第十四章免疫细胞的分离与检测.ppt

Separation and Assays for Immune Cells免疫细胞免疫细胞(xbo)的分离与检测的分离与检测第一页，共九十五页。免疫免疫免疫免疫(miny)(miny)细胞的种类细胞的种类细胞的种类细胞的种类ll淋巴细胞：淋巴细胞：淋巴细胞：淋巴细胞：T T细胞细胞细胞细胞(xbo)(xbo)、B B细胞、细胞、细胞、细胞、NKNK细胞等细胞等细胞等细胞等ll单核巨噬细胞单核巨噬细胞单核巨噬细胞单核巨噬细胞ll树突状细胞树突状细胞树突状细胞树突状细胞ll粒细胞粒细胞粒细胞粒细胞第二页，共九十五页。分离分离分离分离(fnl)(fnl)免疫细胞的样本来源免疫细胞的样本来源免疫细胞的样本来源免疫细胞的样本来源ll外周血外周血外周血外周血ll脾脏脾脏脾脏脾脏(pzng)(pzng)ll淋巴结淋巴结淋巴结淋巴结ll胸腺胸腺胸腺胸腺ll骨髓骨髓骨髓骨髓第三页，共九十五页。分离免疫分离免疫分离免疫分离免疫(miny)(miny)细胞的目的细胞的目的细胞的目的细胞的目的ll检测免疫细胞的数量和功能，观察机体检测免疫细胞的数量和功能，观察机体检测免疫细胞的数量和功能，观察机体检测免疫细胞的数量和功能，观察机体(jt)(jt)免疫状免疫状免疫状免疫状态态态态ll免疫细胞的细胞生物学研究免疫细胞的细胞生物学研究免疫细胞的细胞生物学研究免疫细胞的细胞生物学研究ll免疫细胞的培养和建株免疫细胞的培养和建株免疫细胞的培养和建株免疫细胞的培养和建株第四页，共九十五页。分离免疫细胞分离免疫细胞分离免疫细胞分离免疫细胞(xbo)(xbo)的一般原理的一般原理的一般原理的一般原理ll物理学和生物学特征物理学和生物学特征物理学和生物学特征物理学和生物学特征ll密度大小密度大小密度大小密度大小ll表面标志表面标志表面标志表面标志(biozh)(biozh)ll其它活性：吞噬、黏附等其它活性：吞噬、黏附等其它活性：吞噬、黏附等其它活性：吞噬、黏附等第五页，共九十五页。本章本章本章本章(bn zhn)(bn zhn)主要内容主要内容主要内容主要内容1.1.免疫细胞免疫细胞免疫细胞免疫细胞(xbo)(xbo)的分离与纯化的分离与纯化的分离与纯化的分离与纯化 2.淋巴细胞的数量淋巴细胞的数量(shling)(shling)检测检测4.吞噬细胞功能检测吞噬细胞功能检测3.淋巴细胞的功能检测淋巴细胞的功能检测第六页，共九十五页。第一节第一节第一节第一节 免疫免疫免疫免疫(miny)(miny)(miny)(miny)细胞的分离与纯化细胞的分离与纯化细胞的分离与纯化细胞的分离与纯化ll白细胞的分离白细胞的分离白细胞的分离白细胞的分离 ll外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离 ll淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化淋巴细胞和单核细胞的分离与纯化(chn hu)(chn hu)(chn hu)(chn hu)ll淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞亚群的分离 ll细胞活力的检测细胞活力的检测细胞活力的检测细胞活力的检测第七页，共九十五页。一、白细胞的分离一、白细胞的分离一、白细胞的分离一、白细胞的分离(fnl)(fnl)细胞密度不同，沉降速度不一样细胞密度不同，沉降速度不一样细胞密度不同，沉降速度不一样细胞密度不同，沉降速度不一样(yyng)(yyng)。粒细胞粒细胞粒细胞粒细胞1.092,1.092,红细胞红细胞红细胞红细胞1.093,1.093,沉降速度不一样。沉降速度不一样。沉降速度不一样。沉降速度不一样。ll自然沉降法自然沉降法自然沉降法自然沉降法(血浆、白细胞、红细胞血浆、白细胞、红细胞血浆、白细胞、红细胞血浆、白细胞、红细胞)ll聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维聚合物加速沉降法：明胶、右旋糖酐、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮等。素、聚乙烯吡咯烷酮等。素、聚乙烯吡咯烷酮等。素、聚乙烯吡咯烷酮等。(会增加白细胞的黏性会增加白细胞的黏性会增加白细胞的黏性会增加白细胞的黏性)第八页，共九十五页。二、外周血单个核细胞二、外周血单个核细胞二、外周血单个核细胞二、外周血单个核细胞(xbo)(xbo)的分离的分离的分离的分离 外周血细胞外周血细胞外周血细胞外周血细胞(xbo)(xbo)的密度的密度的密度的密度 血小板：血小板：血小板：血小板：1.030-1.0351.030-1.035 淋巴细胞和单核细胞：淋巴细胞和单核细胞：淋巴细胞和单核细胞：淋巴细胞和单核细胞：1.075-1.0901.075-1.090 粒细胞：粒细胞：粒细胞：粒细胞：1.092 1.092 红细胞：红细胞：红细胞：红细胞：1.0931.093 外周血单个核细胞外周血单个核细胞(xbo)(peripheral blood mononuclear cell,PBMC):Monocyte、Lymphocyte第九页，共九十五页。聚蔗糖聚蔗糖聚蔗糖聚蔗糖(zhtng)(zhtng)（FicollFicoll）泛影葡胺分层液法）泛影葡胺分层液法）泛影葡胺分层液法）泛影葡胺分层液法（一）原理（一）原理(yunl)(yunl)和方法和方法1.单次密度梯度分离法单次密度梯度分离法 单次密度梯度单次密度梯度 连续连续(linx)密度梯度密度梯度第十页，共九十五页。2.试剂试剂(shj)：FicollHypaqueFicoll：聚蔗糖聚蔗糖(zhtng)，MW：40 000，高密度，高密度，低渗透压、无毒性，低渗透压、无毒性，6Ficoll密度为密度为1.020Hypaque：泛影葡糖胺，泛影葡糖胺，34 hypaque的密度为的密度为1.200，用于调整，用于调整(tiozhng)分离液的密度。分离液的密度。分离人外周血单个核细胞用分离人外周血单个核细胞用1.0770.001的密度的密度分离液。分离液。第十一页，共九十五页。3.3.3.3.离心分离：离心分离：离心分离：离心分离：将细胞将细胞将细胞将细胞叠加在密度合适的分层叠加在密度合适的分层叠加在密度合适的分层叠加在密度合适的分层液液液液(1.075-1.09)(1.075-1.09)(1.075-1.09)(1.075-1.09)上层，上层，上层，上层，经离心经离心经离心经离心(lxn)(lxn)(lxn)(lxn)后细胞可分后细胞可分后细胞可分后细胞可分为不同的区带。为不同的区带。为不同的区带。为不同的区带。第十二页，共九十五页。4.收集细胞收集细胞5.洗涤洗涤(xd)、计数、计数第十三页，共九十五页。（二）方法（二）方法（二）方法（二）方法(fngf)(fngf)(fngf)(fngf)评价评价评价评价ll是分离是分离PBMCPBMC最常用的方法最常用的方法ll操作简单操作简单(jindn)(jindn)，不需特殊仪器设备，不需特殊仪器设备ll分离纯度高，可达分离纯度高，可达9595ll细胞得率高，可达细胞得率高，可达8080第十四页，共九十五页。三、淋巴细胞和单核细胞的分离三、淋巴细胞和单核细胞的分离三、淋巴细胞和单核细胞的分离三、淋巴细胞和单核细胞的分离(fnl)(fnl)（一）红细胞的去除（一）红细胞的去除（一）红细胞的去除（一）红细胞的去除(q ch)(q ch)(q ch)(q ch)：低渗：低渗：低渗：低渗0.830.830.830.83NHNHNHNH4 4 4 4ClClClCl处处处处理理理理（二）血小板的去除（二）血小板的去除(q ch)(q ch)：离心洗涤；：离心洗涤；FCSFCS（三）单核细胞的去除（三）单核细胞的去除 黏附去除法、羰基铁粉吞噬法黏附去除法、羰基铁粉吞噬法（四）（四）Percoll离心法纯化离心法纯化淋巴细胞与单核细胞淋巴细胞与单核细胞第十五页，共九十五页。单核细胞的去除单核细胞的去除(q ch)ll黏附去除法：黏附去除法：黏附去除法：黏附去除法：根据单核细胞具有黏附作用而去除根据单核细胞具有黏附作用而去除根据单核细胞具有黏附作用而去除根据单核细胞具有黏附作用而去除(q ch)(q ch)（培养；凝胶柱）（培养；凝胶柱）（培养；凝胶柱）（培养；凝胶柱）ll羰基铁粉法：羰基铁粉法：羰基铁粉法：羰基铁粉法：单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能单核细胞具有吞噬羰基铁粉的能力（力（力（力（FicollFicoll离心；磁铁）离心；磁铁）离心；磁铁）离心；磁铁）第十六页，共九十五页。vv粘附粘附粘附粘附(zhn f)(zhn f)贴壁法贴壁法贴壁法贴壁法ll单核细胞贴壁生长单核细胞贴壁生长单核细胞贴壁生长单核细胞贴壁生长ll玻璃玻璃玻璃玻璃(b l)(b l)(b l)(b l)、塑料平皿、塑料平皿、塑料平皿、塑料平皿/培养瓶、培养瓶、培养瓶、培养瓶、37373737、1h1h1h1hll取未贴壁细胞取未贴壁细胞取未贴壁细胞取未贴壁细胞-淋巴细胞（淋巴细胞（淋巴细胞（淋巴细胞（T T T T、B B B B）ll刮下贴壁细胞刮下贴壁细胞刮下贴壁细胞刮下贴壁细胞-纯单核细胞纯单核细胞纯单核细胞纯单核细胞ll缺点：缺点：缺点：缺点：B B B B细胞也有较弱贴壁，使细胞也有较弱贴壁，使细胞也有较弱贴壁，使细胞也有较弱贴壁，使B B B B细胞收率细胞收率细胞收率细胞收率第十七页，共九十五页。v过柱吸附过柱吸附(xf)法法l层析过柱，单核细胞滞留层析过柱，单核细胞滞留(zhli)于层析柱中于层析柱中l洗脱洗脱-淋巴细胞淋巴细胞l层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶层析柱：玻璃纤维或葡聚糖凝胶l粘附能力：粘附能力：M、MonDC BC TC=RBC第十八页，共九十五页。PercollPercoll分层液法分层液法分层液法分层液法llPercollPercoll分层液：经聚乙烯分层液：经聚乙烯分层液：经聚乙烯分层液：经聚乙烯吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒吡咯烷酮处理过的硅胶颗粒混悬液，对细胞混悬液，对细胞混悬液，对细胞混悬液，对细胞(xbo)(xbo)无毒、无毒、无毒、无毒、无刺激。无刺激。无刺激。无刺激。llPercollPercoll原液加原液加原液加原液加PBSPBS稀释，稀释，稀释，稀释，高速离心（高速离心（高速离心（高速离心（21000g21000g）连续）连续）连续）连续密度梯度。密度梯度。密度梯度。密度梯度。第十九页，共九十五页。ll将将将将PBMCPBMC加在分离液加在分离液加在分离液加在分离液上低速上低速上低速上低速(d s)(d s)离心后可离心后可离心后可离心后可分离分离分离分离PBMCPBMC中的单核中的单核中的单核中的单核细胞和淋巴细胞细胞和淋巴细胞细胞和淋巴细胞细胞和淋巴细胞第二十页，共九十五页。淋巴细胞亚群的分离淋巴细胞亚群的分离(fnl)(fnl)E E花环分离法花环分离法尼龙棉柱分离法尼龙棉柱分离法补体细胞毒法补体细胞毒法亲和板结合亲和板结合(jih)(jih)分离法分离法免疫磁珠分离法免疫磁珠分离法细胞分选术细胞分选术第二十一页，共九十五页。E花环花环(hu hun)分分离法离法T细胞细胞(xbo)（CD2/LFA2/E受体）受体）绵羊绵羊(minyng)红细胞红细胞SRBCE花环花环比重增加比重增加Ficoll-Hypaque 分离液分离分离液分离低渗低渗第二十二页，共九十五页。第二十三页，共九十五页。尼龙尼龙(nlng)(nlng)棉柱分离法棉柱分离法尼龙尼龙(nlng)(nlng)棉装入棉装入5ml5ml注射器注射器中中加入加入(jir)淋巴细胞悬液淋巴细胞悬液37、5 CO2、12hRPMI 1640RPMI 1640完全培养基灌洗完全培养基灌洗洗脱液中为洗脱液中为T T细胞细胞原理原理 B B细胞可粘细胞可粘 附尼龙毛；附尼龙毛；T T细胞不具细胞不具 有粘附活性。有粘附活性。第二十四页，共九十五页。方法方法方法方法(fngf)(fngf)评价：评价：评价：评价：实验室常用分离方法之一实验室常用分离方法之一实验室常用分离方法之一实验室常用分离方法之一 简便、易行简便、易行简便、易行简便、易行 获得细胞纯度获得细胞纯度获得细胞纯度获得细胞纯度(chnd)(chnd)(chnd)(chnd)较高较高较高较高T T T T细胞细胞细胞细胞90909090B B B B细胞细胞细胞细胞80808080尼龙毛柱法尼龙毛柱法尼龙毛柱法尼龙毛柱法E E E E花环法，花环法，花环法，花环法，T T T T细胞可达细胞可达细胞可达细胞可达99999999以上以上以上以上第二十五页，共九十五页。（三）补体细胞毒法（三）补体细胞毒法（三）补体细胞毒法（三）补体细胞毒法ll原理：免疫细胞表面原理：免疫细胞表面原理：免疫细胞表面原理：免疫细胞表面(biomin)(biomin)的某种的某种的某种的某种AgAg与相应与相应与相应与相应AbAb结合，结合，结合，结合，加入补体，借助加入补体，借助加入补体，借助加入补体，借助补体介导的细胞毒补体介导的细胞毒补体介导的细胞毒补体介导的细胞毒作用，破坏作用，破坏作用，破坏作用，破坏AgAg阳阳阳阳性的细胞，收集性的细胞，收集性的细胞，收集性的细胞，收集AgAg阴性的细胞。阴性的细胞。阴性的细胞。阴性的细胞。ll如：在如：在如：在如：在LCLC悬液中加入悬液中加入悬液中加入悬液中加入(jir)(jir)抗人抗人抗人抗人IgIg抗体去除抗体去除抗体去除抗体去除B B细胞，得到细胞，得到细胞，得到细胞，得到T T细胞。细胞。细胞。细胞。ll如：在如：在如：在如：在T T细胞悬液中加入抗细胞悬液中加入抗细胞悬液中加入抗细胞悬液中加入抗CD4CD4抗体抗体抗体抗体(kngt)(kngt)去除去除去除去除CD4CD4+T T细细细细胞，得到胞，得到胞，得到胞，得到CD8CD8+T T细胞。细胞。细胞。细胞。第二十六页，共九十五页。亲和板分离法亲和板分离法第二十七页，共九十五页。（五）免疫（五）免疫（五）免疫（五）免疫(miny)(miny)磁珠法磁珠法磁珠法磁珠法 原理原理原理原理(yunl)(yunl)：ll将抗体交联于磁珠表面形成将抗体交联于磁珠表面形成将抗体交联于磁珠表面形成将抗体交联于磁珠表面形成免疫磁珠免疫磁珠免疫磁珠免疫磁珠 （Immunomagnetic beadImmunomagnetic bead，IMBIMB）l加入细胞悬液，加入细胞悬液，IMB上的上的Ab与细胞表面的与细胞表面的Ag反应反应(fnyng)，形成抗体形成抗体/抗原的复合物抗原的复合物。l外加磁场，分选出结合有免疫细胞的外加磁场，分选出结合有免疫细胞的IMB。第二十八页，共九十五页。分法：分法：分法：分法：ll直接直接直接直接(zhji)(zhji)法法法法ll间接法间接法间接法间接法第二十九页，共九十五页。直接直接(zhji)法法抗抗CD3磁球磁球磁球结合磁球结合T细胞细胞加入加入B和和T细胞中细胞中负向选择负向选择正向选择正向选择磁架进行分离磁架进行分离第三十页，共九十五页。间接间接(jin ji)法法单克隆抗体单克隆抗体CD3羊抗鼠修饰磁球羊抗鼠修饰磁球BiomagT细胞细胞T细胞细胞第三十一页，共九十五页。免疫磁珠法细胞免疫磁珠法细胞(xbo)分选过程分选过程第三十二页，共九十五页。免免疫疫磁磁珠珠细细胞胞分分选选装装置置特点特点:简便简便,快速快速(kui s),费用低费用低,无需特殊设备无需特殊设备第三十三页，共九十五页。全自动细胞全自动细胞(xbo)分选仪分选仪第三十四页，共九十五页。MACS法法（magnetic activated cell stoter）SN 阴性阴性(ynxng)选择选择（负选法）（负选法）阳性选择阳性选择（正选法）（正选法）主要主要(zhyo)(zhyo)组成组成:MACSMACS微珠微珠MACSMACS分选柱分选柱MACSMACS分选器分选器 第三十五页，共九十五页。第三十六页，共九十五页。第三十七页，共九十五页。评价评价(pngji)(pngji)l高纯度（高纯度（9599）l高回收率（高回收率（9095）l高活性（高活性（99100）l效果可与流式细胞仪媲美效果可与流式细胞仪媲美(pmi)，l但更经济、省时、简便、快速但更经济、省时、简便、快速第三十八页，共九十五页。（六）流式细胞仪分选技术（六）流式细胞仪分选技术(jsh)经典方法：经典方法：l离心离心l粘附粘附(zhn f)法法l补体细胞毒法补体细胞毒法l淘洗法淘洗法l免疫磁珠法免疫磁珠法 经典分离经典分离(fnl)方法的局限性方法的局限性l 纯度纯度l 稀有细胞稀有细胞？l 高速高速l 高纯度高纯度l 高精度高精度第三十九页，共九十五页。ll流式细胞仪（流式细胞仪（流式细胞仪（流式细胞仪（FCMFCM）具有）具有）具有）具有(jyu)(jyu)高速、高速、高速、高速、高纯度、高精度高纯度、高精度高纯度、高精度高纯度、高精度优势。优势。优势。优势。ll激活激活激活激活(j hu)(j hu)细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。细胞分类仪：用来分析、鉴定细胞的流式细胞仪。llFluorescence activated cell sorter Fluorescence activated cell sorter（FACSFACS）第四十页，共九十五页。细胞细胞细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)分选分选分选分选 细胞细胞细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)分选（分选（分选（分选（cell sortingcell sorting）：）：）：）：有选择地从一个混有选择地从一个混有选择地从一个混有选择地从一个混合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术。合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术。合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术。合细胞群体中分离出某一类特定细胞的技术。第四十一页，共九十五页。488 nm laser+-Fluorescence Activated Cell SortingCharged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector第四十二页，共九十五页。四、吞噬细胞四、吞噬细胞四、吞噬细胞四、吞噬细胞(tn sh x bo)(tn sh x bo)的分离的分离的分离的分离吞噬细胞吞噬细胞吞噬细胞吞噬细胞(tn sh x bo)(tn sh x bo)种种种种类类类类l大吞噬细胞大吞噬细胞(tn sh x bo)：单核细胞、巨噬细胞单核细胞、巨噬细胞l小吞噬细胞：小吞噬细胞：中性粒中性粒细胞细胞l巨噬细胞：巨噬细胞：斑蝥敷贴法、腹斑蝥敷贴法、腹腔渗出分离法、腔渗出分离法、l中性粒细胞：右旋糖酐分离中性粒细胞：右旋糖酐分离法、法、FicollHypaque分层分层液分离法液分离法吞噬细胞分离法吞噬细胞分离法吞噬细胞分离法吞噬细胞分离法第四十三页，共九十五页。斑蟊敷贴斑蟊敷贴(f ti)法分离人巨噬细胞法分离人巨噬细胞l l 20 20世纪世纪7070年代年代(nindi)(nindi)(nindi)(nindi)由我国免疫学家创立由我国免疫学家创立l 斑蝥的酒精浸出液可趋化巨噬细胞斑蝥的酒精浸出液可趋化巨噬细胞l 分离方法分离方法第四十四页，共九十五页。腹腔腹腔(fqing)渗出法分离腹腔渗出法分离腹腔(fqing)巨噬巨噬细胞细胞腹腔腹腔(fqing)(fqing)注射诱导注射诱导剂剂3 34 days4 days腹腔内注射腹腔内注射(zhsh)(zhsh)(zhsh)(zhsh)肝素肝素PBSPBS处死动物，吸取腹腔液（含大量巨噬细胞）处死动物，吸取腹腔液（含大量巨噬细胞）洗涤细胞、计数洗涤细胞、计数第四十五页，共九十五页。3 3mlml肝素抗凝全血肝素抗凝全血肝素抗凝全血肝素抗凝全血1/41/4体积体积体积体积6 6右旋糖酐生理右旋糖酐生理右旋糖酐生理右旋糖酐生理盐水，室温静置盐水，室温静置盐水，室温静置盐水，室温静置30304040minmin，取上层白细胞，取上层白细胞，取上层白细胞，取上层白细胞，0.80.8NHNH4 4ClCl溶解红细胞，离心溶解红细胞，离心溶解红细胞，离心溶解红细胞，离心(lxn)(lxn)，取细胞，取细胞，取细胞，取细胞沉淀用沉淀用沉淀用沉淀用FicollFicollHypaqueHypaque分离液分离液分离液分离液分离中性粒分离中性粒分离中性粒分离中性粒细胞和单个核细胞。细胞和单个核细胞。细胞和单个核细胞。细胞和单个核细胞。右旋糖酐法分离右旋糖酐法分离(fnl)中性粒细胞中性粒细胞第四十六页，共九十五页。外周血中性外周血中性(zhngxng)粒细胞分离粒细胞分离(Ficoll-Hypaque)第四十七页，共九十五页。五、细胞五、细胞五、细胞五、细胞(xbo)(xbo)活力检测活力检测活力检测活力检测ll细胞活力：指细胞存活的数量，一般用百分表细胞活力：指细胞存活的数量，一般用百分表细胞活力：指细胞存活的数量，一般用百分表细胞活力：指细胞存活的数量，一般用百分表示。示。示。示。ll通常活力应通常活力应通常活力应通常活力应95%95%ll方法方法方法方法(fngf)(fngf)：苔盼蓝染色法：苔盼蓝染色法：苔盼蓝染色法：苔盼蓝染色法 活细胞：不着色活细胞：不着色活细胞：不着色活细胞：不着色 死细胞：着色死细胞：着色死细胞：着色死细胞：着色第四十八页，共九十五页。l白细胞的分离白细胞的分离(fnl)l外周血单个核细胞的分离外周血单个核细胞的分离 l淋巴细胞和单核细胞的分离淋巴细胞和单核细胞的分离l淋巴细胞亚群分离淋巴细胞亚群分离 l吞噬细胞的分离吞噬细胞的分离小结小结(xioji)：免疫细胞的分离与纯化免疫细胞的分离与纯化第四十九页，共九十五页。第五十页，共九十五页。第二节第二节 淋巴细胞的数量淋巴细胞的数量(shling)(shling)检测检测 T T细胞数量细胞数量(shling)(shling)(shling)(shling)检测检测 B B细胞数量的检测细胞数量的检测第五十一页，共九十五页。（一）（一）（一）（一）（一）（一）根据根据根据根据根据根据T T细胞表面细胞表面细胞表面细胞表面CDCDCD分子检测分子检测分子检测分子检测 间接荧光免疫法间接荧光免疫法间接荧光免疫法间接荧光免疫法 免疫组织免疫组织免疫组织免疫组织免疫组织免疫组织(zzh)(zzh)(zzh)化学法：酶标、金标法化学法：酶标、金标法化学法：酶标、金标法化学法：酶标、金标法化学法：酶标、金标法化学法：酶标、金标法 微量细胞毒试验微量细胞毒试验微量细胞毒试验微量细胞毒试验 花环技术花环技术花环技术花环技术一、一、T细胞数量细胞数量(shling)检测检测（二）根据（二）根据（二）根据（二）根据T T细胞受体检测细胞受体检测细胞受体检测细胞受体检测细胞受体检测细胞受体检测可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原(kngyun)(kngyun)(kngyun)肽肽肽肽肽肽-MHC-MHC四聚体复合法四聚体复合法四聚体复合法四聚体复合法 TetramerTetramerTetramer第五十二页，共九十五页。1.1.间接荧光间接荧光间接荧光间接荧光(ynggung)(ynggung)(ynggung)免疫法免疫法免疫法免疫法第五十三页，共九十五页。2.2.免疫免疫免疫免疫(miny)(miny)(miny)组织化学法：组织化学法：组织化学法：组织化学法：酶标：酶标：酶标：酶标：ABCABC，APAAPAPAAP 金标法金标法金标法金标法第五十四页，共九十五页。3.3.微量细胞毒试验微量细胞毒试验微量细胞毒试验微量细胞毒试验(shyn)(shyn)针对淋巴细胞针对淋巴细胞CD分子分子Ab与其相应的与其相应的CD分子结合，分子结合，借助补体依赖的细胞毒作用，可造成表达特定表面借助补体依赖的细胞毒作用，可造成表达特定表面(biomin)Ag的细胞损伤，破坏膜的完整性，应用伊红染料渗入细胞内的细胞损伤，破坏膜的完整性，应用伊红染料渗入细胞内，使之着染红色，而无相应，使之着染红色，而无相应CD分子的细胞则不受损伤，因分子的细胞则不受损伤，因而不着色。计数着色细胞数而不着色。计数着色细胞数,计算相应细胞的计算相应细胞的%。第五十五页，共九十五页。微量细胞毒试验微量细胞毒试验(shyn)淋巴细胞淋巴细胞抗抗CD分子分子(fnz)单抗单抗补体补体伊红染色伊红染色(rns)细胞着色细胞着色第五十六页，共九十五页。4.花环花环(hu hun)(hu hun)技术技术E花环花环l总花环形成率（总花环形成率（Et）：4过夜过夜(gu(guy)y)，60%80l活性花环形成率（活性花环形成率（Ea）：室温低速短时离心，室温低速短时离心，2040lE受体受体:CD2，表达，表达(biod)于于T细细 胞、胸腺细胞、胞、胸腺细胞、NK细胞细胞T cell第五十七页，共九十五页。lSPA-IgG（anti-CD）-CD分子分子(fnz)-T细胞亚群细胞亚群4.花环技术花环技术(jsh)(jsh)葡萄球菌花环法葡萄球菌花环法4.花环技术花环技术(jsh)(jsh)抗体致敏细胞花环法抗体致敏细胞花环法SRBC-anti-CD-T细胞（细胞（CD分子）分子）第五十八页，共九十五页。(三三三三)可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原可溶性抗原(kngyun)(kngyun)肽肽肽肽-MHC-MHC四聚体复合物法四聚体复合物法四聚体复合物法四聚体复合物法ll是一项近年发展起是一项近年发展起是一项近年发展起是一项近年发展起来来来来(q li)(q li)的新技术的新技术的新技术的新技术ll与与与与FCMFCM联合联合联合联合,定量检定量检定量检定量检测抗原特异性测抗原特异性测抗原特异性测抗原特异性T T淋巴淋巴淋巴淋巴细胞细胞细胞细胞第五十九页，共九十五页。第六十页，共九十五页。1.mIg的检测的检测:酶免疫法、荧光免疫法酶免疫法、荧光免疫法2.CD抗原检测抗原检测l 酶免疫组织化学法酶免疫组织化学法l 间接间接(jin ji)荧光免疫法荧光免疫法l 流式细胞术流式细胞术3.受体检测（受体检测（FcR、CR）l EA花环花环l EAC花环花环l 小鼠红细胞花环小鼠红细胞花环二、二、B B细胞细胞(xbo)(xbo)数量检数量检测测第六十一页，共九十五页。EA花环花环形成形成(xngchng)试验试验Fc受体受体B cellB cell第六十二页，共九十五页。B cellB cellEAC花环花环(hu hun)形成试验形成试验补体受体补体受体第六十三页，共九十五页。l小鼠红细胞受体：小鼠红细胞受体：慢性慢性B细胞白血病细胞白血病 方法简单，鉴定方法简单，鉴定(jindng)类型类型第六十四页，共九十五页。第三节第三节第三节第三节 淋巴细胞功能淋巴细胞功能淋巴细胞功能淋巴细胞功能(gngnng)(gngnng)(gngnng)(gngnng)检测检测检测检测nnT T细胞功能检测细胞功能检测细胞功能检测细胞功能检测(jin c)(jin c)nnB B细胞功能检测细胞功能检测细胞功能检测细胞功能检测nnNKNK细胞活性测定细胞活性测定细胞活性测定细胞活性测定第六十五页，共九十五页。一、一、一、一、T T T T细胞功能细胞功能细胞功能细胞功能(gngnng)(gngnng)(gngnng)(gngnng)检测检测检测检测nn Produce cytokines Produce cytokinesnn Cytotoxic action Cytotoxic action nn Mediate DTH Mediate DTHT T细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)的功能的功能第六十六页，共九十五页。T T T T细胞细胞细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)功能检测试验功能检测试验功能检测试验功能检测试验nnT T细胞增殖试验细胞增殖试验细胞增殖试验细胞增殖试验(shyn)(shyn)nn CTLCTL介导的细胞毒试验介导的细胞毒试验介导的细胞毒试验介导的细胞毒试验nnT T细胞分泌功能检测细胞分泌功能检测细胞分泌功能检测细胞分泌功能检测nn检测检测检测检测T T细胞功能的体内试验细胞功能的体内试验细胞功能的体内试验细胞功能的体内试验第六十七页，共九十五页。T T T T细胞细胞细胞细胞(xbo)(xbo)(xbo)(xbo)增殖试验增殖试验增殖试验增殖试验 形态学法形态学法形态学法形态学法 3 3H-TdRH-TdR掺入法掺入法掺入法掺入法 MTTMTT比色法比色法比色法比色法 CFSECFSE标记标记标记标记(bioj)(bioj)染色法染色法染色法染色法第六十八页，共九十五页。形态学形态学法法 PBMCPBMCPHA/ConAPHA/ConA5 5COCO2 2、37 37培培养养(piyng)(piyng)7272h h细胞细胞(xbo)(xbo)涂涂片染色片染色显微镜检显微镜检查查(jinch)(jinch)第六十九页，共九十五页。未转化未转化(zhunhu)淋巴细胞淋巴细胞转化转化(zhunhu)的淋巴母细胞的淋巴母细胞转化率（）转化率（）转化转化(zhunhu)的淋巴细胞数的淋巴细胞数计数的淋巴细胞总数计数的淋巴细胞总数X100第七十页，共九十五页。Sitmulated by mitogen or antigen48h3H-TdR Count CPM3H-TdR掺入法掺入法 第七十一页，共九十五页。第七十二页，共九十五页。CFSE的前体（的前体（CFDSE）可进入细胞，降解）可进入细胞，降解(jin ji)后形成后形成CFSE，在一定波长的光激发下可发，在一定波长的光激发下可发出荧光。当细胞分裂时，出荧光。当细胞分裂时，CFSE平均分配到子细胞平均分配到子细胞中，使荧光量减半，再采用流式细胞仪分析细胞增中，使荧光量减半，再采用流式细胞仪分析细胞增殖活性。殖活性。CFSE标记标记(bioj)染色法染色法第七十三页，共九十五页。T cell proliferation analyzed by CFSE labeling第七十四页，共九十五页。T T细胞细胞细胞细胞(xbo)(xbo)介导的细胞介导的细胞介导的细胞介导的细胞(xbo)(xbo)毒试验毒试验毒试验毒试验CTLCTL杀伤杀伤杀伤杀伤(shshng)(shshng)靶细胞的机制靶细胞的机制靶细胞的机制靶细胞的机制l通过通过(tnggu)颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞颗粒酶和穿孔素杀伤靶细胞l通过通过FasFasL介导细胞凋亡介导细胞凋亡第七十五页，共九十五页。CTLCTL介导细胞毒作用的检测介导细胞毒作用的检测介导细胞毒作用的检测介导细胞毒作用的检测(jin c)(jin c)方法方法方法方法ll形态学检查法形态学检查法形态学检查法形态学检查法ll5151CrCr释放释放释放释放(shfng)(shfng)法法法法ll细胞凋亡检测法细胞凋亡检测法细胞凋亡检测法细胞凋亡检测法 （1 1）形态学检测法）形态学检测法）形态学检测法）形态学检测法 （2 2）DNA Ladder DNA Ladder （3 3）ELISA ELISA （4 4）Flow cytomeryFlow cytomery第七十六页，共九十五页。Cytotoxicity Assays(51Cr release)第七十七页，共九十五页。B细胞增殖试验细胞增殖试验(shyn)溶血空斑试验溶血空斑试验 ELISPOT检测抗体分泌细胞检测抗体分泌细胞 抗体的检测抗体的检测B细胞细胞(xbo)功能检测功能检测第七十八页，共九十五页。Direct assay for IgM-secreting plasma cells(primary response)第七十九页，共九十五页。Indirect assay for IgG-secreting plasma cells(secondary response)第八十页，共九十五页。ELISPOTELISPOT检测抗体检测抗体检测抗体检测抗体(kngt)(kngt)形成细胞形成细胞形成细胞形成细胞第八十一页，共九十五页。第四节第四节第四节第四节 吞噬细胞功能吞噬细胞功能吞噬细胞功能吞噬细胞功能(gngnng)(gngnng)(gngnng)(gngnng)测定测定测定测定 中性中性中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞粒细胞粒细胞粒细胞 巨噬细胞巨噬细胞巨噬细胞巨噬细胞第八十二页，共九十五页。趋化功能趋化功能趋化功能趋化功能(gngnng)(gngnng)检测检测检测检测 吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定吞噬和杀菌功能测定中性粒细胞功能中性粒细胞功能(gngnng)检检测测第八十三页，共九十五页。中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞趋化功能检粒细胞趋化功能检测测琼脂糖平板法琼脂糖平板法第八十四页，共九十五页。中性中性中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞趋化功能检测粒细胞趋化功能检测粒细胞趋化功能检测粒细胞趋化功能检测Boden Boden 小室法小室法小室法小室法Boyden ChamberShi et al.J Immunol Methods,1993,164:149第八十五页，共九十五页。中性中性中性中性(zhngxng)(zhngxng)粒细胞吞噬功能测定粒细胞吞噬功能测定粒细胞吞噬功能测定粒细胞吞噬功能测定中性中性(zhngxng)粒细胞粒细胞白色白色(bis)葡萄球菌葡萄球菌显微镜观察显微镜观察第八十六页，共九十五页。中性粒细胞吞噬功能中性粒细胞吞噬功能中性粒细胞吞噬功能中性粒细胞吞噬功能(gngnng)(gngnng)测定测定测定测定第八十七页，共九十五页。巨噬细胞功能巨噬细胞功能巨噬细胞功能巨噬细胞功能(gngnng)(gngnng)检测检测检测检测l 碳粒廓清碳粒廓清(kuqng)(kuqng)实验实验l 吞噬功能检测吞噬功能检测l 巨噬细胞溶酶体酶的测定巨噬细胞溶酶体酶的测定l 细胞毒作用测定细胞毒作用测定l 巨噬细胞促凝血活性测定巨噬细胞促凝血活性测定l 巨噬细胞产生细胞因子的检测巨噬细胞产生细胞因子的检测第八十八页，共九十五页。巨噬细胞巨噬细胞鸡红细胞鸡红细胞白色念珠菌白色念珠菌酵母酵母(jiom)(jiom)细细胞胞孵育孵育(f y)(f y)涂片涂片(t(t pin)pin)染色染色镜检镜检计算吞噬率计算吞噬率和吞噬指数和吞噬指数巨噬细胞吞噬功能检测巨噬细胞吞噬功能检测第八十九页，共九十五页。巨噬细胞产生巨噬细胞产生(chnshng)(chnshng)细胞因子的检测细胞因子的检测中国生化中国生化(shn hu)(shn hu)药物杂志，药物杂志，2002，23（2）：）：67-69第九十页，共九十五页。小小 结结Ficoll-HypaquePBMCT细胞细胞(xbo)尼龙尼龙(nlng)(nlng)棉柱分棉柱分离离FCASFCAS免疫磁珠分选免疫磁珠分选B细胞细胞(xbo)外周血外周血1.淋巴细胞的分离淋巴细胞的分离第九十一页，共九十五页。小小 结结2.吞噬细胞吞噬细胞(tn sh x bo)的分离的分离3.淋巴细胞计数淋巴细胞计数 E花环花环(hu hun)试验试验 EA花环试验花环试验 EAC花环试验花环试验 流式细胞仪计数流式细胞仪计数第九十二页，共九十五页。小小 结结4.淋巴细胞功能测定淋巴细胞功能测定(cdng)T淋巴细胞增殖试验淋巴细胞增殖试验 CTL介导的细胞毒作用介导的细胞毒作用 溶血空斑试验溶血空斑试验 ELISPOT检测抗体分泌细胞检测抗体分泌细胞5.吞噬细胞吞噬细胞(tn sh x bo)功能检测功能检测第九十三页，共九十五页