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中药有效成分的分离筛选鉴定一体化技术与分子烙印技术【摘要】 应用现代科学技术研究中药有效成分，是中药现代化研究的重要内容。利用分子烙印高分子制成亲和色谱柱，利用色谱分离技术的高速高效性和质谱测定技术的高灵敏度和独有的混合解析能力，在线连接HPLC-MS，可以直接从中药复杂体系中分离、筛选出有效成分并进行直接鉴定，实现中药有效成分的分离、筛选、鉴定一体化技术。文章简要从分子烙印聚合物及其制备、模板分子、功能性单体及聚合条件的选择、技术特点、应用状况及前景等方面简单介绍中草药有效成分筛选鉴定一体化技术中最有应用前途的分子烙印高分子技术。【关键词】 中药有效成分； 分离筛选鉴定一体化技术； 分子烙印技术Abstract：It is an important aspect of modernization for Chinese traditional herb that active composition of Chinese traditional herb is studied with modern science andchromatography is prepared through molecularly imprinted polymers (MIPs) . Based on high performance of chromatographic separation technology and highly sensitive and special combinational analysis ability of mass spectrogram, MIP-HPLC-MS is connected. Therefore, active composition from Chinese traditional herb may be separated, selected and identified, which realized combinational technology of separation, selection and identification for active composition of Chinese traditional herb. The mechanism of molecular imprinting technology (MIT) and synthetic processes of MIPs were introduced in this paper. Application of MIT for separation, selection and identification for active composition of Chinese traditional herb were summarized, and the trends of MIT were also discussed in this paper.Key words： Active composition of Chinese tradational herb； Combinational technology of separation,selection and identification； Molecular imprinting technology 随着科学技术的快速发展，现代药物的创制经历了由快速、低成本向研发周期延长、高成本的模式发展。为了加速新药研制的速度，欧美制药公司不断地采用及开发先进技术。例如，采用组合化学方法快速生产建立包含成千上万化合物的库；采用各种快速高效的筛选检测方法去发现药物前体；将药物新陈代谢机理和毒性的研究提前到药物发现这一环节来进行等。中药是我国的优秀特色医药遗产，其种类繁多，历史悠久，实践证明对许多疾病疗效确实。因此，从中草药中创制新型药物是切实可行又简捷的方法。 应用现代科学技术研究中药有效成分，是中药现代化研究的重要内容。经过几十年的努力，已经取得了许多重要成果，发现了大量活性化合物，有些已经开发成新型的药物。事实证明，中药有效成分是中药发挥治疗作用的物质基础。但到目前为止，仅有一百多种常用中药的主要成分经过了比较详细的研究，大量中药及其成分仍有待研究。研究中药含有的有效成分，特别是对大量的中药进行活性成分的研究，应用高通量药物筛选的方法具有明显的优势，可以提高研究速度和效率。高通量药物筛选需要大量的样品，也可以借助新的样品制备方法和设备，提取不同的样品，包括单一化合物、提取组分或部位。同时积累各种中药样品，建立样品库，供不同的筛选模型使用，提高样品的利用率。对中药单一化合物成分的活性筛选，可以根据获得的结果直接评价化合物的生物活性和药理作用。但对于含有多种成分的提取物或部位，则可以根据活性结果进行跟踪提取分离，最终发现活性化合物或确定活性组分1。 将化合物分离鉴定手段与高通量药物筛选技术相结合，可以直接对提取的组分进行分离和活性检测并鉴定，不仅可以节省研究费用，提高发现活性化合物的速度，同时也可以保证研究目标的准确性。 基于分子识别原理，根据靶酶、分子烙印高分子及药物抗体与活性成分结合能力的差异，分别利用靶酶、分子烙印高分子及药物抗体制成亲和色谱柱，利用色谱分离技术的高速高效性和质谱测定技术的高灵敏度和独有的混合解析能力，在线连接HPLC-MS，可以直接从中药复杂体系中分离、筛选出有效成分并进行直接鉴定，实现中药有效成分的分离、筛选、鉴定一体化技术，其过程如图1所示。这是最近几年出现的药物筛选新技术之一2。如利用细胞膜色谱法筛选鉴定了当归、太白花、红毛七中的有效成分35；利用抗体亲和色谱柱筛选出抗丙型肝炎的先导化合物；利用分子烙印聚合物亲和色谱柱成功筛选出抗肿瘤的EGFR抑制剂，实验证明活性化合物在这几种柱中的保留时间与活性成正比6。图1 中药有效成分的分离、筛选、鉴定一体化技术 由于MIPs具有较高的预定选择性，独特的化学、物理稳定性，分子识别能力不受酸、碱、热、有机溶剂等环境因素影响的优点，以及制备简单、可重复使用等特点，在分离、分析中展示了美好的应用前景。下面从分子烙印聚合物及其制备、模板分子、功能性单体及聚合条件的选择、技术特点、应用状况及前景等方面简单介绍中草药有效成分筛选鉴定一体化技术中最有应用前途的分子烙印高分子技术。1 分子烙印聚合物及其制备 分子烙印技术，也称分子印迹技术，其应用前提是能够制备出具有分子识别能力的聚合物材料-分子烙印聚合物(MIPs)。MIPs的制备过程大致为：将模板分子和功能单体按照一定比例混合后在一定条件下反应，通过共价键或非共价键作用形成可逆的模板分子-功能单体复合物；加入交联剂等，使之与前面的模板-功能单体复合物通过聚合反应形成多孔性的高聚物；将模板分子从高聚物中抽提出来，这样在聚合物的骨架上便留下了一个对模板分子有“预定”选择性的分子识别位。分子烙印聚合物中的空腔和模板分子形状、大小完全一样，从而实现对模板分子的特异性识别。其过程见图2 7。 根据模板分子和功能单体形成复合物时作用力的性质，MIPs分为共价型和非共价型两种。共价型MIPs制备过程中，模板分子和功能单体通过可逆的共价作用，如形成可逆的硼酸酯和席夫碱。而在非共价型MIPs生成过程中，模板分子和单体则可通过氢键、偶极、离子、金属螯合、电荷转移、-共轭作用、疏水乃至范德华力等相互作用形成复合物。图2 分子烙印材料的制备过程示意图 当这些微弱的相互作用在溶液中建立起来后，参与自组装的分子自发地安置在液相溶剂中，聚合作用被引发，这些分子因高度的交联聚合作用而在空间上被固定，然后将模板分子抽提移走，中间形成一个空穴。用这种方法合成的MIPs检验模板分子和/或类似物时，其扩散进入分子烙印聚合物的互补位置，它们之间又能重新成键。 共价型MIPs中，单体-模板所形成的配合物十分稳定，且相互间存在着当量关系。因此分子烙印过程明确而清晰；由于共价连接的稳定性，因此可在较宽的聚合条件下，如在高温，高或低的pH，或高极性溶剂中进行聚合。但是，单体-模板配合物的合成较困难，同时也不经济；可以采用的可逆共价联接体系数目有限；在某些情况下，会因第3步剧烈的工作条件而使烙印效果变差；客体的结合和释放都较慢，这是因为它们都涉及键的形成和断裂过程。 非共价键型MIPs中，不必合成共价的单体-模板配合物；因为其之间仅有较弱的非共价相互作用力，可在温和的条件下将模板从聚合物中除去，同时客体的键合和释出都有很快的速度。但是，烙印过程的轮廓不够清晰，因为单体-模板加成物易于变化，而无严格的计量关系；聚合过程的条件必须仔细加以选择，使混合物中非共价的加合物能最大程度的稳定存在；由于在大量功能单体存在的条件下常会出现非特征的键合点，于是体系结合底物的选择能力降低。对非共价键克仑特罗MIPs的液相色谱特性的研究表明，在磷酸盐缓冲液/乙腈洗提条件下，其可以识别出其他所有肾上腺素结构样物质8。目前绝大多数MIPs均是通过非共价型MIT制得的。 除了以上两种基本模式以外，还有一种将这两种模式综合在一起的技术，即聚合时功能性单体与模板分子间的作用力是共价键，而在对烙印分子的识别过程中，二者之间的作用力是非共价键。Whitecombe等9将胆固醇与功能性单体4-乙烯基苯基碳酸酯共价结合后，用碱水解时随着CO2的释去而打开了单体和烙印分子间的共价键，此时MIP上便产生了一个非共价型的分子识别位，在分子识别中通过氢键结合胆固醇。用这种方法已经制备了体积较大底物的分子烙印聚合物，这些聚合物具有多位结合的结构。2 模板分子、功能性单体及聚合条件的选择 MIPs形成中经过的两大步骤是两个相反的过程，它要求模板分子既能参加聚合反应，又能提取出来。作为模板的分子都应含有形成弱相互作用力或可逆共价键的基团，能满足要求的化合物主要有糖类、氨基酸及其衍生物；蛋白质、核苷酸及其衍生物；嘌呤、嘧啶等生物碱；羧酸、二醛、胆固醇、维生素、酶、神经递质如乙酰胆碱；杀虫剂、除草剂、染料、药物以及重金属等。 功能单体的选择主要由模板分子决定，首先必须能与模板分子成键，且在反应中它与交联剂分子处于合适的位置，能使模板分子恰好镶嵌其中。常用的功能性聚合单体有甲基丙烯酸、4-乙烯苯基硼酸、吡啶衍生物、丙烯酰胺等等。一般认为MAA与氨基之间可发生质子化作用，同酰基、羧基、氨基甲酸酯之间可产生氢键作用。为得到稳定的模板-单体复合物，所选择的功能单体应与模板间存在尽可能强的分子间作用力，因此对含有碱性官能团的模板应选择含羧基的功能单体；而含酸性功能基团的模板应尽可能用碱性功能单体如乙烯基吡啶。有时根据模板分子的结构，采用与模板分子具有多作用位点的功能单体，可使聚合物的选择性大大提高。此外，对某些模板分子采用混合功能单体，亦能提高分子烙印聚合物的选择性。Jorge Luis10在研究氯霉素分子烙印时采用混合功能单体，二乙氨基乙基丙烯酸甲酯与2-乙烯基吡啶摩尔比是25 : 75，混合功能单体与氯霉素的摩尔比为2 : 1，在50 条件下，制备的氯霉素分子烙印聚合物，实验结果表明混合功能单体聚合物的烙印效果优于单一功能单体；Wang等11在研究氨基酸衍生物分子烙印时，2-乙烯吡啶和丙烯酰胺的混合物为功能单体，也得到了类似的结果。 交联剂最常见的主要是乙二醇二甲基丙烯酸酯、季戊四醇三丙烯酸酯以及一些乙烯基衍生物，如二乙烯基苯等。 分子烙印过程主要通过自由基引发，其引发方式主要有高温热引发和低温光引发。具体的聚合条件选择则视具体情况而定，因为影响反应的因素很多，如浓度、温度、光照及溶剂的种类和极性等。常用的引发剂有偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈等。 由于非共价作用的强弱强烈地依赖于溶液的极性，所以非共价方式一般选择在有机溶液如氯仿、甲苯中进行，而共价方式一般选择在极性较强的水、醇等溶液中进行。3 分子烙印技术(MIT)的特点选择性高MIP依靠分子形状、大小及官能团进行分子识别，类似于生物体系中酶对底物、抗体对抗原或受体对抑制剂的作用，因此，其对模板化合物及其类似物具有较高的选择性，在某些体系中，MIP的识别已优于传统方法制备的抗体，从而MIP又被称为模拟抗体。目前，MIP作为分子识别材料，除了被用于手性分离、免疫分析、传感器、模拟酶催化以外，在固相萃取(SPE)方面的应用也越来越引起人们的注意。稳定性好与生物大分子相比，MIP具有制备简单、周期短、性质比较稳定、可在普通条件下存放、能重复多次使用的优点。药物筛选模型的替代性对有些疾病尚无筛选模型或所建立的药物筛选模型繁琐危险性较高，可以以对该疾病防治确实的已知药物为模板，研制MIP与高效液相和色谱联用技术作为高通量预筛模型的最佳替代，前景广阔。应用范围广利用MIPs的选择性，用其作为吸附剂可以实现对目标化合物的提取、纯化和浓缩，使之达到能够被直接检出的浓度，从而降低检测限，提高分析的准确性和精密度，克服样品体系复杂、预处理繁琐等不利因素，为痕量组分的富集和分析提供极大的方便。随着研究的深入，MIT与色谱、毛细管电泳、荧光、电分析法等分析、分离手段结合，利用MIPs的选择性以及多孔性，在药物分析、有害成份检定、环境监测以及催化方面得到广泛应用。药物研发应用前景大MIP与高效液相和色谱联用技术可以在中药研究开发的如下四大领域应用2寻找先导化合物以一种已知的活性化合物为模板合成相应的分子烙印聚合物，可以将其用于合成的组合化学库或者天然组合化学库-中药体系(包括复方)，直接从构型多样的库中提取出来其他结构类似的先导化合物，从而避免了传统分离提取的非特异性和低效性。寻找已知药物替代品高活性的抑制剂在成为药物之前，必须经过药理研究、毒性筛选等，许多有效的抑制剂往往因为高毒性或副作用，或者在体内吸收不好而无法最终成药。而中药的毒性较小。若以某种高效高毒性的分子作为模板分子烙印出来的聚合物，可以直接从这种天然组合化学库中筛选出来其他有效并且低毒性的化合物作为替代品；或者某种高效无毒的药物分子由于合成困难而导致非常昂贵，此时也可以用分子烙印的方法寻找其他成本低廉且容易得到的替代品。高效提取微量(或痕量)成分在中药的传统分离提取过程中，许多有效成分往往因为含量低微而被漏筛或者难以纯化出来，利用分子烙印的强特异性和高选择性可以将一些含量很低的化合物直接从粗提物中提取出来。制定中药质量标准中药在中国的应用已经有几千年的历史，但往往由于其成分的复杂性和有效成分不够明确而难以在国际市场上被认可。如果能够利用分子烙印的方法对某些有效成分的含量进行监控(可以用色谱或者质谱的手段检测目标产物的存在及确定其含量)，制定一套质量标准，将有利于中药的进一步应用推广。4 MIT在中草药有效成分分离鉴定中的应用研究 MIP分离化合物的机制见图3所示12。MIP 应用于动物组织中药物及其代谢物、中草药成分提取分离的研究报告较多，也取得了一批有价值的分析方法和材料13。如郭文生等14采用分子模板聚合物技术对中草药马钱子Strychnos nux-vomica L. 粗提物中有效成分马钱子碱(brucine)、士的宁(strychnine) 进行了选择性分离。用丙烯酸为单体，TMPTA为交联剂，合成对马钱子碱有特异选择性的模板聚合物(MIP)。选择性分离出粗提物中的马钱子碱，纯度可达 %，同时得到士的宁为主的生物碱，纯度为 %。周力等15制备了以槲皮素为模板的分子烙印聚合物，从沙棘粗提物中分离提取槲皮素和异鼠李素两种黄酮，得到良好的效果。a-表示MIP的连接位置对烙印分子有较高的装载能力；b-表示由于烙印分子对MIP有较高的亲和力使得烙印药物分子缓慢释放；c-表示烙印对应体被吸附在MIP上，而非烙印对应体由于对MIP连接位置的不相配而释放；d-表示在连接位置，由于亲和力的作用，有较低亲和力的药物被有较高亲和力的药物所取代。图3 类似药物在分子烙印材料上的装载释放过程 MIP-HPLC-MS应用于中草药有效成分分离鉴定研究报告较少，但以仅有的报告来看，其前景看好。谢建春等16以骆驼蓬种籽中抗肿瘤活性化合物哈尔明及哈马灵的结构类似物哈尔满作为模板，用非共价键法制备了对哈尔明及哈马灵具有强亲和性的分子烙印聚合物。此分子烙印聚合物作为液相色谱固定相与大气压电离飞行时间质谱联用，直接分离鉴定了草药骆驼蓬种籽甲醇粗提物中所含的哈尔明及哈马灵两种抗肿瘤活性成分。实验结果证明了通过分子烙印亲和色谱与质谱联用方法，快速有效地对中草药活性成分分离鉴定是可能的。谢建春等17尝试以丙烯酰胺作为功能单体，以槲皮素为模板，在极性溶剂中，用非共价键法制备了MIP。结果表明，MIP对槲皮素具有特异亲和性，将该MIP直接分离银杏叶提取物水溶液，得到主要含模板槲皮素及其结构类似化合物山奈酚两种黄酮类组分。利用MIP特异亲和性从中药复方中提取、分离具有相同空间结构、相似功能团的有效部位，将会成为中药复方有效部位提取、分离的有效手段。Vallano等18,19利用分子烙印的原理，以抗抑郁症的去甲替林(NOR)为模板，将去甲替林烙印粒子填充在毛细管HPLC柱上，利用毛细管液相色谱筛选结构类似的抗抑郁症化合物，结果表明具有和模板大部分结构类似的化合物都能被印迹分子所识别, 尤其是具有环和亚胺的化合物选择性更好。5 MIT的发展趋势 分子烙印高分子技术与分离鉴定的一体化技术，其核心是基于MIPs的快速高效发展。在未来一段时间MIT的研究可能主要集中在如下几个方面：分子烙印和识别过程的机理，从热力学和动力学角度研究增多，从目前的定性和半定量描述向完全定量描述发展，其应用范围进一步扩大；合成种类 1 杜. 药物筛选新技术与中药现代化研究J. 世界科学技术-中药现代化，2000，2：47. 2 王 夔. 中药研究现代方法学M. 北京：化学工业出版社， 200442.3 赵惠茹，杨广德，贺浪冲. 用细胞膜色谱法筛选当归中的有效成分J. 中国药学杂志，2000，3513.4 张汉利，杨广德，贺浪冲. 太白花活性成分的筛选与药理作用相关性研究J. 中国药学杂志，2003，38：92.5 高 琨，贺浪冲，杨广德. 用细胞膜色谱法筛选研究红毛七中的有效成分J. 中国药学杂志，2003，3814.6 谢建春，骆宏鹏，朱丽莉，等. 利用分子烙印技术分离中草药活性组分J. 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