理，表明DＮA是遗传物质。
3、DNA是基因的载体
4、基因是细胞中ＲＮA及蛋白质的“蓝图”。
5、随着中心法则的提出和64种密码子的破译，基因碱基顺序与蛋白质氨基酸顺序得到对应。
6、随着基因克隆和DNA序列分析技术的发展,人们对基因的分子结构有了进一步的认识。
7、随着操纵子模型的提出,人们对基因的表达调控有了进一步的认识。
8、随着基因分离与克隆技术的不断改良与发展，基因组文库、ｃDＮA文库、分子探针、PCＲ等技术不断被人们运用。
9、目前，不仅能够分离天然基因,还能结合化学合成等方法，在实验室内进行基因的合成、构建，并进行相应的表达分析。
基因工程是在分子生物学和分子遗传学等学科综合发展的基础上诞生的一门新兴学科,它的创立和发展,直接依赖于基因及其分子生物学研究的进步,基因及其研究为基因工程的创立奠定了坚实的理论基础。
二、基因工程建立的三大理论基础和技术条件是什么？并简述其在基因工程中的应用.
1、三大理论基础：
（1）1940年艾弗里（Ｏ。Ａvery)等人通过肺炎球菌的转化试验证明了生物的遗传物质是DNA，而且证明了通过DNＡ可以把一个细菌的性状转移给另一个细菌;
(2）1９50年沃森(J。Ｄ。Watｓon)和克里克（Ｆ.Cｒicｋ）发现了ＤNＡ分子的双螺旋结构及DNA半保留复制机理;
(３）１960年关于遗传信息中心法则的确立。
2、三大技术条件:
(１）限制性内切核酸酶和ＤNA连接酶的发现;
（2)基因工程载体；
（3)大肠杆菌转化体系的建立。
3、应用：
通过限制性内切核酸酶和DNA连接酶，可以将切割得到的目的基因与载体连接在一起，经由大肠杆菌转化体系增值复制,为基因工程的后续研究提供基础材料。

三、什么是植物基因工程?什么是转基因植物?两者的关系如何?转基因作物对社会和经济发展的意义主要有哪些?
1、植物基因工程：用人工的方法，从不同生物中提取外源基因片段及载体ＤNA,经过体外切割、拼接和重组,然后采取某种方法，把重组后的带有外源基因的载体DNA引入植物细胞，并使其在植物细胞内进行复制和表达，以达到预期的改变受体植物细胞遗传特性的目的，此种过程即称为植物基因工程。
2、转基因植物：转基因植物是拥有来自其他物种基因的植物。该基因变化过程可以来自不同物种之间的杂交，但今天该名词更多的特指那些在实验室里通过重组DNA技术人工插入其他物种基因以创造出拥有新特性的植物。通过植物基因工程中的重组DNA技术可以获得多种类型的转基因植物。
3、利用现代基因工程培育的转基因作物不仅克服了传统育种技术的种种局限性，大大提高了转基因的效率,加快了种质改良进程,而且打破了物种间的遗传壁垒,拓展了新品种研发可选择的特征范围，同时人工设计加工基因的应用则更进一步扩大了可利用的种质资源。转基因作物是人类按自己的主观意愿有目的、有计划、有根据、有预见地进行遗传修饰过的生物体,是现代生命科学发展的结晶，是人类从认识自然到改造自然的跃迁，标志着人类社会已经步入定向驾驭生物遗传改良的新时代。转基因作物将在彻底解决资源匮乏、环境恶化、顽症肆虐、粮食短缺等诸多威胁人类生存的难题上成为关键技术和支柱产业.

四、植物基因工程的主要环节有哪些？每个环节的主要任务是什么？
１、从供体生物分离克隆目标基因  
(1） 目标基因的遗传学研究、分子标记定位，或目标基因编码蛋白的纯化与测序； 
（2）构建基因组或ｃDNＡ文库； 
（3） 获得目标基因的探针或引物信息； 
（4） 标记探针,筛选文库获得目标基因，或直接通过PCR扩增目标基因; 
（5）目标基因克隆到质粒载体，转化大肠杆菌,目标基因的测序和分析；
（6）目标基因及其编码蛋白的进一步功能验证和分子鉴定。
２、构建工程载体
（1）采用特定的限制酶切割，从克隆载体上切下并回收目标基因;
（2）选取合适的转基因载体，并完成启动子、终止子等元件的亚克隆装载；
(3）采用相同的限制酶切割载体，使其末端与目标基因的末端相匹配;
(4)将目标基因与载体进行连接，形成重组表达载体。
3、转化大肠杆菌和重组载体的分子鉴定
(１）制备大肠杆菌感受态细胞;
(2）将重组载体转化大肠杆菌;　
（3)通过抗生素筛选获得大肠杆菌阳性菌落;　
（4）通过PＣR、限制酶切图谱分析、测序验证等，确认重组载体.
4、植物转化
一般采用农杆菌介导的二元载体转化法，将含有目标基因的T-DＮＡ片段导入受体植物细胞中，并整合到其染色体上；或采用基因枪法,直接将含有目标基因的ＤNA转化受体植物的器官；或采用病毒接种侵染方式,将目标基因转化受体植物的活体植株。针对标记基因进行筛选,通过组织培养获得再生植株,或收获活体转化母株上的种子。
5、鉴定和筛选转基因植株
（1)对再生植株进行分子鉴定,如PCR扩增、GＵＳ染色或GFＰ荧光检测和Southern杂交检测,得到确认外源基因转入并整合的阳性植株;
（２)对阳性植株进行ＲT－ＰＣR、Nｏrｔhern杂交、Westeｒn杂交等检测，得到外源基因高水平表达的转基因植株；　
(３)对转基因植株进行生物学鉴定与检测，确认背景性状是否改变和目标性状的改良程度，选择和保留最符合要求的转基因植株；
(4）繁殖转基因植株,并跟踪进行分子检测和生物学检测,获得目标性状和背景性状均稳定遗传的株系。
6、 转基因植物的安全性评价和产业化
（1）中间试验：向国家申请，在控制系统内或者控制条件下进行小规模试验,并取得合格。
（2)环境释放：向国家申请,在自然条件下采取相应安全措施进行中规模的试验,并取得合格。
（３)生产性试验：向国家申请,在生产和应用前进行较大规模的试验，最终取得安全证书.
（4)大规模推广种植转基因植物。

五、结合植物基因工程的实际应用，谈谈发展植物基因工程的潜力,及植物基因工程发展中应注意的问题。
１、21世纪植物基因工程的发展前景将是非常美好和令人鼓舞的.从研究进展和发展趋势来看，其热点将突出表现在以下几个方面：
（１）对基因功能的认识
目前，许多国家纷纷投入巨资针对主要的农作物(如水稻)构建其突变体库,然后利用转座子标签（Ｔｒａｎsposｏn taggiｎg）、T—ＤNA标签(Ｔ ＤNA ｔaｇginｇ)或图位克隆（ｍap ｂaｓed　clｏniｎｇ）技术分离和克隆基园，完成对基因功能的认识，从而全面获得功能性新基因并占有新基因的知识产权.现在，谁先了解基因的功能，谁就拥有了该基因的知识产权。因此，世界各国对基因的争夺日趋白热化。
（2）单基因抗性向多基因抗性转化
分子标记辅助选择育种可以实现多种基因的累加，将不同的抗性基因组合到同一品种中,培育出多抗或广谱的种质或品种。
（3)品质性状改良
包括：水果蔬菜的延熟保鲜；有益于健康的植物油（如不饱和脂肪酸）；增加营养价值（如维生素）；富含抗癌蛋白质的大豆;高营养的饲料(如高赖氨酸、表达植酸酶的玉米)；作物加工品质、外观、蒸煮食味品质和营养品质等方面。
（4）由质量性状向数量性状的转移
目前，科学家们正在通过分子标记等技术寻找与重要数量性状（如产量、品质等)相关的数量性状基因座(ＱＴL）,最终有可能通过育种程序将这些ＱTL集中起来加以利用。作物大多数重要的农艺性状均表现为数量遗传的特点，如产量、熟性和品质等。数量性状是传统育种的难点,是育种效率的重要制约因素。近年来,由于分子标记技术的迅速发展特别是完整遗传连锁图谱的建立，人们能够将数量性状分解成易为遗传育种工作者操作的单个位点即QTL进行研究。
（５)转基因技术的改进与提高
目前,在植物基因工程研究中还存在许多技术问题，如受体系统中普通存在的转基因沉默、转化频率低、转化植株后代遗传不稳定、转基因工程作物的生态风险性以及操作简便，费用低廉的转化系统的研制等，这将是今后基因工程研究中的热点问题。
2、植物基因工程发展中应注意以下问题:
(1）安全性问题,即转入的某一特性对最终产品使用的影响,特别是作为食品，对人体有无不良影响。
(2）转基因 DＮA的移动性,即这种 ＤNA是否会转至其他作物或杂草,因而引起环境及生态问题。
（3)对其他农业措施的后效应，对发展中国家农业及农产品出口的影响等。
(4)公众的接受性,即心理因素。

基因工程原理
内容提要
1. 基因工程又称基因操作、重组DNＡ技术， 是P. Ｂerg等于１9７2年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”.该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达.　
2. 基因工程中使用多种工具酶,包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。　
3. 限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶,属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类.Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小,专一性强,切割的方式有平切和交错切， 作用时需要Mg＋＋作辅助因子,　但不需要ATP和SAM。第一个被分离的Ⅱ类酶是Hｉnd　Ⅱ。　
4. 连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶,有DNA连接酶和RＮA连接酶之分。基因工程中使用的连接酶来自于原核生物,有两种类型的ＤNA连接酶∶E．coｌiDNＡ连接酶和Ｔ4－ＤNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E．cｏli中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5. 载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒ＤNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6. DＮA重组连接的方法大致分为四种： 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法.粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法，是指具有相同粘性末端的两个双链ＤNA分子在DNＡ连接酶的作用下,　连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T４ DNA连接酶的作用下,　将两个具有平末端的双链ＤNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端， 外源DＮA和载体DＮA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dＡ（dG）和dT(ｄC）, 然后在ＤNA连接酶的作用下， 连接成为重组的DＮA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段， 但方法较繁， 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列)， 加到载体或外源ＤNA的分子上，　然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。
7. 基因文库分为基因组文库、cDNA文库等,是指在一种载体群体中,　随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段，　理想地包含着该物种的全部遗传信息。
8. DNA重组分子在体外构建完成后,必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组ＤＮA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是ＣａCl２ 法(图３－20），此外也可以用基因枪等方法转化外源ＤＮA。
9. 重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等.
10. 基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景,并形成了一大批生物技术产业.

基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA分子)，按预先设计的蓝图,在体外构建杂种ＤＮA分子,然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品;或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。 基因工程技术诞生于２0世纪７０年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃,证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代. 基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一,基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。
第一节 基因工程技术的诞生
基因工程又称基因操作（geｎe mａniｐｕlatｉｏn），　重组DＮA（rｅcomｂinａnt DNＡ）技术，　是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。
一、基因工程技术的诞生
1972年，P.。　Berg等在PＮAS上发表了题为∶“将新的遗传信息插入SV40病毒DNA的生物化学方法: 含有λ噬菌体基因和　E.cｏli 半乳糖操纵子的环状 SV４0DＮＡ”，标志着基因工程技术的诞生。 ＳV40病毒是猿猴病毒,是一种直径为４50的球形病毒,分子量为２8×１06道尔顿。ＳV40的DNA是环状双链结构，全长５24３个碱基对，编码三个衣壳蛋白VＰ1、VP2、VP3和一个T抗原。SＶ40DNA上有一个限制性内切酶Ｅ.cｏRⅠ的切点. Berｇ等首先用化学方法构建了一个二聚体的环状SV40DNA（图３—１）。

图３—1 重组的SV４0二聚体的构建（引自 Berg　et. aｌ，1972）
当时所用的连接方法是同聚物谱尾法，重组体的鉴定主要是通过电子显微镜比较分子量大小. 当获得二聚体SV40DNA后,Ｂerｇ等就证明了环状DNＡ被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从　λｄvgal　DＮＡ中制备含有 E．coli 的半乳糖操纵子DNＡ，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功. Bｅｒg等的工作是人类第一次在体外给遗传物质动手术，标志着一个新时代的到来,为此他获得了１98０年诺贝尔化学奖.
二、基因操作的基本过程　和特点
基因工程的操作可用图3-2表示∶

图３-２ 基因工程的基本过程（引自Oｌd ＆ Primrｏse,1９80）
它所涉及的过程可用“分（合成)、 切、连、转、选、鉴”六个字表示。
分(合成)∶指DNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。分离制备或合成制备DNA的方法都有很多种。
切∶即在体外将DＮA进行切割,使之片段化或线性化。　
连∶即在体外将不同来源的ＤNA分子重新连接起来,构建重组ＤNA分子.　
转∶即将重组连接的DＮA分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达.
选∶从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；
鉴∶就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定,因为有些重组体并非是所需要的,必需通过分析鉴定.　
基因工程有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。遗传重组是生物进化的推动力，自然界中发生的遗传重组主要是靠有性生殖。基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作,构建在生物体内难以进行的重组,然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞,让其在宿主细胞中进行工作。这实际上是进行无性繁殖,即克隆，所以基因工程通常有称为基因克隆。

第二节　限制性内切核酸酶
外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给ＤＮA分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。基因工程中使用的工具酶很多,包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DＮA合成与修饰的酶类，最重要的是限制性内切核酸酶。基因工程上把那些具有识别双链DＮA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割ＤNＡ双链结构的核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。
一、限制性内切核酸酶的发现
1９5２年Luria、Human在T偶数噬菌体、１９５3年ｗｅigle、Bertanｉ在　λ　噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限