基因工程选择题题库-很全.doc

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2． 第一个作为重组ＤＮA载体的质粒是(　)
(a）pＢR322 (b）CｏlEｌ （ｃ)pＳCl０1 （d）pUCl８
3. 关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有( ）不太恰当。
(a)由作用于同一ＤNA序列的两种酶构成
（b)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶
(c）这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰
（d）不同的宿主系统具有不同的限制—修饰系统
４。Ⅱ型限制性内切核酸酶： ( ）
(a)有内切核酸酶和甲基化酶活性且经常识别回文序列
(ｂ)仅有内切核酸酶活性,甲基化酶活性由另外一种酶提供
（c）限制性识别非甲基化的核苷酸序列　（d)有外切核酸酶和甲基化酶活性
（e)仅有外切核酸酶活性，甲基化酶活性由另外一种酶提供
5。下面有关限制酶的叙述哪些是正确的？( )
（a)限制酶是外切酶而不是内切酶
(b）限制酶在特异序列（识别位点）对ＤNA进行切割
(c）同一种限制酶切割DＮＡ时留下的末端序列总是相同的
(d）一些限制酶在识别位点内稍有不同的点切割双链DNA，产生黏末端
（e）一些限制酶在识别位点内相同的位臵切割双链ＤＮA，产生平末端
６。第一个被分离的Ⅱ类酶是:　( )
(a）ＥcｏK　(b）HindⅢ　(ｃ）ＨiｎｄⅡ　(d)EｃｏB
7.在下列进行DＮA部分酶切的条件中，控制那一项最好？( )
(a）反应时间 （b）酶量 (c)反应体积　（d)酶反应的温度
8。在下列试剂中,那一种可以螯合Cａ2＋离子?（　）
(a）EDＴＡ (b）柠檬酸钠 (c)SＤS （d)EGTA
９．在下列工具酶中,那一种可以被EGＴA抑制活性？( ）
(a)Ｓ１单链核酸酶 (b）末端转移酶 （c）碱性磷酸酶 (d)Bal 31核酸酶
10.限制性内切核酸酶可以特异性地识别: ( ）
（a)双链DNA的特定碱基对 （b）双链DNA的特定碱基序列
（ｃ）特定的三联密码 （d)以上都正确
1１．下列关于限制性内切核酸酶的表示方法中，正确一项的是（ ）。
(a）Sａu3A Ｉ （b)E．cｏRI （c）ｈind ＩIＩ （d)Sａｕ 3Ａ１
12．限制性内切核酸酶的星号活性是指：（　）
(a）在非常规条件下,识别和切割序列发生变化的活性。 （b）活性大大提高
(c）切割速度大大加快　(d）识别序列与原来的完全不同
１3．下面哪一种不是产生星号活性的主要原因?( )
(ａ)甘油含量过高 （ｂ）反应体系中含有有机溶剂
（c)含有非Mg２+的二价阳离子　（d）酶切反应时酶浓度过低
14.关于宿主控制的限制修饰现象的本质，下列描述中只有（ )不太恰当
（a)由作用于同一ＤNA序列的两种酶构成
(ｂ)这一系统中的核酸酶都是Ⅱ类限制性内切核酸酶
(ｃ)这一系统中的修饰酶主要是通过甲基化作用对DNA进行修饰
(d）不同的宿主系统具有不同的限制－修饰系统
15．在长模板链的指导下引物延伸合成长的DNＡ互补链时应选用( ）
(a)T4DＮA聚合酶　（ｂ）Klenow酶.
（c）大肠杆菌ＤNA聚合酶I (ｄ）T7DNA聚合酶
16。末端转移酶是合成酶类，（ ）
(a)作用时不需要模板
2+ （b)在Ｃa的存在下，可以在突出的３，末端延长DNＡ链
2+ （ｃ）在Ca的存在下，可以在隐蔽的３,末端延长DNＡ链
（ｄ）上述说法有两种是正确的
１７。在基因工程中，可用碱性磷酸酶（ )
（ａ)防止DNA的自身环化 （b)同多核苷酸激酶一起进行DＮＡ的5,末端标记 (c）制备突出的３,末端 (d)上述说法都正确
１８。下列酶中,除( )外都具有磷酸酶的活性
(a）λ核酸外切酶　（b)外切酶Ⅲ　（ｃ）单核苷酸激酶 (d）碱性磷酸酶
19。 下列哪一种酶作用时需要引物? (　）
（a)限制酶　（b）末端转移酶 (c)反转录酶　(d）DＮA连接酶
20．Ｓ1核酸酶的功能是（ )
（a）切割双链的DNA (b）切割单链的RNA （ｃ)切割发夹环 (ｄ)以上有两项是正确的
２1．Kｌeｎow酶与DNＡ聚合酶相比，前者丧失了（　)的活性。
（a）5，—-3,合成酶， (b）３，－-5，外切酶　(ｃ）5，－—-3，外切酶　(d)转移酶
22. 下面关于松弛型质粒（reｌaxｅd ｐlａsｍid)性质的描述中，( )是不正确的 （a）质粒的复制只受本身的遗传结构的控制,而不受染色体复制机制的制约， 因而有较多的拷贝数
（b）可以在氯霉素作用下进行扩增　(ｃ）通常带有抗药性标记
(d）同严紧型质粒融合后,杂合质粒优先使用松弛型质粒的复制子
23。 基因工程中所用的质粒载体大多是改造过的,真正的天然质粒载体很少，在下列载 体中只有( )被视为用作基因工程载体的天然质粒载体
（ａ）ｐＢR322 （b）pSCl01 （c)pＵBll0 （d）pＵCl８
２4。　下列哪种克隆载体对外源DNＡ的容载量最大?（ )
(a)质粒 (b)黏粒 （c)酵母人工染色体(ＹＡＣ) (d) ？噬菌体　（e) cDNA表达载体
２5.　松弛型质粒:　（ )
（a)在寄主细胞中拷贝数较多 （ｂ）可用氯霉素扩增
(ｃ）一般没有选择标记 （d）上述（a）、（b）两项正确
26．Col El是惟一用作基因工程载体的自然质粒，这种质粒： （ ）
（a）是松弛复制型 （b)具有，四环素抗性
（ｃ）能被氯霉素扩增 （d)能产生肠杆菌素
2７．同一种质粒ＤNＡ，以三种不同的形式存在,电泳时,它们的迁移速率是：(　) (a)ＯCDNA>SCDNA＞ＬDＮA (ｂ)SCＤＮＡ>LDNA〉ＯCDＮA
(c)ＬDNA>OCＤＮA〉SCDNA　（d）SＣＤNA>ＯCDNA>LDNA
2８．pBＲ322是一种改造型的质粒，含有两个抗性基因,其中四环素抗性基因来自: ( )　(a)ColEl (b)Ri质粒 （c）ｐＳCl0１ (d）pUCl8
29.关于穿梭质粒载体，下面哪一种说法最正确？（ ）
（ａ）在不同的宿主中具有不同的复制机制
(b）在不同的宿主细胞中使用不同的复制起点
(c）在不同的宿主细胞中使用不同的复制酶
(d)在不同的宿主细胞中具有不同的复制速率
３０．能够用来克隆３2kｂ以下大小的外源片段的质粒载体是( ）
（a)charomid　(b）plasmid （Ｃ）coｓmiｄ （d)pｈagemid
3１．第一个作为重组DNA载体的质粒是( ）
（a)ｐBＲ32２ （b）ColＥl　(ｃ）ｐＳCl０１ (d)pUＣｌ８
32。 Ti质粒:（ ）
(a)可从农杆菌转到植物细胞中 （b)作为双链ＤNA被转移
（c)在植物中导致肿瘤 (d）介导冠瘿碱的合成，作为细菌的营养物和植物的生长激素 (ｅ）需要细菌的ｖir基因帮助转移 (f)在植物细胞中作为染色体外质粒
33。黏粒（ｃoｓmiｄ)是一种人工建造的载体，（ )
(a)它具有ＣOS位点，因而可进行体外包装　（ｂ）它具有质粒DＮＡ的复制特性　(ｃ)进入受体细胞后，可引起裂解反应　(d）进入受体细胞后，可引起溶源化反应
3４。有两种确定核酸中核苷酸序列的方法：化学序列分析法（Mａxaｍ-Glbｅｒt）和酶学序列分析
法（Sanger）.酶学测序法的基本原理／优点是：(　）
（a）碱基与特殊染料间不同的相互作用
（ｂ)一个合成引物的延伸和ＤNA修复合成的可靠终止
（ｃ）限制性位点与DＮＡ末端标记的相关性
(d）可同时对ＤＮA双螺旋的两条链进行测序
（ｅ)反应是DＮA特异的,RＮＡ不会带来干扰。这样既减少纯化步骤，也节约了开支。
35。关于ｃＤＮＡ的最正确的说法是：（ ）
(ａ)同mRNＡ互补的单链ＤNＡ （b）同mRNA互补的双链DＮA
（c）以mRＮA为模板合成的双链DNＡ　（d)以上都正确
36。用碱法分离质粒DNA时，染色体DNA之所以可以被除去，是因为:（　)
(a)染色体DNA断成了碎片 （ｂ)染色体DNA分子量大，而不能释放
（c)染色体变性后来不及复性 （d)染色体未同蛋白质分开而沉淀
3７． 关于碱解法分离质粒DNA，下面哪一种说法不正确?(　）
（a)溶液I的作用是悬浮菌体　(b)溶液Ⅱ的作用是使DＮA变性
（c）溶液Ⅲ的作用是使ＤNA复性
(ｄ）质粒ＤNA分子小,所以没有变性,染色体变性后不能复性
38。 Clarｋ做了一个有趣的实验，发现TaqDNＡ聚合酶可以不需要模板,在双链ＤNＡ的 末端加一个碱基，主要是加（ ）　．
(a）dGTP （ｂ）ｄATP （ｃ)ｄCTP　(d)dＴＴＰ
39．根据构建方法的不同，基因文库分为基因组文库、cDNA文库等。在下列文库中,
（　）属cDＮＡ文库
（a）　YAＣ文库 （b）　MＡＣ文库　（c)　扣减文库　(d）　BAＣ文库
40．下面关于多克隆位点（mulｔiple　cｌone　ｓｉtｅ,MCS）的描述，不正确的—句是（ ) (a）仅位于质粒载体中 (ｂ)具有多种酶的识别序列
（c）不同酶的识别序列可以有重叠 （ｄ）一般是人工合成后添加到载体中
４1。在cＤNA技术中，所形成的发夹环可用（ )
(a)限制性内切核酸酶切除 （b）用31外切核酸酶切除
(c)用S1核酸酶切除 （d）用51外切核酸酶切除
42。在ＤNA的酶切反应系统中，通常:（ ）
2+ (a）用SＳC缓冲液　（b）加入Mｇ作辅助因子
（c）加入BSA等保护剂　(d）上述说法中，有两项是正确的
４３．　黏性末端连接法,不仅操作方便,而且( ）
（ａ）产生新切点 (b）易于回收外源片段 (c)载体不易环化　（d）影响外源基因的表达
４4．在下列表型中，（ )是基因工程上理想的受体菌表型
++＊－----＋+＋- (ａ）rｍrｅc （ｂ）rmｒec （C）ｒmrec （d）rｍｒeｃ
45.关于ＤNA接头在基因工程中的作用,下列说法中哪一项不正确？（ )
(ａ)给外源ＤNA添加适当的切点 (b）人工构建载体
（c)调整外源基因的可读框 (d)增加调控元件
46．ｃDNＡ文库包括该种生物的( ）
(a）某些蛋白质的结构基因 （ｂ)所有蛋白质的结构基因
（c)所有结构基因 (d)内含子和调控区
４７．下列关于建立cＤNA文库的叙述中，哪一项是错误的？（ )
（ａ）从特定组织或细胞中提取DNＡ或RNA
（b）用反转录酶合成mRNA的对应单链DＮA
(c)以新合成的单链ＤNＡ为模板合成双链DNＡ
(d)新合成的双链ＤＮA甲基化
4８.下列对黏性末端连接法的评价中,哪一项是不正确的? ( ）
(a)操作方便　（b)易于回收片段
(c）易于定向重组 （d)载体易于自身环化,降低重组率
４9。关于感受态细胞性质的描述,下面哪一种说法不正确？( )
（功具有可诱导性 (b）具有可转移性
（c）细菌生长的任何时期都可以出现 （d）不同细菌出现感受态的比例是不同的
５０．下面关于用T4多核苷酸激酶标记5＇ 端制备探针的描述中（ )是不正确的.
(ａ)既能标记ＤＮA，又能标记ＲNA （b）既能标记双链ＤＮA又能标记单链ＤNA （c）只能标记突出的5’ 端不能标记其他类型末端
(d)DＮA或RNＡ必须有5'－ＯH的存在
５1.Sｏuｔheｍ印迹的DＮＡ探针( )杂交。
（a）只与完全相同的片段 (ｂ)可与任何含有相同序列的DNA片段
（ｃ）可与任何含有互补序列的DＮA片段’．
（d）可与用某些限制性内切核酸酶切成的DNＡ片段 （e）以上都是
52． 用下列方法进行重组体的筛选，只有（ ）说明外源基因进行了表达。
(a）Souｔｈem印迹杂交 （b）Norｔｈem印迹杂交
(c）Wｅｓｔｅｒn印迹 （d）原位菌落杂交
5３。下列哪一个不是Soｕｔhｅrｎ印迹法的步骤?( ）
（ａ）用限制酶消化DNA (ａ）DNA与载体的连接
(c）用凝胶电泳分离DNA片段 (d）ＤＮA片段转移至硝酸纤维素膜上
（e）用一个标记的探针与膜杂交
5４． 报告基因( ）
(a）以其易于分析的编码序列代替感兴趣基因的编码序列
（b)以其易于分析的启动子区代替感兴趣基因的启动子区
（c)能用于检测启动子的活性　(ｄ）能用于确定启动子何时何处有活性
5５. 在利用lacZ失活的显色反应筛选法中，IPTＧ的作用是( ）
（a)诱导宿主的α肽的合成 (b）诱导宿主的ω肽的合成
(ｃ)作为酶的作用底物 (d）作为显色反应的指示剂
56. 切口移位是指在（ ）作用下,使（　)带上放射性标记。
（a）DNA聚合酶I,ＲNA （ｂ）DNＡ聚合酶Ｉ，ＤＮＡ
（c)DＮA聚合酶Ⅲ，ＲNA　（d）DNＡ聚合酶Ⅲ，DＮA
5７．用于核酸分子杂交的探针可以是放射性标记的（ ）
(a）DNA (b)RNＡ　(c)抗体 (ｄ）抗原
58．Soutｈｅrn印迹是用DＮA探针检测DNＡ片段，而Noｒthern印迹则是：（ ）
(a）用RNA探针检测DＮA片段 （b）用RNA探针检测RNA片段
（c）用DＮA探针检测RNA片段 （d）用DNA探针检测蛋白质片段
59．用免疫化学法筛选重组体的原理是( ）
(ａ）根据外源基因的表达 (b）根据载体基因的表达
(c)根据mRＮA同DＮA的杂交 （ｄ）根据DNＡ同ＤNA的杂交
6０．随机引物标记探针，下列各项中哪一项是不正确的?（　）
(a）双链DNA、单链DＮA、RNA都是可以标记的 （b）不需要用Dnaｓe I预处理　（ｃ)反应时可用Klenｏw酶 (d）反应时可用DＮA聚合酶1
61.在切口移位标记DＮA探针时只能使用( )
(a)Ｋｌenow酶 （b)DNA聚合酶Ｉ (c)ＤNA聚合酶Ⅱ (d）DNA聚合酶Ⅲ
62.要对一双链的ＤＮA分子进行３１末端标记,可用（ ）
(ａ)Kleｎow酶 （b）ＤNA聚合酶Ｉ （c）Ｔ4DNＡ聚合酶 (d）Ｔ7ＤNA聚合酶

答案;1。c;2．ｃ； 3．b; ４。ｂ 5．b，Ｃ，d,e; 6.c; ７。b； ８。d;９．d； 10.B; 1１．ｄ；1２.ａ； １3.d； 14．b １5.ｄ； 1６．c;17.ａ,b;18．a；19。ｃ;２0。ｄ；２1。c；22．C;2３。b； 24.C;25。d;26.a，C，d;27．b;２8.c; 2９．b;３0．a；３１.c; 32。a，ｃ,d,e，３3．a，ｂ,ｃ;34.ｂ； 35．c；3６．c； 37.ｄ； 38.ｂ；３9．c；４0．ａ；41．c； 42．a，b，c； 43．ｂ； 44．b； ４5．d; 46.a;4７．ａ; 48．c; 4９.ｃ;5０。ｂ；5１．ｃ； 52．ｃ;５3.b； 54．a，c,d；５５。a； 56。b；57。a，b; ５8．c;5９。a；６0．ｄ;61。ｂ; 62。ｃ;

基因工程中限制酶的选择及的筛选方法
摘要：基因工程是现代生物科技专题的重要内容，基因工程四部曲中的核心内容是基因表达载体的构建，在构建表达载体过程涉及的限制酶的种类以及筛选方法成为考试的热点内容。本文结合三道例题将限制酶的选择和筛选方法结合在一起进行比较分析。
关键词:限制酶 筛选
１　单酶切及筛选
若用同一种限制酶切割质粒和目的基因形成相同的四个黏性末端,因而可能出现多种连接方式如①质粒和质粒②目的基因和目的基因③质粒的自身环化，目的基因的自身连接④质粒与目的基因的连接。质粒与目的基因的连接又会出现正向连接和反向连接两种.若启动子在质粒上，目的基因与质粒的反向连接则导致三联体密码顺序改变，起始密码子和终止密码子位置改变，使得翻译不能正常进行而无法得到正常的表达产物。
例1：　(20１2江苏生物高考33题部分)图２表示一种质粒的结构和部分碱基序列。现有Msp I、BamH I、Mｂo I、Sｍa Ｉ４种限制性核酸内切酶，它们识别的碱基序列和酶切位点分别为C↓CGＧ、G↓GＡTCC、↓GATC、ＣCC↓GＧG。请回答下列问题

若将图2中质粒和目的基因Ｄ通过同种限制酶处理后进行连接,形成重组质粒,那么应选用的限制酶是    .在导入重组质粒后，为了筛选出含重组质粒的大肠杆菌，一般需要用添加       的培养基进行培养.经检测，部分含有重组质粒的大肠杆菌菌株中目的基因D不能正确表达，其最可能的原因是       .答案: BａmＨ I  抗生素B    同种限制酶切割形成的末端相同,部分目的基因D与质粒反向链接
笔者认为可通过免疫学方法检测目的基因的表达产物排除反向连接的重组质粒，或分别在质粒和目的基因上设计相同的限制酶识别位点，然后用该酶去切割重组质粒，正向连接和反向连接便会得到不同长度的DNA片段，再根据已知的限制酶在目的基因的位置进行比对，找到正确连接的重组质粒.
2 双酶切及筛选
因为用单酶切会出现质粒与目的基因的任意连接,所以在实际操作中多使用双酶切。双酶切可以避免质粒的自身环化,目的基因的自身连接和目的基因和质粒的反向连接,而目的基因与目的基因的连接因为没有抗生素抗性基因所以可以在含有该抗生素的培养基上去除,故只剩下质粒与质粒，以及质粒与目的基因的重组体。
２。1插入失活筛选法
例2:(苏锡常镇２０12届高三教学调研测试)MｓｅＩ，EcoＲI，PstI识别的碱基序列和切割位点分别为GＡAT↓TAATTＣ，Ｇ↓AＡTＴＣ,Ｃ↓TGＣAG。请回答下列问题：
１)在用图中的质粒和外源DNA构建重组质粒时，需要对质粒改造，构建新的限制酶切位点.试写出构建需要的限制酶切位点的过程（提供构建需要的所有条件):
①首先用     酶处理质粒；
②然后用DNA聚合酶等处理质粒；
③再运用     酶处理质粒,从而形成新的限制酶切位点，可被     酶识别。
(2)基因工程中的检测筛选是一个重要的步骤.下图表示运用影印培养法(使在一系列培养皿的相同位置上能出现相同菌落的一种接种培养方法)检测基因表达载体是否导入大肠杆菌。

图3
培养基除了含有细菌生长繁殖必需的成分外,培养基A和培养基B分别还含有        ，       。从检测筛选的结果分析,含有目的基因的是       菌落中的细菌。答案：(１）EcoRI，ＤＮA连接，MｓeI(2）四环素 青霉素（四环素和青霉素）4和6
用限制酶MsｅＩ和 ＰstI同时切割含目的基因的DNA和质粒,但原有质粒上无MseI识别位点,需利用EcoRI识别位点重新构建ＭseI识别位点.
在抗青霉素基因内部具有重新构建的MsｅI识别位点,当用MseI和Pｓt I同时切割含目的基因的外源ＤNA和质粒,由于目的基因的插入,导致抗青霉素基因出现功能性失活,于是所形成的重组质粒都将具有四环素抗性和对青霉素敏感。将转化的细菌接种在含四环素的培养基上,一段时间后可得到全部受体菌菌落，将灭菌的绒布按到培养基上，使绒布面沾上菌落,然后将绒布按到含青霉素的培养基上.含重组质粒的受体菌能在四环素培养基上生长却无法在青霉素培养基上上生长.上题实际是运用插入失活［1］效应检测外源DNA。
根据插入失活原理设计的筛选重组体分子的方法，需要进行菌落平板的影印复制,才能识别出由此而丧失的表型特征，这会给重组体的筛选工作增加不少麻烦，由此而发展出β－半乳糖苷酶显色反应选择法［1］。
2．2 β—半乳糖苷酶显色筛选法
例３:(盐城市２0１2届高三二模)大肠杆菌pＵCl8质粒上的ＬacZ基囚可表达出β-半乳糖苷酶，当培养基中含有IPTＧ和X－gal时,X-gal便会被β-半乳糖苷酶水解成蓝色,大肠杆菌将形成蓝色菌落；反之,则形成白色菌落。由此推知,选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入     物质。成功导人重组质粒的大肠杆菌在培养基中形成      色的菌落，原因是     。

图四
选择培养基中除含有大肠杆菌必需的葡萄糖、氮源、无机盐、水、生长因子等营养物质外，还应加入ＩPTＧ,X－gaｌ和氨苄青霉素。只有导入质粒的大肠杆菌才能在含有氨苄青霉素的培养基上生长繁殖,而重组质粒中的ＬａcZ基囚因插入目的基因不能正常表达，所以无法表达β-半乳糖苷酶,培养基呈白色.答案：IPTG X-gal 氨苄青霉素:白色;重组质粒中的ＬacZ基因因插入目的基因而不能表达
3平端位点问题
构建重组质粒时常会出现平端位点，平端DNA可用Ｔ4DNA连接酶连接，平端连接可使载体和外源DNA连接序列上的原有限制位点消失,而不含外源插入DNA的载体，经自连成环后仍保留原有的限制位点。基于这一特性,使用特定限制酶处理连接混合物将能专一性地使自连载体DNA线性化，能抗酶解的重组DNＡ则依然保持环状。
主要参考文献
[1］吴乃虎．基因工程原理。第二版.北京：科学出版社，1９9８。３７2

基因工程原理
内容提要
1. 基因工程又称基因操作、重组DNＡ技术， 是P. Ｂerg等于１9７2年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括“切、连、转、选”.该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达.　
2. 基因工程中使用多种工具酶,包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。　
3. 限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶,属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为三大类.Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小,专一性强,切割的方式有平切和交错切， 作用时需要Mg＋＋作辅助因子,　但不需要ATP和SAM。第一个被分离的Ⅱ类酶是Hｉnd　Ⅱ。　
4. 连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶,有DNA连接酶和RＮA连接酶之分。基因工程中使用的连接酶来自于原核生物,有两种类型的ＤNA连接酶∶E．coｌiDNＡ连接酶和Ｔ4－ＤNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E．cｏli中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。
5. 载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒ＤNA、病毒DNA、科斯质粒，在这三种类型的基础上，根据不同的目的，出现了各种类型的改造载体。
6. DＮA重组连接的方法大致分为四种： 粘性末端连接、平末端连接、同聚物接尾连接、接头连接法.粘性末端连接法是最常用的DNA连接方法，是指具有相同粘性末端的两个双链ＤNA分子在DNＡ连接酶的作用下,　连接成为一个杂合双链DNA。平末端连接是指在T４ DNA连接酶的作用下,　将两个具有平末端的双链ＤNA分子连接成杂种DNA分子。同聚物加尾连接就是利用末端转移酶在载体及外源双链DNA的3'端各加上一段寡聚核苷酸, 制成人工粘性末端， 外源DＮA和载体DＮA分子要分别加上不同的寡聚核苷酸，如dＡ（dG）和dT(ｄC）, 然后在ＤNA连接酶的作用下， 连接成为重组的DＮA。这种方法可适用于任何来源的DNA片段， 但方法较繁， 需要λ核酸外切酶、S1核酶、末端转移酶等协同作用。将人工合成的或来源于现有质粒的一小段DNA分子(在这一小段DNA分子上有某种限制性内切酶的识别序列)， 加到载体或外源ＤNA的分子上，　然后通过酶切制造黏性末端的方法称为接头连接法。
7. 基因文库分为基因组文库、cDNA文库等,是指在一种载体群体中,　随机地收集着某一生物DNA的各种克隆片段，　理想地包含着该物种的全部遗传信息。
8. DNA重组分子在体外构建完成后,必须导入特定的受体细胞，使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及操作统称为重组ＤＮA分子的转化。目前常用的诱导感受态转化的方法是ＣａCl２ 法(图３－20），此外也可以用基因枪等方法转化外源ＤＮA。
9. 重组体筛选有遗传学方法、核酸杂交筛选法等.
10. 基因工程技术是现代生物技术的核心，目前在工业、农业和医疗中已经显示了巨大的应用前景,并形成了一大批生物技术产业.

基因工程是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因（DNA分子)，按预先设计的蓝图,在体外构建杂种ＤＮA分子,然后导入活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品;或是研究基因的结构和功能，揭示生命活动规律。 基因工程技术诞生于２0世纪７０年代初，它是一门崭新的生物技术科学，它的创立和发展使生命科学产生了一次重大飞跃,证明并实现了基因的可操作性，使人类从简单地利用天然生物资源走向定向改造和创造具有新品质的生物资源的时代. 基因工程技术诞生至今已经取得了辉煌的成就，成为当今生命科学研究领域中最有生命力和最引人注目的前沿学科之一,基因工程也是当今新的产业革命的一个重要组成部分。
第一节 基因工程技术的诞生
基因工程又称基因操作（geｎe mａniｐｕlatｉｏn），　重组DＮA（rｅcomｂinａnt DNＡ）技术，　是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。
一、基因工程技术的诞生
1972年，P.。　Berg等在PＮAS上发表了题为∶“将新的遗传信息插入SV40病毒DNA的生物化学方法: 含有λ噬菌体基因和　E.cｏli 半乳糖操纵子的环状 SV４0DＮＡ”，标志着基因工程技术的诞生。 ＳV40病毒是猿猴病毒,是一种直径为４50的球形病毒,分子量为２8×１06道尔顿。ＳV40的DNA是环状双链结构，全长５24３个碱基对，编码三个衣壳蛋白VＰ1、VP2、VP3和一个T抗原。SＶ40DNA上有一个限制性内切酶Ｅ.cｏRⅠ的切点. Berｇ等首先用化学方法构建了一个二聚体的环状SV40DNA（图３—１）。

图３—1 重组的SV４0二聚体的构建（引自 Berg　et. aｌ，1972）
当时所用的连接方法是同聚物谱尾法，重组体的鉴定主要是通过电子显微镜比较分子量大小. 当获得二聚体SV40DNA后,Ｂerｇ等就证明了环状DNＡ被内切酶切成线性DNA后能够重新环化，并且能够同另外的分子重组。于是他们进行第二步的实验就是从　λｄvgal　DＮＡ中制备含有 E．coli 的半乳糖操纵子DNＡ，用上述同样的方法进行重组连接，并获得成功. Bｅｒg等的工作是人类第一次在体外给遗传物质动手术，标志着一个新时代的到来,为此他获得了１98０年诺贝尔化学奖.
二、基因操作的基本过程　和特点
基因工程的操作可用图3-2表示∶

图３-２ 基因工程的基本过程（引自Oｌd ＆ Primrｏse,1９80）
它所涉及的过程可用“分（合成)、 切、连、转、选、鉴”六个字表示。
分(合成)∶指DNA的制备，包括从生物体中分离或人工合成。分离制备或合成制备DNA的方法都有很多种。
切∶即在体外将DＮA进行切割,使之片段化或线性化。　
连∶即在体外将不同来源的ＤNA分子重新连接起来,构建重组ＤNA分子.　
转∶即将重组连接的DＮA分子通过一定的方法重新送入或细胞中进行扩增和表达.
选∶从转化的全群体中将所需要的目的克隆挑选出来；
鉴∶就是进行对筛选出来的重组体进行鉴定,因为有些重组体并非是所需要的,必需通过分析鉴定.　
基因工程有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。遗传重组是生物进化的推动力，自然界中发生的遗传重组主要是靠有性生殖。基因工程技术的诞生使人们能够在试管里进行分子水平上的操作,构建在生物体内难以进行的重组,然后将重组的遗传物质引入相应的宿主细胞,让其在宿主细胞中进行工作。这实际上是进行无性繁殖,即克隆，所以基因工程通常有称为基因克隆。

第二节　限制性内切核酸酶
外科医生给患者动手术需要手术刀，基因工程师们给ＤＮA分子(基因)动手术需要分子手术刀，这就是工具酶。基因工程中使用的工具酶很多,包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DＮA合成与修饰的酶类，最重要的是限制性内切核酸酶。基因工程上把那些具有识别双链DＮA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割ＤNＡ双链结构的核酸内切酶统称为限制性内切核酸酶。
一、限制性内切核酸酶的发现
1９5２年Luria、Human在T偶数噬菌体、１９５3年ｗｅigle、Bertanｉ在　λ　噬菌体对大肠杆菌的感染实验中发现了细菌的限制和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究,导致限制性内切核酸酶的发现。
噬菌体在某一特定细菌宿主中生长的能力,取决于它最终在其中繁殖的细菌是什么菌株。 例如,将A噬菌体从一株大肠杆菌转移到另外一株，其生长效率往往会削弱，对这两个菌株的滴　定度可差好几个数量级。第二个菌株释放的噬菌体能百分之百再感染同类菌株，但是若先将它们感染原来的宿主菌,再将释放的子代噬菌体重新感染第二个菌株时,感染率要大大下降。此种现象即为宿主控制的限制作用（host-Contrｏllｅd ｒestrictioｎ）。
用放射性同位素标记的噬菌体进行的实验结果表明，在受感染的宿主细胞中,噬菌体生长的限制伴有噬菌体DNA的迅速降解，然而，用作繁殖噬菌体的感染宿主菌株并不导致类似的噬菌体DNＡ的降解.如果某一细菌细胞具有一种能选择性降解来自侵染病毒（或其他来源)的核酸酶，那么，它必须能将这种外来DNA同它自己的DNA区分开来,之所以能够如此，乃是通过稍 为宿主控制的修饰作用（ｈoｓｔ—cｏnｔrolｌed moｄificatiｏｎ）。　
因此，限制（resｔrictiｏn)作用是指细菌的限制性核酸酶对DNＡ的分解作用，限制一般是指对外源DNA侵入的限制.修饰(modiｆiｃatｉon）作用是指细菌的修饰酶对于DNA碱基结构改变的作用（如甲基化),经修饰酶作用后的DNA可免遭其自身所具有的限制酶的分解。
到20世纪60年代中期，科学家推测细菌中有限制－修饰系统(restｒictioｎ—ｍｏdifｉｃatioｎ　systｅm。 Ｒ—M　syｓｔem)。该系统中有作用于同一DＮA的两种酶，即分解DNA的限制酶和改变DＮA碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶，而且，这两种酶作用于同一DNA的相同部位。一般说来，不同种的细菌或不同种的细菌菌株具有不同的限制酶和修饰酶组成的限制—修饰系统。　
1968年，Meseｌｓon从E．colｉ Ｋ株中分离出了第一个限制酶EcoK，同年Ｌｉnn和Aeber从 E。cｏli B株中分离到限制酶ＥcｏB.遗憾的是，由于EcoK和ＥcoB这两种酶的识别和切割位点不够专一,在基因工程中意义不大。
１970年,Sｍitｈ和Wiｌcｏｘ从流感嗜血杆菌中分离到一种限制性酶，能够特异性地切割　DNＡ，这个酶后来命名为HｉnｄⅡ，这是第一个分离到的Ⅱ类限制性内切核酸酶.由于这类酶的识别序列和切割位点特异性很强，对于分离特定的DＮＡ片段就具有特别的意义.
二、限制性内切核酸酶的命名和分类
（一)限制性内切核酸酶的命名
按照国际命名法,限制性内切核酸酶属于水解酶类。由于限制性酶的数量众多,而且越来越多,并且在同一种菌中发现几种酶。为了避免混淆，1973年Ｓmｉtｈ 和Nａthaｎs对内切酶的命名提出建议,1９８0年，Ｒobｅｒｔs对限制性酶的命名进行分类和系统化。
限制性酶采用三字母的命名原则，即属名 + 种名　+ 株名的个一个首字母，再加上序号,将限制性内切核酸酶的命名要点列于表3-１。

表3—1 限制性内切核酸酶的命名要点
条目
要点
基本原则
３—4个字母组成, 方式是：属名+种名+株名+序号
首字母
取属名的第一个字母， 且大写
第二字母
取种名的第一个字母， 小写
第三字母
①取种名的第二个字母,　小写;　②若种名有词头, 且已命名过内切酶， 则取词头后的第一字母代替
第四字母
若有株名, 株名则作为第四字母, 是否大小写, 根据原来的情况而定
顺序号
若在同一菌株中分离了几个限制性内切核酸酶， 则按先后顺序冠以Ｉ、ＩＩ、IＩI,....。等
如： EcｏＫ： Ｅsｃherichia coli    Ｋ （大肠杆菌K株）
（二)　限制性内切核酸酶的分类
限制性内切核酸酶的作用特点，将它们分为三大类。
１. I类限制性内切核酸酶
I类限制性内切核酸酶的分子量较大， 一般在３0万道尔顿以上， 通常由三个不同的亚基所组成。例如限制性酶EcoB是由R（135kD),M(6２ｋD）和S（55ｋD)三种亚基组成的复合酶,这三个亚基分别由不同的基因编码。全酶的总分子量为4４9ｋＤ,共5个亚基，其中Ｒ亚基和M亚基各两分子。 Ⅰ类酶不仅是一种核酸内切酶, 同时在酶分子上还具有甲基化酶和ATPａse的活性，所以是具有多种酶活性的复合酶类.作用时除了需要Mg++作辅助因子外， 还要求ATP和Ｓ腺苷甲硫氨酸（ＳAＭ）的存在。Ⅰ类酶具有特异的识别序列，大约１5个碱基对。
Ⅰ类酶虽然能够在一定序列上识别ＤＮA分子， 并能同DＮA分子作用， 因其识别DＮA后,　要朝一个方向或两个方向移动一段距离(通常为10０0个碱基左右），并且要形成一个环才能切割DNA(图３—3)， 所以识别位点和切割位点不一致,产生的片段较大.　

图3－３ I类酶的作用方式 （引自Lｅwin，1９97)
２．　Ⅲ类限制性内切核酸酶
Ⅲ类限制性内切核酸酶也是基因工程中不常用的酶，分子量和亚基组成类似于Ⅰ类酶, 作用方式基本同Ⅱ类酶。如EcoＰ1是由两个亚基组成，一个亚基（Ｍ亚基）负责位点识别和修饰。另一个亚基(Ｒ亚基)具有核酸酶的活性(图３—5)。切割DＮA时需要ATＰ,Mg2+,也能被ＳAM激活,但并非必需。

图3-４　Ⅲ类限制性内切核酸酶（引自Ｌewin,1997)
3。 Ⅱ类限制性内切核酸酶
这类酶的分子量较小. 一般在2—４万道尔顿， 通常由2—４个相同的亚基所组成。它们的作用底物为双链DNA, 极少数Ⅱ类酶也可作用于单链DNＡ, 或DNA/RNA杂种双链。这类酶的专一性强, 它不仅对酶切点邻近的两个碱基有严格要求， 而且对更远的碱基也有要求，　因此, Ⅱ类酶既具有切割位点的专一性， 也具有识别位点的专一性， 一般在识别序列内切割.切割的方式有平切和交错切， 产生平末端的ＤＮＡ片段或具有突出粘性末端的DNＡ片段（５'或３’粘性末端).作用时需要Mg+＋作辅助因子， 但不需要AＴＰ和SAM.Ⅱ类酶与对应的甲基化酶在蛋白亚基上尚未发现有什么关系， 第一个被分离的Ⅱ类酶是Hiｎd　Ⅱ。
三。 Ⅱ类限制性内切核酸酶的性质
1。 识别序列的特异性
在３类限制性内切核酸酶中，Ⅱ类限制性内切核酸酶的特异性最强。
大多数Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的序列是回文序列。如ＢamHＩ和BglI都是识别六个碱基的ＤNA序列(图3—5）,都是完全的回文序列。这段序列有两个基本的特征,第一是能够中在间划一个对称轴,两侧的序列两两对称互补配对，第二个特点是两条互补链的5'到3'的序列组成相同，即将一条链旋转180０，则两条链重叠。

图３—5 Ⅱ类限制性内切核酸酶识别的回文序列(引自D．Ｖoet ＆　Voｔｅ J．G.1995)
2．　限制性内切核酸酶的切割频率与速度
切割频率是指限制性内切核酸酶在某DNA分子中预测的切点数。由于ＤNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DＮA的碱基组成是均以的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的,那么对于任何一种限制性内切核酸酶的切割频率,理论上应为１/４ｎ，n表示该限制性内切核酸酶识别的碱基数。如识别4个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每256个碱基有一个识别序列和切点（１/44=1/2５６)，识别5个碱基的限制性内切核酸酶，其切割频率应为每1０24个碱基有一个识别序列和切点，余下类推。
实际上因DＮA的分布是不均一的,且有大量的重复序列,加上内切酶的切点具有GC倾向，所以实际的频率偏低.如同是识别6