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第四章 动物(dngw)干细胞第一节第一节 干细胞的概念干细胞的概念(ginin)和分类和分类一、概念一、概念干细胞（干细胞（Stem cellStem cell）是一类具有自我更新）是一类具有自我更新(gngxn)(gngxn)和分化潜能的细胞和分化潜能的细胞,能产能产生表型和基因型与自己完全相同的子细胞，并具有不同分化潜能。生表型和基因型与自己完全相同的子细胞，并具有不同分化潜能。胚胎干细胞胚胎干细胞第一页，共七十四页。形态特征：形态特征：圆形或椭圆形，体积小，核质比大；圆形或椭圆形，体积小，核质比大；生化特征：生化特征：较高的端粒酶活性；一般都有独特的表较高的端粒酶活性；一般都有独特的表 面标志；面标志；增殖特征增殖特征:自稳定性：单细胞或无脊椎动物自稳定性：单细胞或无脊椎动物(jzhudngw)(jzhudngw)不对称分不对称分裂裂 哺乳动物哺乳动物种群意义上的不对称分裂种群意义上的不对称分裂分化特征：分化特征：是干细胞最重要的特征。干细胞本生不是干细胞最重要的特征。干细胞本生不 是终末分化细胞，具有再分化的潜力。是终末分化细胞，具有再分化的潜力。干细胞的主要生理干细胞的主要生理(shngl)(shngl)特征：特征：第二页，共七十四页。第三页，共七十四页。二、分类二、分类(fn li)一）根据发生来源分类胚胎干细胞：胚胎干细胞：成体干细胞：成体干细胞：来自早期胚胎来自早期胚胎(piti)(piti)（ESCESC）、原始生殖细胞）、原始生殖细胞（PGCPGC）、或畸胎瘤组织（）、或畸胎瘤组织（ECEC）等）等如骨髓造血如骨髓造血(zo xu)(zo xu)干细胞（干细胞（HSCHSC），间质干），间质干细胞（细胞（MSCMSC），神经干细胞（），神经干细胞（NSCNSC）第四页，共七十四页。ESC第五页，共七十四页。什么(shn me)是畸胎瘤如果在胚胎不同时期，某些多能细胞从整体上分离或脱落下来，使细胞基因发生突变，分化异常，则可发生胚胎异常。一般认为，这种分离或脱落发生于胚胎早 期，则形成畸胎；而如发生于胚胎后期，则形成了具有内胚层(picng)、中胚层(picng)和外胚层(picng)三个胚层(picng)的异常分化组织，即形成了畸胎瘤。第六页，共七十四页。鼻咽畸胎瘤淋巴管瘤第七页，共七十四页。生殖(shngzh)嵴与PGC（原始生殖(shngzh)细胞）第八页，共七十四页。第九页，共七十四页。成体干细胞：神经(shnjng)干细胞第十页，共七十四页。二）根据分化潜能分类全能(qunnng)干细胞：如ESC多能干细胞：如造血干细胞、间充质干细胞定向祖细胞：如造血母细胞等。专能干细胞：皮肤干细胞，成肌细胞等第十一页，共七十四页。第十二页，共七十四页。第十三页，共七十四页。三）根据干细胞存在的组织器官分类胚胎干细胞造血干细胞神经(shnjng)干细胞肝脏干细胞皮肤干细胞肌肉干细胞等第十四页，共七十四页。第二节 胚胎(piti)干细胞通过建立体外培养的方法，获得保持增殖(zngzh)且不分化的胚胎干细胞系的技术称为胚胎干细胞的建系。一、胚胎来源的干细胞系（p132 图6-1）1.囊胚阶段的内细胞团（囊胚阶段的内细胞团（ICM）2.来源于生殖嵴部位的原始生殖细胞（PGC）3.来源于畸胎瘤组织（EC）第十五页，共七十四页。二、胚胎(piti)干细胞的建系主要步骤包括：1.培养(piyng)体系的选择和准备2.胚胎采集3.ICM的获取4.ICM的离散5.ESC的建系第十六页，共七十四页。1.培养(piyng)体系的选择和准备饲养层细胞的准备：饲养层细胞一方面对ESC细胞帖壁起支持作用，另一方面其分泌蛋白可抑制ESC分化，维持其增殖(zngzh)特性和多能性。常用饲养层细胞为成纤维细胞（如STO成纤维细胞系）、子宫内皮细胞、3T3细胞株等。为了阻断饲养层细胞的分裂，而不影响其分泌蛋白的产生，通常采用射线或丝裂霉素C处理之。第十七页，共七十四页。培养基的准备：用DMEM（高糖）培养液，其中胎牛血清的浓度和质量很重要，还要加非必须(bx)氨基酸；-巯基乙醇。常采用添加LIF等抑制ESC的分化潜能；添加EGF等生长因子来促进ESC的增殖。第十八页，共七十四页。LIF抑止(yzh)胚胎干细胞分化的信号通路 LIF 干细胞表面的LIF受体和gp130蛋白形成异二聚体 激活JAK酪氨酸激酶系统 激活MAP激酶ERK级联反应和STAT3蛋白 STAT3形成同型二聚体入核 激活核内靶基因转录 表达(biod)相应蛋白抑止ESC的分化 第十九页，共七十四页。2.胚胎的采集一般囊胚期胚胎或后桑葚胚。3.ICM的获取1）直接分离法：囊胚于饲养层上自行(zxng)发育成孵化囊胚，待ICM扩大增殖时挑取。或使用链霉蛋白酶处理ZP，获得裸胚培养。2）免疫分离法：链霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次转移至补体灭活和未灭活的抗血清中，去除滋胚层细胞后，吸取ICM，移至饲养层培养。第二十页，共七十四页。4.ICM的离散(lsn)胰蛋白酶消化即可离散ICM。5.胚胎干细胞建系第二十一页，共七十四页。三、胚胎(piti)干细胞的应用第二十二页，共七十四页。第二十三页，共七十四页。第二十四页，共七十四页。第三节、胚胎(piti)干细胞的生物学特性与鉴定方法一、生物学特性增殖与分化特征：增殖与分化特征：永生化(immortal)；能维持稳定的正常的二倍体染色体结构；有稳定的发育潜能，能被诱导(yudo)增殖或分化；能参与胎儿所有组织的发育过程；第二十五页，共七十四页。形态特征形态特征(tzhng)(tzhng)体积小、核大，有一个或多个核仁；体积小、核大，有一个或多个核仁；胚胎干细胞克隆紧密堆积，细胞之间无明显的界限，胚胎干细胞克隆紧密堆积，细胞之间无明显的界限，细胞克隆有一定形状规律。细胞克隆有一定形状规律。生化特征生化特征具有具有碱性磷酸酶碱性磷酸酶和和端粒酶端粒酶活性；活性；表达表达SSEA-3SSEA-3、SSEA-4SSEA-4、TRA-1-60TRA-1-60等表面标志；等表面标志；表达表达OCT-4OCT-4蛋白；蛋白；第二十六页，共七十四页。第二十七页，共七十四页。人胚胎干细胞的表面(biomin)标志第二十八页，共七十四页。Otc4基因(jyn)Otc4基因被认为在整个卵子生成和囊胚附殖前以及早期外胚层中都表达，是受精卵全能性的关键。Otc4基因只能在胚胎中才能得到完全表达，而在成体(chn t)动物体细胞中的表达基本上被关闭。这就意味着克隆人技术的第一步就存在很大问题。所以Otc4也被称为克隆人终结者。第二十九页，共七十四页。二、胚胎干细胞的鉴定(jindng)方法1.形态(xngti)鉴定：核质比大，体积小，细胞集落小鼠呈鸟巢状，牛、猪等呈馒头状，人呈扁平、松散聚合体。2.核型分析：二倍体核型，染色体受损情况等。第三十页，共七十四页。3.ESC特异性表面抗原表达的鉴定：小鼠ESC以SSEA-1为主，人以SSEA-3、SSEA-4为主。此外，ALP、Otc-4等都可作为表面标志。4.端粒酶活性鉴定：端粒长度及端粒酶活性检测。5.体内外分化能力(nngl)鉴定：体内外分化能力鉴定：胚胎小体（EB，或称拟胚体）第三十一页，共七十四页。改变细胞的培养条件:改变细胞的培养条件是ES细胞定向分化的基本策略,常用的方法有:与辅助细胞共培养;在半固体培养基中原位生长分化;添加生长因子、化学诱导剂等。导入外源性基因(jyn),使其分化为某一特定类型的细胞。体内定向分化,使ES 细胞多数分化为该组织特异性的细胞。三、胚胎干细胞定向诱导分化三、胚胎干细胞定向诱导分化(fnhu)的方的方法法第三十二页，共七十四页。胚胎干细胞的诱导分化：胚胎干细胞的诱导分化：胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胎牛血清，骨髓基质细胞共培养胚胎干细胞胚胎干细胞造血细胞造血细胞 RARA胚胎干细胞胚胎干细胞神经细胞神经细胞 DMSODMSO胚胎干细胞胚胎干细胞肌肉肌肉(jru)(jru)细胞细胞 TGF-B1,VEGF,bFGFTGF-B1,VEGF,bFGF胚胎干细胞胚胎干细胞血管和内皮细胞血管和内皮细胞 RA+RA+胰岛素胰岛素+T3+T3胚胎干细胞胚胎干细胞脂肪细胞脂肪细胞 BMP-2,BMP-4BMP-2,BMP-4胚胎干细胞胚胎干细胞软骨细胞软骨细胞 地塞米松，磷酸甘油地塞米松，磷酸甘油胚胎干细胞胚胎干细胞骨细胞骨细胞 基因转染基因转染胚胎干细胞胚胎干细胞胰岛素分泌细胞胰岛素分泌细胞第三十三页，共七十四页。第三十四页，共七十四页。人胚胎(piti)干细胞注射至免疫缺陷小鼠的后腿肌肉中形成的各种组织：（a）肠样结构；(b)神经上皮花结；(c）骨骼；(d)软骨；(e)横纹肌；(f)肾。第三十五页，共七十四页。A.小鼠成纤维饲养细胞上培养8天后的ICM（标尺100um）B.ICM中分离出的H9细胞系（标尺100um）C.H9细胞系（标尺50um）D.在无小鼠胚胎成纤维细胞，但有LIF（20ng/ml）的条件(tiojin)下培养5d后，H9细胞发生分化（标尺100um）第三十六页，共七十四页。第四节、成体干细胞一、概念和生物学特征概念：指一群分布在成体组织中尚未分化的、具有自我更新、并负有构建和补充某种组织的各种类型细胞(xbo)潜能的干细胞(xbo)。生物学特征：1、慢周期性2、自我更新和再生能力的有限性3、不对称分裂4、细胞鉴定标志第三十七页，共七十四页。造血干细胞是体内各种血细胞的唯一来源，它主要存在于骨髓、外周血、脐带血中。造血干细胞的移植是治疗血液系统疾病、先天性遗传疾病以及多发性转移性肿瘤疾病的最有效方法。与骨髓移植和外周血干细胞移植相比，脐血干细胞移植的长处在于无来源的限制，对HLA配型要求不高，不易(b y)受病毒或肿瘤的污染。造血造血(zo xu)(zo xu)(zo xu)(zo xu)干细胞干细胞第三十八页，共七十四页。造血造血(zo xu)(zo xu)(zo xu)(zo xu)干细胞的来源干细胞的来源骨髓；1/400外周血；1/100000脐带血；1/10000胎儿造血系统(xtng)；胚胎干细胞和胚胎生殖细胞。第三十九页，共七十四页。二、成体干细胞的分离与鉴定（以HSC为例）无菌采集骨髓 低渗处理 密度梯度离 心 获单核细胞 CD34抗体标记(bioj)流式细胞仪分离结合免疫吸附分离 鉴定。第四十页，共七十四页。Culturing Hematopoietic Stem Cell第四十一页，共七十四页。造血造血(zo xu)(zo xu)(zo xu)(zo xu)干细胞的体外培养干细胞的体外培养第四十二页，共七十四页。如造血如造血(zo xu)干细胞的鉴定：干细胞的鉴定：细胞形态：集落呈非贴壁生长，细胞形态较小细胞表面标志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1);L/TAL-1；CD34；GATA-1；基因表达：TAL-1；GATA-2；H1；主要珠蛋白 体外移植：浆细胞移植给患者(hunzh)能恢复造血功能，并且二次移植仍可重建造血系统。第四十三页，共七十四页。造血造血(zo xu)(zo xu)(zo xu)(zo xu)干细胞的移植干细胞的移植移植前处理(chl):超大剂量的放疗、化疗尽量消灭肿瘤细胞，同时抑制患者的免疫系统，使供体者的造血干细胞可以顺利植入。采集供体者的造血干细胞（骨髓、外周血、脐带血），并与受体进行HLA配型；将造血干细胞输入到受体者体内，造血干细胞会自动定居到脊髓。第四十四页，共七十四页。三、成体干细胞(xbo)的应用：细胞(xbo)移植技术 细胞类型细胞类型 治疗的疾病治疗的疾病神经细胞神经细胞 中风中风(zhng fng)、帕金森氏病、老年痴呆症、帕金森氏病、老年痴呆症、脊髓损伤、多发性硬化病脊髓损伤、多发性硬化病心肌细胞心肌细胞 心脏病发作、充血性心脏病心脏病发作、充血性心脏病产生胰岛素的细胞产生胰岛素的细胞 糖尿病糖尿病软骨细胞软骨细胞 骨性关节炎骨性关节炎血细胞血细胞 癌症、免疫缺乏症、遗传学血液癌症、免疫缺乏症、遗传学血液 病、白血病病、白血病肝细胞肝细胞肝炎、肝硬化肝炎、肝硬化皮肤细胞皮肤细胞烧伤烧伤骨细胞骨细胞骨质疏松症骨质疏松症视网视网(眼眼)细胞细胞黄斑症黄斑症骨骼肌细胞骨骼肌细胞 肌肉萎缩症肌肉萎缩症第四十五页，共七十四页。四、干细胞技术研究面临的问题四、干细胞技术研究面临的问题 l用于干细胞研究的胚胎来源困难用于干细胞研究的胚胎来源困难;l如何保持干细胞的全能性，并控制向特别类型细胞如何保持干细胞的全能性，并控制向特别类型细胞转化？转化？l如何分离、纯化干细胞？如何分离、纯化干细胞？l分化后的细胞是否有致瘤性？分化后的细胞是否有致瘤性？l干细胞在体外发育成完整的器官尚难以做到干细胞在体外发育成完整的器官尚难以做到;l分化细胞移植仍有可能发生免疫排斥分化细胞移植仍有可能发生免疫排斥;l伦理问题伦理问题 第四十六页，共七十四页。作业题1、什么是干细胞？如何分类？2、干细胞有什么生物学特性？3、简述来源于ICM的胚胎干细胞分离方法。4、ESC培养时常用的饲养层细胞(xbo)有哪些？其作用是是什么？5、什么是成体干细胞？有哪些种类？第四十七页，共七十四页。补充知识(zh shi)：组织工程.组织工程的概念应用工程学和生命科学的原理和方法，研究细胞、组织诱导因子和生物(shngw)材料间相互作用的关系，研制生物(shngw)性替代物用以修复或重建组织器官的结构，维持、恢复和改善病损组织或器官的功能。第四十八页，共七十四页。1993年Langer及Vacanti兩位學者在著名的”Science”學術期刊上提出組織工程(gngchng)(tissue engineering)的構想，隨後根據此構想將軟骨細胞培養於人耳形狀的生醫材料上，再植入老鼠背部(上圖)，形成具有耳朵外觀的組織，此一前瞻性技術成為組織工程研究的先驅。第四十九页，共七十四页。2.组织(zzh)工程的方法 活体(hu t)组织细胞分离 与胞外基质分子混合 细胞体外培养扩增形成组织 移植到体内第五十页，共七十四页。.组织工程(gngchng)的三要素细胞、支架、信号细胞、支架、信号第五十一页，共七十四页。（1 1）种子）种子(zhng zi)(zhng zi)细胞细胞 细胞必须能不断进行细胞分裂，且必须能被调控分化成特定的组织细胞 干细胞：胚胎干细胞、成体干细胞(如MSC)组织(zzh)来源细胞：自体或异体组织(zzh)细胞Growth factor stimulation第五十二页，共七十四页。（2 2）组织生长支架）组织生长支架(zhji)(zhji)需求：需求：第五十三页，共七十四页。符合生物符合生物(shngw)安全性要求安全性要求合适的可生物降解吸收性合适的可生物降解吸收性合适的孔尺寸、高孔隙率和相连的孔形态合适的孔尺寸、高孔隙率和相连的孔形态特定的三维外形特定的三维外形高表面积和合适的表面理化性质高表面积和合适的表面理化性质与植入部位组织力学性能相匹配的结构强度与植入部位组织力学性能相匹配的结构强度第五十四页，共七十四页。组织组织(zzh)工程支架的来源工程支架的来源支架材料支架材料天然高分子材料天然高分子材料合成降解聚合物合成降解聚合物生物陶瓷生物陶瓷生物生物(shngw)复合材料复合材料第五十五页，共七十四页。不同形态结构的组织工程生物(shngw)材料第五十六页，共七十四页。天然天然(tinrn)高分子材料高分子材料蛋白质支架蛋白质支架胶原胶原明胶明胶多糖多糖(du tn)支架支架海藻酸盐海藻酸盐壳聚糖壳聚糖透明质酸透明质酸蛋白质多糖支架蛋白质多糖支架第五十七页，共七十四页。合成合成(hchng)聚合物材料聚合物材料聚丙烯酸及其衍生物聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物聚乙二醇及其共聚物 聚乙烯醇聚乙烯醇聚交酯聚交酯聚乳酸（聚乳酸（PLAPLA）聚（聚（D,L-D,L-乳酸乳酸(r sun)(r sun)-co-co-乙醇酸）乙醇酸）（PLGAPLGA）聚乙交酯（聚乙交酯（PGAPGA）等）等支架设计及制备支架设计及制备(zhbi)技术技术第五十八页，共七十四页。生物陶瓷生物陶瓷磷酸钙陶瓷磷酸钙陶瓷(toc)聚磷酸钙聚磷酸钙羟基磷灰石羟基磷灰石珊瑚（碳酸钙）珊瑚（碳酸钙）支架支架(zhji)设计及制备设计及制备技术技术第五十九页，共七十四页。成骨细胞良好地粘附于壳聚糖-明胶/羟基磷灰石支架上，生长状态(zhungti)良好，分泌大量细胞外基质。第六十页，共七十四页。（3 3）生长因子）生长因子表皮生长因子：是对上皮细胞增殖有很强促进作用的53个氨基酸残基的多肽。神经生长因子：为神经细胞特异性分泌的营养蛋白(dnbi)。肝细胞生长因子：为728个氨基酸残基单链组成。骨形态发生蛋白：能诱导或刺激新骨的生成。第六十一页，共七十四页。4.4.技术技术(jsh)(jsh)路线路线体外得到工程化组织、移植目前(mqin)主要的方式细胞与支架前体混合注射体内，原位形成凝胶支架，提供新组织形成的空间第六十二页，共七十四页。皮肤皮肤(p f)修复修复第六十三页，共七十四页。骨修复骨修复(xif)第六十四页，共七十四页。人工人工(rngng)耳：耳：第六十五页，共七十四页。第六十六页，共七十四页。第六十七页，共七十四页。第六十八页，共七十四页。第六十九页，共七十四页。第七十页，共七十四页。应用自体骨髓(su)基质干细胞修复颅骨缺损 第七十一页，共七十四页。应用(yngyng)软骨与骨髓基质干细胞修复猪的膝关节软骨缺损 第七十二页，共七十四页。第七十三页，共七十四页。内容(nirng)总结第四章 动物干细胞。自稳定性：单细胞或无脊椎动物不对称分裂。哺乳动物种群意义上的不对称分裂。1）直接分离法：囊胚于饲养层上自行发育成孵化囊胚，待ICM扩大增殖时挑取。Otc4基因只能(zh nn)在胚胎中才能得到完全表达，而在成体动物体细胞中的表达基本上被关闭。流式细胞仪分离结合免疫吸附分离。视网(眼)细胞黄斑症。体外得到工程化组织、移植目前主要的方式。应用软骨与骨髓基质干细胞修复猪的膝关节软骨缺损。谢谢各位第七十四页，共七十四页。