条斑紫菜SOD基因家族的全...及温度和失水胁迫下表达研究_管晓伟.pdf

第 卷第期 年月中 国 海 洋 大 学 学 报 （）：，条斑紫菜 基因家族的全基因组分析及温度和失水胁迫下表达研究*管晓伟，王冬梅*，陈睿，曲伟华（中国海洋大学海洋生命学院，海洋生物遗传学与育种教育部重点实验室，山东 青岛 ）摘要：为探究超氧化物歧化酶（，）在条斑紫菜响应温度和失水胁迫时发挥的作用，本文利用生物信息学的方法对条斑紫菜 基因家族的进化树、染色体定位、基因结构和蛋白结构等方面进行研究分析。在条斑紫菜中共鉴定出 个 基因（），包括种 、种 和种 ，不均等地分布在条染色体上，且各含个内含子；基因启动子区域含有不同数目的胁迫响应、生长发育和激素响应元件；和 二级结构中螺旋所占比重大，中折叠所占比重大。基于条斑紫菜受到温度和失水胁迫的转录组数据和 结果，不同胁迫条件下具有不同的表达模式，尤其在失水胁迫时 表达量呈现不同程度的上调。这种 基因的全基因组分析为了解植物中 基因的进化关系提供信息，并且条斑紫菜受温度和失水胁迫时 基因的表达分析为改良条斑紫菜育种提供参考。关键词：条斑紫菜；温度胁迫；失水胁迫；超氧化物歧化酶；基因家族中图法分类号：文献标志码：文章编号：（）：引用格式：管晓伟，王冬梅，陈睿，等 条斑紫菜 基因家族的全基因组分析及温度和失水胁迫下表达研究 中国海洋大学学报（自然科学版），（）：，（）：*基金项目：山东省自然科学基金项目（）资助 （）收稿日期：；修订日期：作者简介：管晓伟（），女，硕士生。：*通讯作者：紫菜作为一种典型的红藻品种，是世界上最重要的海藻经济作物之一，在东亚国家中被广泛养殖。条斑紫菜主要分布在潮间带，由于潮汐作用和大风的影响，周期性地经历潮汐变化引起渗透压、温度和光照的胁迫，这些胁迫通常会使条斑紫菜产生活性氧（，）。过量的活性氧，比如超氧阴离子（）、过氧化氢（）和单线态氧（），会导致膜损伤、蛋白质氧化和 损伤，甚至导致无法修复的代谢功能障碍和细胞死亡，并对植物的生长产生不利影响。植物体内存在着活跃的酶促防御系统，其中超氧化物歧化酶（）是最重要的酶，可以将有毒的超氧阴离子歧化为 和，过氧化物酶和氧化物酶可以进一步催化 变成。广泛存在于真核与原核生物中，根据其活性中心结合的金属辅因子，可分为类：、和 。是 最 原 始 的 ，与 有较高的同源性，存在于原生生物和少数植物的叶绿体中，而 分布在线粒体和细胞质中；植物中，主要定位在高等植物细胞质和叶绿体；发现较晚，目前仅在链霉菌和蓝藻中发现，与其他蛋白的重复序列较少。在一些藻类受到胁迫时，的活性将发生变化。赤潮异弯藻中 活性在响应紫外辐射增强时变化明显；在重金属胁迫下，巴夫藻中 活性增加。在条斑紫菜赤腐病的免疫过程中 的表达量上调。本文基于本实验室前期获得的条斑紫菜基因组数据库，对条斑紫菜中 基因家族进行全基因组鉴定和分析，进一步研究 基因在温度和失水胁迫下的转录表达变化，并对表达丰度高的 基因进行 验证，为探究条斑紫菜 基因家族的生物学特性和抗逆特性提供了有价值的信息，同时为分子育种工作提供理论依据。材料与方法实验材料实验室培养的纯系条斑紫菜（）。期管晓伟，等：条斑紫菜 基因家族的全基因组分析及温度和失水胁迫下表达研究方法条斑紫菜中 基因的鉴定从 数据库（：）下 载 （）和 （和 ）的隐马尔可夫模型（，），通 过 在本实验室建立的条斑紫菜基因组本地数据库中检索条斑紫菜中 蛋白序列（阈值 ）；根据检索到的 蛋白序列构建条斑紫菜特异性的 模型，利用该模型在数据库中再次检索并提取条斑紫菜 蛋白序列。将次检索到的蛋白序列合并，手动去除重复序列，并将这些序列上传到 数据库（：），确 认 提 取 出 的 蛋 白 含 有 结构域。使用 分析条斑紫菜 蛋白的 等 电 点（）及 分 子 量（），并 通 过 在 线 网 站 （：）、（：）和 （：？）共同预测条斑紫菜中 基因的亚细胞定位。若在种以上网站中显示同一预测结果，则该结果为正确预测结果。条斑紫菜 家族系统进化分析系统进化分析中条斑紫菜（.）的相关序列来自本实验室测序获得的基因组，拟南芥（）、水稻（）和大叶藻（）的 相关序列来自文献 。使用 构建条斑紫菜和以上物种的 蛋白序列构建系统进化树，建树方法为最大似然法，迭代 次。条斑紫菜 蛋白结构分析使用在线网站（：）对 蛋白保守结构域进行分析和预测，设置分 布模 型为 、预测保守基序数量为、最短 设置为、最长 设置为 。根据条斑紫菜 家族成员的蛋白序列，通过在线网站 （：？）对 蛋白的二级结构进行分析，并使用 （：）预测 蛋白的三级结构。染色体定位和基因复制分析利用 对基因家族成员进行染色体定位分析及可视化。为探究 家族的基因复制情况，本研究进一步利用 进行基因组复制事件分析，并利用 计算值。根据条斑紫菜 基因家族的基因组信息和转录组 进行基因结构注释，使用 对条斑紫菜 注释文件中获得的 基因家族的基因位置信息进行分析，获取基因内含子外显子分布的信息。条斑紫菜 基因启动子区域顺式作用元件预测调取条斑紫菜中的 基因起始密码子上游序列（）并上传至 数据库（：）预测条斑紫菜启动子区域的顺式作用元件，并通过 将预测结果可视化。条斑紫菜 基因在环境胁迫下的表达模式分析基于实验室前期所获得的条斑紫菜在温度 和失水胁迫下的转录组数据，探究条斑紫菜 基因在不同胁迫下的表达模式。使用 平台（：）对不同温度胁迫条件下 基因的 （差异倍数）值绘制热图（在不同胁迫条件下 值均小于的 基因不参与热图的绘制），其中温度胁迫和失水胁迫差异倍数是实验组与对照组的比值，复水组的差异倍数是复水组同 失水组的比值。环境胁迫材料处理及定量验证其他培养条件不变，分别收集、和 条件下培养的条斑紫菜叶状体材料；在 培养箱中恒温条件下，收集失水、和失水 后复水 的条斑紫菜叶状体材料。条斑紫菜的失水率按以下公式计算：（）。式中：为藻体失水率；为藻体鲜质量；为失水后藻体质量；为 下将新鲜藻体烘干至藻体质量不再变化时测得的质量。提取 后进行反转录，得到相关样品的 。选取条斑紫菜 家族中表达丰度较高的成员（、和 ）验证 在不同环境胁迫下的表达模式。以 培养的未失水材料为对照组，温度胁迫或失水胁迫的材料为实验组，通过 技术检测目的基因在不同环境胁迫下的表达变化，引物序列如表所示。选用 作为内参基因，用法计算目的基因在不同环境胁迫下的相对表达量。表 引物序列 基因名称 引物序列（）（）：；：；：；：；：中国海洋大学学报 年结果条斑紫菜 基因家族成员的鉴定通过 搜索，最终在条斑紫菜（.，）基因组中鉴定出 个 基因，依次命名为 （见表）。这些基因的 序列长度 在 之间，编码的氨基酸长度在 之间；所编码的蛋白质分子量为 ，为 。根据不同网站的亚细胞定位预测结果，有个蛋白定位于叶绿体；个定位于线粒体；个属于分泌途径；个蛋白的定位在不同预测网站中未获得一致结果。表条斑紫菜 基因和所编码蛋白的特征 .基因名称 基因 编码序列 氨基酸 分子量 等电点 亚细胞定位 结构域预测 叶绿体 叶绿体 分泌途径 、分泌蛋白 线粒体、叶绿体 叶绿体 叶绿体 注：超氧化物歧化酶。；：超氧化物歧化酶，折叠结构域。，；：超氧化物歧化酶，碳端结构域。，；：在种以上的预测网站中均没有获得相同的亚细胞定位结果。条斑紫菜 家族系统进化分析将条斑紫菜中的 蛋白质序列与来自拟南芥（.，）、水稻（.，）和大叶藻（.，）中的 条 蛋白序列一起进行进化分析，根 据 聚 类 结 果 可 将 其 分 为 类（见 图）。、和其他物种中的 类蛋白聚在一起，并且具有 结构域，属 于 条 斑 紫 菜 中 的 ；、和其他物种中的 类蛋白聚在一起，并且具有 折叠结构域和碳端结构域，属于条斑紫菜中的 ；和其他物种中的 类蛋白聚在一起，并且具有 碳端结构域，属于条斑紫菜中的 。条斑紫菜 蛋白结构预测条斑紫菜保守基序分析显示（见图），成员蛋白保守基序均包含 、和 ，这个 在 中高度保守。此 外，除 和 外 其 他 中均含有 ，保守性较高。和 成员中，成员中都存在 和，成 员 和 成 员 、都包含 。在对条斑紫菜 蛋白的二级结构预测中（见表），和 成员中螺旋占比为 ，而 成 员 中螺 旋 占 比 均 未 超 过；和 成员中，除 中折叠占比，其余成员占比均未超过；成员中折叠最低占比为。在对 蛋白的三级结构预测中（见图），、和 具 有 一 个 铜 离 子 结 合 位 点；和 具 有 一 个 锰 离 子 结 合 位 点；具有个铜离子和 个锌离子结合位点；具有个锌离子结合位点；具有一个锌离子结合位点。期管晓伟，等：条斑紫菜 基因家族的全基因组分析及温度和失水胁迫下表达研究图条斑紫菜 家族系统进化分析 .图条斑紫菜 家族保守基序分析 .表条斑紫菜 蛋白二级结构预测 .蛋白名称 无规卷曲 螺旋 折叠 跨膜螺旋 蛋白名称 无规卷曲 螺旋 折叠 跨膜螺旋 中国海洋大学学报 年图条斑紫菜 蛋白家族三级结构预测 .条斑紫菜 基因染色体定位和基因复制分析基因在染色体上的分布与其生物学功能有一定的相关性。染色体定位结果（见图）表明，、和 定位于条斑紫菜号染色体；、和 定位于号染色体；、和 定位在号染色体。基因复制分析结果表明，和 是串联重复基因，其非同义替换位点替换率 、同义替换位点替换率 ，所以 ，。这表明 和 基因在进化中受纯化选择。如图 所示，条斑紫菜 基因结构说明，成员基因结构简单，个基因均无内含子，和 成员中，、和 具有个外显子和个内含子；含有个外显子和个内含子。条斑紫菜 基因顺式作用元件分析为进一步探索条斑紫菜中 基因的转录调控机制，调 取 基 因 家 族 成 员 起 始 密 码 子 上 游 的序列来预测启动子区域顺式作用元件（见图）。条斑紫菜 基因家族成员有大量与激素响应相关的顺式作用元件，包括脱落酸响应元件（）、生长素响应元件（）、茉莉 酸甲酯 响 应 元 件（）、赤霉素响应元件（）和水杨酸响应元件（）；与逆境响应相关的顺图条斑紫菜 基因家族染色体定位 .式作用元件包括光响应元件（、和 等）、结合位点相关元件（）、低温响应元件（）、干旱诱导作用相关元件（）和缺氧性诱导作用相关元件（）。此外，还有一些与生长发育相关的顺式作用元件，包括玉米醇溶蛋白代谢调节 相 关 元 件（）、分 生 组 织 表 达 相 关 元 件（）、胚乳表达相关元件（）和分化相关元件（）。期管晓伟，等：条斑紫菜 基因家族的全基因组分析及温度和失水胁迫下表达研究图条斑紫菜 基因结构示意图 图条斑紫菜 基因家族顺式作用元件分布 .条斑紫菜 基因在温度胁迫下的表达模式分析如图所示，在受到不同的胁迫时，会有不同的表达模式。在受到高温胁迫时，、和 表达量上调，和 表达量变化不大，其他个 表达量下调；受到低温胁迫时，表达量上调，和 表达量变化不大，其他个 表达下调；受到 的低温胁迫时，表达量上调，、和 表达量变化不大，其他个 表 达 下 调。在 受 到 失 水 胁 迫 时，、和 在不同失水程度的条斑紫菜中表达量均上调；在中、高度失水（失水、）时表达量上调；在中度失水时表达下调，其他失水程度变化量不大；在轻度失水（）时变化量不大，在中、高度失水时表达下调；在不同失水程度时表达量变化均不大；在不同失水程度的表达量均下调。条斑紫菜在失水 后 复 水 时，、和 表达量变化不大，其他个 表达量下调，不存在表达量上调的 ，推测这可能与失水胁迫的解除相关。、和 在温度和失水胁迫下 值均小于，不参与热图绘制。本研 究 对 表 达 丰 度 高 的 、和 采用 方法，对其在温度和失水胁迫下的转录动态进行验证。结果显示，这个基因与本研究在转录组数据中观察到的转录表达变化一致。在 高温胁迫时表达量极显著上调，但在和时表达量极显著下调；在中度失水胁迫时，表达量极显著下调，轻度和高度失水胁迫时表达量无显著变化。在 高温胁迫时表达量极显著下调，但在和 时表达量极显著上调，并且随温中国海洋大学学报 年度降低，表达量增加；在不同程度的失水胁迫下，的表达量随失水程度的增加而增加，且表达量均呈极显著上调。在受到不同温度胁迫时相对表达量均显著下调；在受到轻度失水胁迫时，表达量变化无显著差异，在失水 时表达量极显著上调，失水 时表达量显著上调。当条斑紫菜失水率达到 后复水 ，表达量显著下调，和 表达量极显著下调（见图）。（：不同温度胁迫；：不同失水胁迫；：失水 后复水 。：；：；：）图不同环境胁迫下 基因的表达分析 （：；：；：不同温度胁迫；：不同失水胁迫；：失水 后复水 。：；：；：）图不同环境胁迫下 基因的相对表达量 期管晓伟，等：条斑紫菜 基因家族的全基因组分析及温度和失水胁迫下表达研究讨论许多研究表明，对细胞有毒害作用，其浓度增加会引起 链断裂、蛋白降解，并破坏细胞结构和功能。生物在长期进化过程中形成了可以清除活性氧的酶类和非酶类物质，以此完善抗氧化系统，使活性氧维持在较低水平，保障生物体正常生长代谢。植物细胞中 的产生和清除是动态平衡的，但植物在受到高温、盐碱和重金属等非生物胁迫时，细胞内会产生大量的 ，而 酶是清除活性氧过程中第一个起作用的抗氧化酶。条斑紫菜作为一种潮间带藻类，在生长过程中会受到很多胁迫，包括温度或者失水胁迫。温度胁迫会影响植物中的 平衡，在大叶藻中，温度过高或过低都会引起 的增加，从而导致膜脂过氧化。本研究观察到条斑紫菜受到温度胁迫时会提高 基因的转录表达，其中在高温胁迫下有个 基因的转录呈现上调，低温下有个 基因转录上调，高温胁迫下转录表达的 基因要多于低温胁迫，这与在角叉菜中的研究一致。在高温胁迫下表达的 包括 和 ，低温胁迫下只有 表达，不同胁迫条件下表达的 基因也不同，说明在不同的温度胁迫条件下，响应调控的模式存在差异。在低温胁迫和失水胁迫下表达量上调的 都属于 ，条斑紫菜复水过程中所有的 表达下调，并且在高温胁迫中表达量上调的种 ，也有种属于 。这些结果共同表明了，在条斑紫菜的抗逆过程中发挥着更重要的作用。从内含子数量上看，不含内含子，这很大程度上缩短了基因表达的过程，使条斑紫菜在面对胁迫时能快速表达 ，减少胁迫带来的损害。的三级结构也为其快速响应胁迫提供便利，二级结构以折叠为主，其活性位点位于折叠外，这与其疏水界面一同保障 结构稳定性，从而可以快速进行催化功能。近期在玉米中发现，低温胁迫会促使脱落酸积累；而茉莉酸甲酯处理可以明显提高小麦幼苗细胞中的 酶活性 。在和种低温胁迫下均上调表达的 被预测到有种顺式作用元件，其中脱落酸和茉莉酸甲酯的响应元件可能在条斑紫菜低温胁迫 响 应 时 发 挥 重 要 作 用。、和 被预测到含有低温响应的顺式作用元件，但在和低温胁迫过程中，这些基因表达量变化不大甚至下调。鉴于所使用的 是植物顺式作用元件的预测网站，这暗示条斑紫菜和植物的低温胁迫受到 不 同 的 转 录 调 控。、和 响应高温胁迫表达，和 的顺式作用元件种类基本相同，并且在低温胁迫下表达量变化不大，是响应高温胁迫的主要的 。同样，在失水条件下 表达量上调，其 种 基因顺式作用元件类型基本相同，这可能是因为受相同的分子机制调控。是本文设置胁迫环境下唯一上调表达的 （高温胁迫下表达），并且 表达量的差异倍数小于 ，说明 和 也能够响应环境胁迫，但不是主要发挥作用的 。结语本研究首次对条斑紫菜 基因家族进行生物信息学分析，解析了条斑紫菜 基因家族的组成、分类、基因结构蛋白结构和进化特点，并进一步探究了 基因在温度或失水胁迫下的表达变化，为进一步研究 基因潜在的生物学功能以及改良条斑紫菜育种提供了参考。参考文献：，：，（），：，（）：，.（），：，（），（）：，（）：魏婧，徐畅，李可欣，等 超氧化物歧化酶的研究进展与植物抗逆性植物生理学报，（）：，（）：，（）：，（），：中国海洋大学学报 年 ：，（）：冯坤，郑青松，俞佳虹，等超氧化物歧化酶的遗传特征及其在植物抗逆性中的研究进展分子植物育种，（）：，（），（）：张容芳，唐东山，刘飞藻类抗氧化系统及其对逆境胁迫的响应环境科学与管理，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：，.（），（）：崔正彩，孔凡娜，茅云翔，等 条斑紫菜 和 基因家族鉴定及失水胁迫表达模式分析 海洋与湖沼，（）：，（）：，：，；（）：奉斌，代其林，王劲非生物胁迫下植物体内活性氧清除酶系统的研究进展绵阳师范学院学报，（）：，（）：马旭俊，朱大海植物超氧化物歧化酶（）的研究进展遗传，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（），：齐付国，李建民，段留生，等 冠菌素和茉莉酸甲酯诱导小麦幼苗低温抗性的研究 西北植物学报，（）：，（）：，（，）：（）（），.，、，.：；责任编辑高蓓