第39讲-基因工程.docx

第39讲基因工程课时强化训练测控导航表练透基础知识点题号1.基因工程的基本工具12.基因工程的基本操作程序及应用3,43. PCR技术及DNA的粗提取与鉴定24.蛋白质工程55.综合考查6, 7,81. （2020 -江西南昌一模）质粒A和质粒B各自有一个限制酶EcoR I 和限制酶BamH I的识别位点，两种酶切割DNA产生的黏性末端不同。 限制酶EcoR I剪切位置旁边的数字表示其与限制酶BamH I剪切部 位之间的碱基对数（bp） o在含有质粒A和B的混合溶液中加入限制酶 EcoR I和BamH I ,令其反响充分;然后，向剪切产物中加入DNA连接 酶进行反响，再将其产物导入大肠杆菌中。（实验中不考虑:无ori的 质粒;拥有两个或以上ori的质粒;两个或以上质粒同时进入大肠杆 菌;三个或以上DNA片段发生连接）请回答以下问题。(1) 人t -PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACAo丝氨酸的密码子为UCU,突变基因中对应该氨基酸密码子的碱基序列应设计 为o(2) 上述获得突变目的基因的基本途径是如下图t -PA突变基因、质粒，用限制酶切割较好。(3) 将相应的重组质粒导入大肠杆菌中，含t -PA突变基因的细胞应具有的性状是o(4) 上述生物工程技术是以为基础的，首先通过,再以满足医疗需求的。解析：(1)人t -PA基因第84位半胱氨酸的模板链碱基序列为ACA,根 据转录过程碱基互补配对原那么，丝氨酸的密码子为UCU,那么其模板链编 码序列为AGA,要将t -PA基因第84位的半胱氨酸换成丝氨酸，故突 变基因中对应该氨基酸密码子的碱基序列应设计为AGA。(2) 蛋白质工程的基本途径:从预期的蛋白质功能出发一设计预期的 蛋白质结构一推测应有的敏基酸序列一找到相对应的脱氧核昔酸序 列(基因)。由于目的基因的两端的碱基序列分别是CCGG、CTAG,所以应用Xma I和Bgl II两种限制酶切割，以便于把目的基因连接到质粒上。(4) 由图可知，将连接好的DNA分子导入大肠杆菌中，由于限制酗切割 质粒破坏了 mlacZ基因，所以含t -PA突变基因重组DNA分子的细胞 应具有的性状是具有新霉素抗性且呈白色。(5) 蛋白质工程是指以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系 作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造,或制造 一种新的蛋白质，以满足人类的生产和生活的需求。答案：(1)AGA从预期的蛋白质功能出发-设计预期的蛋白质结构一推测应有的 氨基酸序列一找到相对应的脱氧核昔酸序列(2) Xma I Bgl II具有新霉素抗性且呈白色(3) 蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系基因修饰或基因 合成 对现有蛋白质进行改造或制造新的蛋白质训练素能6. (2020 湖南师大附中月考)CRISPR/ Cas9系统广泛存在于原核生 物基因中，是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获 得性免疫防御机制。CRISPR/ Cas9技术为一种基因治疗法，这种方法 能够通过DNA剪切技术治疗多种疾病。该技术的实质是用特殊的引导 序列(sgRNA)将Cas9酶“基因剪刀”精准定位到所需切割的基因上， 然后进行编辑。科研人员设想利用新一代基因编辑技术可拯救失明小 鼠。回答以下问题。(1) Cas9酶“基因剪刀”，又称,动植物细胞中没有编码Cas9酶的基因，可通过构建,用技术将其导入受体细胞最终表达出Cas9酶。小鼠失明的原因是其T细胞受损，免疫系统功能低下，利用 CRISPR/ Cas9技术进行基因编辑,选择性地敲除细胞基因中一种编码 PD-1蛋白的基因，从而将T细胞潜在的对肿瘤细胞的攻击能力“激活”。 在体外进行T细胞培养扩增后，再输回患者体内，用T细胞去攻击肿瘤 细胞到达预期的治疗目的。为有效阻止新分化生成的T细胞受损，科 研人员将sgRNA序列导入骨髓细胞中，以构建sgRNA一Cas9酌复合体。Cas9酶可以催化键断裂，以实现对DNA序列的定向切割。设计sgRNA序列需要弄清目的基因的核苜酸序列，原因 是o为检测T细胞的目的基因是否成功被编辑，采用技术检测是否含有目的基因，还需要对进行检测。解析：由Cas9酶“基因剪刀”可知该酶是限制性核酸内切酶(简称 限制酶)，动物细胞中没有编码Cas9酶的基因，可通过构建基因表达 载体，用显微注射法将其导入受体细胞，最终表达出Cas9酶。(2) T细胞来自造血干细胞，因此应将sgRNA序列导入骨髓造血干细胞 中，以构建sgRNA一Cas9酶复合体，由此形成的T细胞攻击肿瘤细胞的 能力被激活；Cas9酶是实现对DNA序列的定向切割。可以推测该酶催 化磷酸二酯键断裂,sgRNA序列需要与目的基因上局部碱基互补配对， 从而精准定位到目的基因进行编辑，故设计sgRNA序列时需要根据目 的基因的核昔酸序列进行设定。(3) 检测是否含有目的基因可采用DNA分子杂交技术，为了检测基因 编辑是否成功，还需要对目的基因表达的蛋白进行检测。答案：(1)限制性核酸内切酶(限制嗨)基因表达载体 显微注射造血干 磷酸二酯sgRNA序列需要与目的基因上局部碱基互补 配对,从而精准定位到目的基因进行编辑(2) DNA分子杂交 目的基因表达的蛋白长春花是原产于非洲东海岸的野生花卉，其所含的氏春碱具有良好 的抗肿瘤作用。基因tms的编码产物能促进生长素的合成，科研人员 利用基因tms构建重组Ti质粒，对愈伤组织进行遗传改造，解决了长 春碱供不应求的问题，操作流程如下。请回答以下问题。过程是指,过程多采用的方法是o(2) 假设从基因文库中获得基因tms,(填“基因组文库”或“cDNA文库”)中获取的基因含有启动子，启动子的功能是o作为载体的Ti质粒应含有,用于筛选含目的基因的细胞。(3) 用PCR技术扩增目的基因，目的基因DNA受热变性后解链为单链,与单链相应互补序列结合,然后在 的作用下延伸，如此重复循环。(4) 长春碱杀死癌细胞的同时对正常细胞也有毒性作用，为降低长春 碱对正常细胞的毒性，可以利用制备技术制成“生物导弹”进行靶向治疗。解析：(1)外植体通过脱分化形成愈伤组织，把重组Ti质粒导入植 物细胞常用农杆菌转化法。(2) 局部基因文库是利用RNA反转录形成的，不含启动子，基因组文库 含启动子。启动子是RNA聚合酶结合的位点，启动转录过程。载体需 要含有标记基因，可以用于筛选含目的基因的细胞。(3) PCR中，第一步高温变性，翻开双链;第二步，让引物与模板链结合; 第三步进行子链的延伸。该过程需要耐高温的DNA聚合酶参与。(4) 单克隆抗体特异性强，可以识别特定的抗原，故可以制成“生物导 弹”，把长春碱定向运输到癌细胞部位杀死癌细胞，降低副作用。答案：(1)脱分化 农杆菌转化法基因组文库 驱动目的基因转录出mRNA标记基因引物(耐高温的)DNA聚合酶(Taq酶)单克隆抗体7. (2020 湖北黄冈中学二模)I.某地因疫情变化管控升级,对境外 或国内疫情重点地区来的人员，一律实行“14天集中隔离医学观察+14 天居家隔离医学观察+2次核酸检测+1次血清抗体检测”的管控措施, 做到凡进必检、不漏一人、万无一失。II .中国率先开启新冠疫苗二期临床研究，据研究新冠病毒外表的S 蛋白是主要的病毒抗原，在康复病人的血清中有抗S蛋白的特异性抗 体。如图为某机构研制疫苗的局部过程。请回答以下相关问题。选择性扩增.-* RNADNA*S的表休州1一导Aift 奔动钏* 细胞对疫情重点地区输入人员进行核酸检测需要用到标记的目的基因做探针,进行血清抗体检测的方法是选择性扩增S基因需要的前提条件及原因是(1) 图示过程用到的酶有.(写出4种)，表达载体导入到动物细胞常用的方法是(2) S基因在培养的动物细胞中稳定遗传的关键是为了检验步骤所表达的S蛋白是否与病毒S蛋白有相同的免疫 反响特性，可用动物细胞中表达的S蛋白与进行杂 交实验，从而得出结论。解析：(1)对人体进行核酸检测的时候，基因探针技术依据碱基互补配 对原那么，-般探针要用放射性同位素(或荧光素)标记,这样可以显示 杂交带;血清抗体检测依据抗原与抗体的特异性结合,方法为抗原一 抗体杂交。(2) 选择性扩增S基因一般使用的技术为PCR技术，该技术扩增的前提 条件为S基因核昔酸序列，根据这一序列可以合成引物。(3) 由题干可知,该技术涉及到RNA的逆转录过程、PCR技术、基因表 达载体的构建等，需要的酶有逆转录酶、Taq酶、限制酶和DNA连接 酶;将重组质粒导入到动物细胞的常用方法为显微注射法。(4) S基因要在动物细胞中稳定遗传,需要将S基因整合到细胞核中的 DNA分子中。(5) 一般检测S蛋白的产生需要使用抗原一抗体杂交技术，可用S蛋白 与曾经感染但已经康复的病人血清进行杂交实验，该个体的血清中有 抗病毒S蛋白的抗体,从而验证结论即可。答案：(1)用含放射性同位素(或荧光素)抗原一抗体杂交找到S基因核苜酸序列，以便根据这一序列合成引物(2) 逆转录酶、Taq酶、限制酶和DNA连接酶 显微注射法S基因需要整合到细胞核中的DNA分子中(3) 康复病人血清RamH IBamH Iamp 质粒A3 000bp lc质粒BamponI 000 EcoR Ion 2 500EcoR IOri质粒复制原点tet四环素抗性基因amp氮不育毒素抗性基因gfp基因产物在紫外线照射下可发出绿色荧光lac基因控制合成的半乳精昔稿可以水解乳糖只拥有质粒A的大肠杆菌(填“可以”或“不可以”)在 含有氨茉青霉素及乳糖作为唯-碳元素来源的培养基中生存?说明理由(2) DNA连接酶进行反响后，存在种大小不同的质粒，有种质粒使大肠杆菌能够在含有氨苯青霉素及乳糖作为唯一碳源的培 养基中生存。(3) 绿色荧光蛋白基因是标记基因的一种，该标记基因的功能是o质粒导入大肠杆菌通常要用处理，其作用是O解析：(1)由图中质粒A可知，只拥有质粒A的大肠杆菌可以在含有氨 茉青霉素及乳糖作为唯一碳元素来源的培养基中生存，因为质粒A含 有氨节青霉素抗性基因，使大肠杆菌能够在含有氨茉青霉素的培养基 中生存，还含有半乳糖昔酶基因，使大肠杆菌能合成半乳糖甘酶，并水 解乳糖获得能量和碳源。(2) DNA连接酶进行反响后，由于实验中不考虑:无ori的质粒;拥有两 个或以上ori的质粒;两个或以上质粒同时进入大肠杆菌;三个或以 上DNA片段发生连接，因此可存在4种大小不同的质粒,即质粒A两个 片段连接3 000 bp (2 000 bp+1 000 bp)、质粒A含ori的片段和质 粒B不含ori的片段连接4 500 bp (2 000 bp+2 500 bp)、质粒A不 含ori的片段和质粒B含ori的片段连接4 000 bp(l 000 bp+ 3 000 bp)、质粒 B 两个片段连接 5 500 bp (3 000 bp+2 500 bp),有 2种质粒使大肠杆菌能够在含有氨茉青霉素及乳糖作为唯一碳源的培 养基中生存,即质粒A两个片段连接3 000 bp和质粒A不含ori的片 段和质粒B含ori的片段连接4 000 bp的质粒。(3) 标记基因的功能是供重组DNA的选择和鉴定。质粒导入微生物细胞用感受态细胞法，用C!处理大肠杆菌，增加 细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理 状态。答案：(1)可以 质粒A含有氨节青霉素抗性基因，使大肠杆菌能够在 含有氨节青霉素的培养基中生存，还含有半乳糖昔酶基因，使大肠杆 菌合成半乳糖昔酶,并水解乳糖获得能量和碳源4 2(2) 供重组DNA的选择和鉴定Ca2+使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态2. (2020 -山东济宁三模)新型冠状病毒(2019-nCoV)的核酸检测使用 逆转录PCR技术。将待测样本处理后，先将样本RNA逆转录成cDNA, 再以cDNA为模板进行扩增。请据此回答以下问题。(1) 样本RNA逆转录成cDNA的原料是。(2) 逆转录PCR反响中使用的DNA聚合酶是从水生栖热菌中别离提取,该DNA聚合酶优势在于o(3) 下表是用于2019-nCoV的cDNA扩增的两种引物序列。引物名称引物序列(5 3)引物1TTCG引物2TCAC引物1对应的模板链序列(3 5,)为。 如图为cDNA的局部序列，引物1和引物2对应的位置是(填 I、IV” 或 “II、III” )olllllllillllllliPCR技术获取目的基因的优势是目前(填“能”或“不能”)利用2019-nCoV的遗传物质作为基因工程的载体，请说明原因解析：(1)合成DNA的原料是四种游离的脱氧核糖核苜酸，因此逆转录过程中需要四种脱氧核糖核昔酸为原料合成cDNAo(2) 传统的DNA聚合酶高温易变性，水生栖热菌在热水器等高温环境 下仍能存活，因此从该菌别离提取出的DNA聚合酶具有耐高温的优势。(3) 根据表中引物的信息可知，结合碱基互补配对原那么，引物1对应 的模板为:AAGCo由于DNA聚合酶都是从宁 端到3,端延伸子链，因此引物应结合到 模板的3端，即图中的II和III。(4) PCR技术的优势为:特异性强、灵敏度高、操作简便、省时、可在 体外大量复制DNA片段。因此PCR技术获取目的基因的优势是可大量 扩增目的基因。(5) 因为载体的作用是将目的基因导入受体细胞，而细胞生物的遗传 物质是DNA,不是RNA,因此目的基因无法整合到2019-nCoV的遗传物 质RNA上,且RNA无法在细胞中稳定存在，因此不能利用2019-nCoV的 遗传物质作为基因工程的载体。答案：(1)四种脱氧核糖核昔酸耐高温(2) AAGC II、III可大量扩增目的基因(3) 不能2019-nCoV的遗传物质是RNA,细胞生物的遗传物质是DNA, 目的基因无法整合到2019-nCoV的遗传物质上，且RNA无法在细胞中 稳定存在(2020 广东广州联考)探针是指以放射性同位素、生物素或荧光染 料等进行标记的核昔酸序列的核酸片段，可用于核酸分子杂交以I I I I r ACTCG检测目标核昔酸序列是否存在。如图所示是某实验小组制备的两种 探针，图是探针与目的基因杂交的示意图。请回答以下有关问题。探针2 I T T 1 r CCACT(D（1）核酸探针与目标核昔酸序列间的分子杂交遵循设计核昔酸序列是核酸探针技术关键步骤之一。图所示的两种核酸 探针（探针2只标注了局部碱基序列）都不合理，原因是探针1,导致特异性差;而探针2 ,会导致探针失效。（2）cDNA探针是目前应用最为广泛的-种探针。制备cDNA探针时，首先需提取、别离获得作为模板，在的催化下合成cDNA探针。利用制备好的8-珠蛋白基因的cDNA探针与B-珠蛋白基因杂交后，出现了如 图中甲、乙、丙、丁所示的“发夹”结构，原因是o探针常用于基因工程的检测，例如基因工程中利用乳腺生物反响 器生产Q -抗胰蛋白酶，应将a _抗胰蛋白酶基因与的启动子重组在一起，导入哺乳动物的中，再利用SRY基因（Y染色体上的性别决定基因）探针进行检测，将检测反响呈 （填“阳”或“阴”）性的胚胎进行移植培养。解析：（1）核酸探针是单链DNA分子，其与目标核昔酸序列间的分子杂交遵循碱基互补配对的原那么。图中探针1碱基序列过短，特异性差;探针2会因自身折叠出现局部碱基互补配对而失效。因此这两种探针 都不合理。(2) cDNA是以mRNA为模板逆转录形成的，该过程需要逆转录酶的催化。逆转录法合成的cDNA不含内含子，而8 一珠蛋白基因中含有不表达序 列，因此探针利用制备好的B 一珠蛋白基因的cDNA探针与B蛋白基因杂交后，出现了图2中甲、乙、丙、丁所示的“发夹”结构。(3) 利用乳腺生物反响器生产Q 一抗胰蛋白酶时，应将ci 一抗胰蛋白酶 基因与在乳腺中可以表达的基因一一乳腺蛋白基因的启动子重组在 一起，将构建好的重组DNA导入哺乳动物的受精卵中，再利用SRY基因 探针进行检测，检测反响呈阴性的胚胎为雌性。答案：(1)碱基互补配对原那么 碱基序列过短 自身会出现局部碱基 互补配对(2)mRNA逆转录酶P妹蛋白基因中含有内含子乳腺蛋白基因受精卵阴(2020 河北保定一模)地中海贫血症是一种高发的基因遗传病，患 者除了需要输血缓解病症之外，常见治疗手段是进行异体骨髓移植。 目前科学家正在研究利用生物工程技术将患者的体细胞转化为多能 干细胞，以获得用于自体移植的细胞,具体操作过程如图。-慢病毒疆体构建/XX2WX + (裁体) #达政今I1目的某世切*J目的基因n一罕球+ O影-.痹包装体 包装胡丽慢M毒造宣条件下培芥多能干细胞(1) 异体骨髓移植治疗的局限性主要是发生反响。图中所 用生物工程技术没有该局限性,其变异原理是O分析生物工程操作过程并回答。I :基因表达载体含有目的基因、启动子、终止子等。其中启动子是 的部位。慢病毒表达载体所含的目的基因 是病毒经形成的cDNA片段，该片段帮助外源基因整合到宿 主细胞染色体DNA上，使外源基因稳定表达。II :由图可知，将导入包装细胞，一段时间后可以获 得能够转化患者多能干细胞的慢病毒颗粒。山：为了便于筛选出成功转化的多能干细胞,其中的载体 含有易检测的标记基因。(2) 理论上在获得成功转化的多能干细胞后，需要诱导其定向分化 为,然后植入患者骨髓。该方法虽然操作复杂，但效果较 为可靠，称为治疗。解析：(1)地中海贫血症患者常见的治疗手段是进行异体骨髓移植，它 的局限性主要是移入的骨髓易被机体识别为抗原而发生免疫排斥。图 中所用生物工程技术主要为基因工程，其变异原理是基因重组。I :启动子位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位。慢 病毒表达载体所含的目的基因是病毒经逆转录形成的cDNA片段，该 片段帮助外源基因整合到宿主细胞染色体DNA上，使外源基因稳定 表达。II:由图可知，要将包装载体和表达载体一起导入包装细胞，一段时间 后可以获得能够转化患者多能干细胞的慢病毒颗粒。III:为了便于筛选出成功转化的多能干细胞，其中表达载体含有易检 测的标记基因。(3)由于干细胞在体外培养时一般只分裂不分化，因此在获得成功转 化的多能干细胞后，需要诱导其定向分化为造血干细胞，然后植入患 者骨髓。该方法是在体外改造基因并转移到体内的治疗方式,称为体 外基因治疗。答案：(1)免疫排斥 基因重组(2)RNA聚合酶识别和结合逆转录表达载体和包装载体表达 (3)造血干细胞体外基因3. (2020 河南开封一模)人t -PA蛋白能高效溶解血纤维蛋白凝聚的 血栓。用传统基因工程生产的t -PA给心梗患者大剂量注射却会诱发 颅内出血,原因在于其与血纤维蛋白结合的特异性低，但假设将其第84 位的半胱氨酸换成丝氨酸，就能显著降低出血副作用。据此，科学家对 人t -PA基因进行序列改造，再采取传统的基因工程方法表达该突变基因，制造出了高性能的t -PA突变蛋白。限制酵识别序列和切割位点-p人突变基因CCGGNhe ICCTAGCSma ICCCGGGXma ICCCGGGned新束抗性基因Bgl n正 ATCTmlacZ表达产物会把细胞 染成蓝色，否那么为白色】CTAGSma I Xma I