免疫学实验技术概述.pptx

第九章第九章 免疫学实验技术概述免疫学实验技术概述血清学反应：体外发生的抗原抗体反应。血清学反应：体外发生的抗原抗体反应。第一节第一节 体液免疫的检测体液免疫的检测血清学反应血清学反应所所有有血血清清学学反反应应类类型型的的基基本本原原理理：抗抗原原抗抗体体反应的特异性。反应的特异性。二、血清学反应的一般规律二、血清学反应的一般规律(一一)特异性特异性 Ab只能与相应只能与相应Ag特异结合。特异结合。Ag表表面面常常具具有有多多个个(多多种种)不不同同表表位位，所所以以免疫血清中也应含有相应多种特异性免疫血清中也应含有相应多种特异性Ab。抗原与抗体的结合的特异性抗原与抗体的结合的特异性（二）交叉性（二）交叉性 交叉抗原：不同的交叉抗原：不同的Ag物质之间存在相同物质之间存在相同的的Ag表位时，称为交叉抗原。表位时，称为交叉抗原。交叉反应：又不同抗原制备的抗血清除交叉反应：又不同抗原制备的抗血清除与各自的相应与各自的相应Ag发生反应外，尚能与对方发生反应外，尚能与对方Ag发生反应。发生反应。通常两种通常两种Ag之间亲缘关系越近，交叉反之间亲缘关系越近，交叉反应程度越高。应程度越高。AB抗原与抗体的结合的交叉性抗原与抗体的结合的交叉性(三三)用已知测未知用已知测未知v 所有血清学反应都毫无例外地是用已知所有血清学反应都毫无例外地是用已知Ag测测未知未知Ab或用已知或用已知Ab测未知测未知Ag。v 用用已已知知测测未未知知的的依依据据：抗抗原原抗抗体体的的反反应应是是特特异的。异的。v 正正确确理理解解实实验验原原理理或或进进行行试试验验设设计计的的关关键键是是搞搞清清楚楚什什么么是是已已知知，什什么么是是未未知知，谁谁是是抗抗原原身身份份，谁是抗体身份，谁是身兼两职的。谁是抗体身份，谁是身兼两职的。(四四)试验与抑制试验试验与抑制试验 许多血清学试验可以被相应的许多血清学试验可以被相应的AgAb所所抑制，即抑制反应现象的出现，抑制试验可抑制，即抑制反应现象的出现，抑制试验可以验证反应的特异性；还可使一些不易被检以验证反应的特异性；还可使一些不易被检测的测的Ag(如简单半如简单半Ag)或或Ab(如单价如单价Ab)，得以，得以检出。检出。(五五)结合力与离解力结合力与离解力 Ag，Ab的结合为弱能量的非共价健结的结合为弱能量的非共价健结合，其结合力决定于合，其结合力决定于Ag表位与表位与Ab的结合点的结合点之间所形成的非共价健的数量，性质和距之间所形成的非共价健的数量，性质和距离，包括离，包括4种力的作用：种力的作用：vAg-Ab结合的离解力结合的离解力 指指Ag-Ab结合具有可逆性，因为结合具有可逆性，因为Ag-Ab之间靠之间靠非共价结合，因此在一定条件下可使其解离。非共价结合，因此在一定条件下可使其解离。解离后的解离后的Ag-Ab仍保留其原有活性。仍保留其原有活性。(六六)结合比例结合比例v Ag与与Ab的结合常需适当比例才出现可见反的结合常需适当比例才出现可见反 应，在最适比例时反应最明显；应，在最适比例时反应最明显；v 这种现象可以用这种现象可以用“格子学说格子学说”来解释：来解释：Ab(1gG)为二价，为二价，Ag通常为多价，只有通常为多价，只有Ag，Ab结合形结合形 成大的复合物，肉眼才可见；成大的复合物，肉眼才可见；v带现象带现象 只有当只有当Ag与与Ab比例适当时，才能形成大的复比例适当时，才能形成大的复合物，比例不适当，就只能形成小的复合物而合物，比例不适当，就只能形成小的复合物而抑制反应现象的出现抑制反应现象的出现.v前带现象：前带现象：AbAb过剩，过剩，AgAg过少；稀释过少；稀释AbAbv后带现象：后带现象：AgAg过剩，过剩，AbAb过少；稀释过少；稀释AgAg。(七七)血清学反应的影响因素血清学反应的影响因素 1电电介介质质：生生理理盐盐水水，缓缓冲冲盐盐水水，少少数数动动物物(禽禽)血清用血清用8.5NaCl；2温度；温度；3pH：pH6.08.0 三、血清学技术的优越性三、血清学技术的优越性(一一)检样量少，预处理简单：检样量少，预处理简单：一一滴滴血血清清/血血、一一根根羽羽毛毛、少少许许组组织织悬悬液、植物一片子叶等。液、植物一片子叶等。(二二)种类多，可择优选用种类多，可择优选用(三三)方法简便快速方法简便快速(四四)特异性、敏感性特异性、敏感性(五五)Ag/Ab定位、定量定位、定量 四、血清学试验的制定原则四、血清学试验的制定原则 特特定定的的或或建建立立新新的的血血清清学学方方法法时时，应应注注意意以下原则：以下原则：(一一)Ag准备和提纯准备和提纯 1购自试剂公司：如半购自试剂公司：如半Ag、激素、酶、激素、酶、农药、抗生素、昂贵的天然农药、抗生素、昂贵的天然Ag等。等。2自制：一般天然自制：一般天然Ag、动物血清、组织、动物血清、组织Ag等等(二二)Ab制备提纯制备提纯 (三三)操作程序制定操作程序制定 (四四)材料准备和滴定：工作浓度滴量材料准备和滴定：工作浓度滴量 (五五)试验条件选择：试验条件选择：(六六)特异性试验特异性试验 1Ag、Ab验证：反复、重复验证验证：反复、重复验证 2交叉试验交叉试验 3抑制试验抑制试验(阻断阻断)(七七)敏感性试验敏感性试验(八八)重复性试验重复性试验(九九)稳定性试验稳定性试验五、血清学试验的应用五、血清学试验的应用 (一一)血清学诊断血清学诊断 (二二)生物活性物质超微定量生物活性物质超微定量 (三三)Ag/Ab亚细胞、细胞水平定位亚细胞、细胞水平定位 (四四)Ag组分分析，如病毒结构蛋白可用免疫转组分分析，如病毒结构蛋白可用免疫转印，免疫沉淀印，免疫沉淀(琼扩、电泳、交叉免疫电泳等琼扩、电泳、交叉免疫电泳等)(五五)物种鉴定分型物种鉴定分型 (六六)有机物提取纯化有机物提取纯化 六、血清学试验的类型六、血清学试验的类型 （一）沉淀反应：（一）沉淀反应：环状沉淀试验环状沉淀试验 琼脂扩散：琼脂扩散：免疫电泳免疫电泳 对流电泳对流电泳 火箭电泳火箭电泳 双向电泳双向电泳补体结合试验补体结合试验（二）凝集反应：（二）凝集反应：直接凝集：平板、试管直接凝集：平板、试管 间接凝集：间接血凝、炭凝、乳胶凝集间接凝集：间接血凝、炭凝、乳胶凝集 协同凝集：协同凝集：凝集抑制：（血凝抑制）凝集抑制：（血凝抑制）（三）与补体有关的实验：活性、组分、补结、免（三）与补体有关的实验：活性、组分、补结、免疫粘附血凝等。疫粘附血凝等。（四）中和试验（四）中和试验（五）标记技术：（五）标记技术：同位素标记同位素标记 荧光标记：化学发光免疫技术荧光标记：化学发光免疫技术 酶标记：组化法、测定法（酶标记：组化法、测定法（ELISA）ELISA：间接法、免疫酶斑点技术（：间接法、免疫酶斑点技术（dot-ELISA）、）、竞争法、竞争法、夹心法、夹心法、桥联法桥联法 （六）免疫电镜组化技术（六）免疫电镜组化技术 胶体金铁蛋白标记技术胶体金铁蛋白标记技术B B0竞争酶联免疫吸附检测法竞争酶联免疫吸附检测法(CiELISA)原理原理l l 0ng/ml 0ng/ml，检测线为清晰红色条带；，检测线为清晰红色条带；，检测线为清晰红色条带；，检测线为清晰红色条带；l l 1ng/ml1ng/ml，检测线与，检测线与，检测线与，检测线与0 0标准品的相似标准品的相似标准品的相似标准品的相似;l l 3ng/ml 3ng/ml，检测线浅于，检测线浅于，检测线浅于，检测线浅于0ng/ml0ng/ml标准品标准品标准品标准品;l l 10ng/ml 10ng/ml，检测线明显浅于，检测线明显浅于，检测线明显浅于，检测线明显浅于0;0;l l 肉眼判定检测限可达肉眼判定检测限可达肉眼判定检测限可达肉眼判定检测限可达3ng/ml3ng/ml。免疫层析法免疫层析法检测检测CAP结果结果第二节第二节 细胞免疫技术细胞免疫技术自自 学学