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基因在造血干细胞自我更新中的调控作用
【摘要】 　　造血干细胞( hematopoietic stem cell,HSC) 具有高度自我更新能力和多向分化潜能, HSC 的自我更新是由促进生长的正调控信号和导致凋亡的负调控信号之间的平衡来调控的。在正调控信号中，HOXB4 通过激活不同的信号通路增强HSC 的自我更新，同时又不影响维持正常稳态造血的调控机制。提高HOXB4 的表达水平,能够极大地增强HSC 的自我更新功能，但基本不影响细胞的分化、系特异性及终末细胞的形态和功能。不仅如此，HOXB4 还可增强胚胎干细胞(embryonic stem cell, ESC)的造血潜能，促进ESC 向造血细胞分化。因此，HOXB4和HOXB4 的靶基因的表达上调可能在干细胞移植和基因治疗等方面具有广阔的应用前景。本文就HOXB4基因参与调控造血干细胞的自我更新，HOXB4对HSC的分化特异性及终末分化的“零”效应及HOXB4调控HSC自我更新的分子机制等进行综述。
【关键词】 HOXB4基因 造血干细胞 自我更新
　　Regulatory Role of HOXB4 in Selfrenewal of Hematopoietic Stem Cells ——Review
Abstract Selfrenewal and multilineage differentiation of hematopoietic stem cell (HSC) are their functional characteristics. The regulation of HSC selfrenewal is governed by a balance between positive regulatory signals promoting growth and negative regulatory signals resulting in apoptosis. Among the positive regulatory signals, HOXB4 activates distinct pathways that enhance selfrenewal divisions of HSC without overriding the regulatory mechanisms that maintain normal steadystate hemopoiesis. The upregulation of HOXB4 gene expression can greatly promote the HSC selfrenewal, but does not affect the HSC differentiation, the morphology and function of linagespecific cells and terminallydifferentiated blood cells. Furthermore, HOXB4 can enhance the hematopoietic potential of embryonic stem cell (ESC), promoting the differentiation of ESC into hematopoietic cells. As a consequence, upregulation of HOXB4 expression and/or corresponding HOXB4 target genes can have enormous therapeutical potential for human HSC in the stem cell transplantation and gene therapy. In this review the regulatory role of HOXB4 in HSC selfrenewal, “zero” effect of HOXB4 on differentiation specificity of HSC lines and terminal differentiation cells, and molecular mechanisms of regulating HSC selfrenewal by HOXB4 are summarised.
Key words HOXB4；hematopoietic stem cell；selfrenewal
造血干细胞(hematopoietic stem cells, HSC)具有高度自我更新能力和多向分化潜能,并能够维持两者之间的平衡。HSC 的自我更新和多向分化之间的平衡受到包括转录因子、细胞周期调控因子、生长因子和黏附分子在内的复杂的内部和外部信号的严格调控［1］。正常情况下，HSC 经过不对称有丝分裂形成两个子代细胞，其中一个仍维持造血干细胞的全部特征，即自我更新。自我更新使得干细胞池的大小和质量维持不变，因而又称为自我维持。另一个子细胞在有丝分裂过程中特征发生改变，走向逐渐分化的途径,离开干细胞池进入增殖分化池。因此，不对称有丝分裂使HSC 数量维持不变，从而能够长期维持机体的正常造血机能，同时也使HSC 不断分化产生造血祖细胞 ，从而维持了机体的正常造血,保证了机体在生命过程中对各类细胞的需要。 HSC 的这种特性构成了造血干细胞移植的理论基础， 使得造血干细胞移植成为治疗血液系统疾病、实体瘤、免疫缺陷性疾病等疾病的一种可靠选择，成为干细胞研究和应用的成功基础。所谓造血干细胞移植实际上是造血干／祖细胞(hematopoietic stem cell/hematopoietic progenitor cell, HSC/HPC)移植,造血干细胞的“理想移植物”必须含有大量HPC，这对于临床植入成功并能重建长期造血至关重要［2］。然而，如何使HSC/HPC 在体外扩增和处理的同时保持HSC 的自我更新特性是一个亟待解决的难题。
中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(3)HOXB4 基因在造血干细胞自我更新中的调控作用目前，HSC/HPC 的体外扩增方法有：将HSC/HPC 和造血饲养层细胞共培养;在培养基中加入纤维母细胞生长因子1，Wnt 蛋白，sonic hedgehog蛋白，血小板生成素或不同的生长因子组合［3］。但是，这些方法只能有限的扩增HPC,而且在此过程中HSC 的自我更新能力下降并且分化进程加快。通过基因工程的方法选择性的过表达MDR1、Notch1 或HOXB4 能够在体外大量的扩增HSC/HPC［3］，其中，同源盒转录因子HOXB4 被认为是造血作用的一个重要且强有力的调节因子。
HOX 基因是同源盒基因(homeobox gene)家族中的一员。同源盒基因家族编码的蛋白质是一类转录因子,它们以种系特异性和阶段特异性的方式调控HSC 的自我更新和定向分化。人类的39个HOX 基因分成A、B、C 、D 4簇，以共线性的方式串联于7、17、12和2号染色体上。HOX 基因都含有一段被称为同源盒的 183 bp 的高度保守序列。该序列编码一段保守性较高、由61个氨基酸残基组成的DNA 结合结构域［同源结构域］。该家族通过与很多转录共因子的相互作用来调节转录以完成造血发生过程中特异的转录程序［1］。在正常造血和白血病中均发现多个HOX 基因的特殊表达模式，表明不同的HOX 转录因子在造血的不同阶段发挥特殊的作用。HOXB4 被认为是原始造血细胞的重要调节因子，因为它在CD34+ 细胞中高表达，并随着细胞向各系增殖分化和成熟而逐渐表达减低,直至消失［4］。HOXB4 是第一个被证明能够在体内外促进HSC/HPC 扩增但是又不影响HSC 分化成正常的成熟的淋系和髓系细胞的转录因子。
HOXB4 基因参与调控造血干细胞的
自我更新早期的研究发现，HOXB4 转导的骨髓细胞的总细胞和HPC 的生长率加快，倍增时间缩短［5］。脐血和成人骨髓中HOXB4 基因的表达能够有效地增强CD34+ 细胞的增殖效应，但是并不引起分化异常或诱发白血病。HOXB4 的高水平表达使脐血CD34+ 细胞在体内具有强大的竞争优势［6］。增加HOXB4 在小鼠骨髓细胞中的表达能够在体内外显着增强HSC/HPC 的再生潜能，因此HOXB4 的过表达使转导的HSC/HPC 得以选择性的扩增［3］。目前认为,HOXB4 表达水平的高低可以作为衡量CD34+ 细胞自我更新能力的一种标志［7］。虽然HOXB4 的过表达增强了HSC 的自我更新能力，但是HSC 数量的大小、成熟血细胞产生及维持的速率并不受影响。然而，HOXB4 的过表达并不能增加培养数星期以后的骨髓细胞的增殖速度，而使其维持以每天分裂次的恒定速度增殖［3］。在连续骨髓移植实验中，HOXB4 的过表达使实验组的初级和次级受体小鼠产生具有再殖能力的HSC 的数量比对照组增加了50倍，从而增加了HSC自我更新的机率［5］。重要的是，在实验组中均未发现细胞的系改变及白血病的发生。用表达HOXB4 的逆转录病毒载体转导的骨髓细胞移植给致死剂量照射的小鼠时，干细胞池恢复到正常规模，表明HOXB4 的效应受正常稳态控制机制的影响。与对照组只能重建5%-10％的正常干细胞池规模形成了鲜明的对比［8］。用逆转录病毒载体将HOXB4 基因转导小鼠CD34+ 细胞，该细胞经体外培养14天后能扩增出约40倍的具有造血重建功能的HSC/HPC［8］。更重要的是，这些扩增的造血细胞分化成淋系和髓系的能力并未受到明显的影响［5］。因此，HOXB4 和其相应的靶基因的瞬时过表达使HSC 具有巨大的治疗潜能。值得注意的是，HOXB4 的强持续性表达增强髓系的分化，同时也抑制淋系的分化；HOXB4 过高水平的表达则会减弱红系终末阶段的发育［7，9，10］。由此推测，存在一种浓度依赖性机制控制着HOXB4 的作用效果，或者说，不同浓度的HOXB4 在自我更新、分化或分化障碍中所起的作用是不同的［3，11］。因此，只有使HOXB4 的表达水平介于在一个合适的范围内时,才可以很好地发挥其扩增作用,从而达到治疗目的。而且HOXB4 的效应也会随着细胞类型的不同而不同［12］。因此，表达的时限、表达的水平和细胞类型都会影响HOXB4 表达的结果，因而也就可以解释为什么用不同的细胞类型或方法使HOXB4 过表达时观察到不同的造血表型。
增加HOXB4 基因的表达使HSC/HPC 增殖能力显着增强的效应与HOXB4 缺陷小鼠HSC/HPC 增殖能力只是相对轻度的降低的现象相矛盾，出现这种情况可能是由于同源HOX 基因的补偿效应所导致的，也就是功能的相对剩余现象［13］。
HOXB4 的表达使小鼠骨髓和胚胎干细胞具有分化成终末淋系和髓系的潜能［12］，而HOXB4 基因敲除鼠的造血器官的细胞构成减少和HSC/HPC 的数量减少进一步证明了HOXB4 的作用［13］。最近的研究发现，细胞因子扩增的人ESC 的子代细胞能使SCID 鼠重建短期造血；而慢病毒介导的HOXB4 在人ESC 中的异位表达则不能增强重建作用。作者认为，原因可能是按照他们所使用的方法获得的HOXB4 功能对于人ESC 的子代细胞的移植来说是不够的［12］。而HOXB4 基因在小鼠ESC 中的过表达仅导致红系和混合的红系／髓系克隆数的增加，而粒系或单核细胞系克隆数并不增加。这个结果与人ESC 中HOXB4 的表达引起髓系和单核细胞系克隆数增加的效应相反。存在这种差别可能是由于转基因表达的方法不同所致［12］。
HOXB4 对HSC 系分化特异性及终末
分化细胞的“零”效应经HOXB4 扩增的HSC/HPC 十分“健康”,除了具有正常自我更新及分化的功能外,还可以进行正常的分化,而且不影响分化终末血细胞的形态、功能和数量，经过一定的时间观察也未发现造血系统发生紊乱。这说明HOXB4 对终末分化细胞的影响很小。
HOXB4 缺陷主要影响干细胞池的规模，但是并不影响分化和系选择性［4，14］。功能获得模型表明增加HOXB4 的体内表达能够强烈的刺激照射后移植受体小鼠HSC的自我更新和再生能力［5］。在NOD/SCID 移植模型中，增加HOXB4 的表达水平能够使人脐血细胞产生的竞争性再生单位数量增加3-4倍［5，6］。
HOXB4 转导的骨髓细胞在体外扩增的早期表达髓系分化标志；经过转导和选择作用，长期过表达HOXB4 的骨髓细胞形态逐渐稳定，产生一个具有原始细胞表型的更加同质的细胞群体［3］。在表达HOXB4 的体外培养细胞中，表达粒系标志的细胞频率下降，而表达低水平Mac1 的细胞频率增加。因此，虽然HOXB4 的过表达不会抑制造血细胞的体内分化，但是，HOXB4 的表达会干扰体外培养的骨髓细胞的造血分化［3，5］。这些研究结果表明，骨髓微环境为HOXB4 转导的细胞提供了体外培养条件下所不具有的分化信号，所以，体内的骨髓微环境能够消除HOXB4 介导的分化减少的影响。
HOXB4 调控HSC 自我更新的分子
机制HSC 的自我更新受到促进生长的正调控信号和导致凋亡的负调控信号之间的平衡调控的。研究发现Notch、sonic hedgehog(Shh)、Bmi1、WNT 和HOX 等均是参与HSC 的自我更新调控的正调控信号［4，15］，其中HOXB4 通过激活不同的信号通路来增强HSC 的自我更新，同时又不影响维持正常稳态造血的调控机制。HOXB4 诱导HSC/HPC 扩增的分子机制及其作用的靶基因仍有待于进一步的研究。HOXB4 与转录共因子PBX 的相互作用对于增加HOXB4 诱导的HSC 的自我更新能力是非必需的，实际上，它可能对HOXB4 诱导的增殖效应起限制作用［16］；相反，同源结构域介导的HOXB4DNA 的相互作用对于HOXB4 的增殖效应是必不可少的，这说明影响HSC自我更新的基因转录是受HOXB4 控制的［16］。
HOXB4 与其他HOXB 簇基因串联成簇分布于17号染色体，并按3′→ 5′方向排列3′B1 B2 B3 B4 B5 B6 B7 B8 B9 B135′(17q21)。HOXB4 基因全长约 kb，包含同源结构域(HD)。HD 具有类球形折叠, 它的螺旋转角螺旋(helixturnhelix) 结构可与靶基因的启动子或增强子序列特异性结合, 识别以5′TAAT3′为核心的1012 bp 的DNA 序列, 从而实现对靶基因的调控。HD 的N末端臂与DNA 的小沟接触起稳定结合的作用,其C末端多为酸性尾部，可作为转录结构域。
HOXB4 在造血系统中的表达受控于5′侧端一段高度保守的99 bp的启动子［17］。上游刺激因子1/2 (USF1/2), micropthalmia 转录因子,核因子Y (NFY),血小板生成素(TPO) 和AP1 复合体等均参与了HOXB4 的转录调控。启动子区的HxRE1 和HxRE2 序列分别是NFY 和USF1/2 的结合位点［18］。USF1/2 和MITF 竞争结合于HOXB4 的启动子,从而影响HSC 的自我更新状态。若前者结合，则能够诱导HOXB4 的转录，从而维持HSC 的自我更新状态；否则，则相反。NFY 和USF1/2 形成复合体后才能激活HOXB4 的启动子［18］。NFY激活多个HOX4 同系物的能力可以解释HOXB4 过表达和基因敲除试验结果的不一致［19］。NFY在体内通过MAPK 和PKA 信号通路直接上调HOXB4 基因的表达水平［20］。TPO 通过p38MAPK 来上调HOXB4 的表达，同时，还通过诱导USF1 的表达来影响HOXB4 启动子的转录活性［20］。HSC 中HOXB4 的表达激活很多调节细胞分裂的基因包括cMyc,它在G1/S 期的转换中起重要作用［21］。cMyc 的强迫表达反映了HOXB4 在HSC 中的效应，表明cMyc 足以介导HOXB4 的作用。除了cMyc，HOXB4 还能上调AP1 转录激活复合物的两个亚单位JunB 和Fra1，它们又引起细胞周期蛋白D1 (cyclin D1)的表达上调,使 G1 期变短，最终缩短细胞周期，使得造血恢复加快［19］。
HOXB4 在人ESC 中的作用机制可能是影响人ESC 自发的分化成中胚层细胞然后再分化成HSC，而不是促进ESC 直接分化成HSC［12］。这个机制与HOXB4 通过增加ESC 来源或其他细胞来源的小鼠HSC 的自我更新能力及其子代细胞数量的作用一致［5］。
HSC 自我更新的负调控信号包括周期素依赖性蛋白激酶抑制剂p21Cip/Waf1 (p21),它是G1 检测点调节因子［1］。P21 蛋白限制HSC 的细胞周期从而维持HSC 的静止状态和细胞生存。p21 的缺乏能够显着增强HOXB4 介导的自我更新和再生能力，因此至少一部分的HOXB4 效应不是通过p21 介导的。
展 望
HOXB4 的异位表达能够增加小鼠和人骨髓细胞的增殖潜能，并以更快的造血重建速率恢复到正常的稳态水平［8］。逆转录病毒介导的HOXB4 的表达和重组的HOXB4 蛋白均能促进具有再生能力的骨髓细胞的体外扩增［5,22］。HOXB4 也可以通过直接蛋白转移的方法来扩增HSC/HPC［23］。这些结果证实了HOXB4 在HSC 自我更新中的作用并强调了HOXB4 在改善HSC 用于细胞治疗方面所具有的巨大潜能［24］。因此，利用HOXB4 能够发展一种安全有效的HSC/HPC 扩增方法解决造血干细胞移植中体外扩增HPC 难以满足临床用量的难题。
　　鉴于HOXB4 在临床应用方面具有的巨大潜力，研究HOXB4 过表达的潜在危害及受HOXB4 影响的生物学过程就显得尤为重要。HOXB4 扩增的HSC/HPC 的安全性是一个未决的问题。其他HOX 基因如HOXB8 或HOXA10 在扩增造血细胞的同时，引起细胞的条件性永生化并改变细胞正常的分化，导致小鼠模型出现白血病［8］。虽然在相似的实验中还没有发现HOXB4 引起白血病的情况，但是这并不能排除HOXB4 诱发白血病的低概率或需要长潜伏期的可能性。另一个值得关注的问题是,腺病毒或逆转录病毒介导HOXB4 的高表达水平与髓系分化异常相关［6,12］。因此，使用可被调控的HOXB4 基因或直接使用重组蛋白是将HOXB4 的负面效应降到最低点所必需的。
避免在临床应用时使用逆转录病毒载体的一个可行方法是使用一种含有浆膜通透序列的HOXB4 融合蛋白，该蛋白能够使HOXB4 进入细胞浆［22］。这种方法已成功扩增人的HSC/HPC，并重建免疫缺陷小鼠的造血功能［23］。另一个可行的策略是控制HOXB4 的功能。HOXB4与雌激素受体来源的突变激素反应元件形成的融合蛋白能够扩增HSC/HPC 的数量，并在扩增达到足够数量时逐渐消除HOXB4 的活性［8］。
将HOXB4 促进ESC 向造血细胞分化的作用应用于临床移植,不仅可以避免很多伦理学问题,获得充足的功能细胞来源,还可以避免移植后的免疫反应,提高移植的成功率,因此ESC 在临床的应用可能会首先在HSC 移植上取得突破。另外，将患者特异性的ESC 体外诱导分化为HSC,再移植回同一患者体内,可以为白血病等恶性血液系统疾病及其他需要移植HSC 移植的疾病提供新的细胞来源,避免免疫排斥反应,提高移植的成功率和移植后患者的生活质量,同时可以扩大HSC 移植的适应证,为那些找不到合适基因配型的患者带来希望。
目前，基因治疗的一个瓶颈是人HSC 的低转染效率导致很多处于嵌合状态的移植的HSC 仍未得到改良，从而使经过基因改良的HSC 的数量和比例均不能满足治疗的需要。转导HOXB4 基因的HSC 具有强大的竞争性再生优势，因此，可以通过HOXB4 基因选择遗传改良后的HSC 用于基因治疗［5］。这就使那些不具有生存优势的改良细胞能够大量扩增而产生治疗效应，从而使基因治疗具有更光明的前景。
HOXB4 扩增的HSC/HPC 也可用于改善耐药基因的选择体系。虽然耐药的HSC 具有生长优势，但是这种选择过程往往伴随HSC 总数量的减少。HOXB4 和耐药基因的共表达就能够克服这种缺陷，减少细胞毒药物处理后HSC 的完全衰竭，允许转导HSC 的选择性再生，从而增加转导HSC 的选择效率［25］。这种方法存在的技术难题在于寻找一种能够表达3个编码区的载体，新技术如载体中插入病毒2A序列提供了解决难题的一个方法［26］。
总之，阐明HOXB4 依赖的HSC/HPC 增殖的潜在分子机制及HOXB4 与其他自我更新信号通路如Wnt 和Notch 等之间相互作用形成的调控网络如何调控HSC 的自我更新，将成为未来HSC 自我更新领域研究的一个重点。
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