多重PCR检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用.pdf

畜牧兽医学报,2006,37(11),1202 1208Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica多重 PCR 检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用马保臣1,秦卓明2,蔡玉梅1,董玉兰3,柴同杰1*(1?山东农业大学动物科技学院,泰安 271018;2?山东省农业科学院,济南 250000;3.中国农业大学动物医学院,北京 100094)摘?要:参照 GenBank 发表的序列,在金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌16S rRNA 与 23S rRNA 之间的区域设计了 3 对引物,参照念珠菌和隐球菌的 18S rRNA 的序列设计 1 对引物,建立了检测金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌 4 种乳腺炎主要致病菌的多重 PCR 方法。参照 Skladny 的方法制备模拟了细菌感染临床标本。结果表明:本试验建立的多重 PCR 方法具有较好的特异性,多重 PCR 方法检测乳样中的金黄色葡萄球菌的细菌最小浓度为 104CFU/mL,检测无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的细菌最小浓度分别为 102CFU/mL、103CFU/mL 和 103CFU/mL。通过对采自临床型乳腺炎(46 个)和隐性乳腺炎(167 个)动物共计 213 个乳样分别用传统细菌学培养法和多重 PCR 方法进行检测,多重 PCR 对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有更高的检出率(P 0?05)。关键词:多重 PCR;乳腺炎;金黄色葡萄球菌;无乳链球菌;停乳链球菌;酵母真菌中图分类号:S855;S854.43?文献标识码:A?文章编号:0366-6964(2006)11-1202-07收稿日期:2005-10-28基金项目:德国政府基金会(DAAD)国际优秀学者资助项目 423-china,M ongolei(2004?06-2006?05)作者简介:马保臣(1978-),男,山东人,博士,主要从事奶牛疾病和分子生物学的研究,E-mail:baochenma *通讯作者:柴同杰Development of Mutiplex PCR for Simultaneous Detection ofStaphycococcus aureus,Streptococcus agalactiae,Streptococcus dysgalactiae and Yeasts inBovine Mastitis Milk SamplesMA Bao-chen1,QIN Zhuo-ming2,CAI Yu-mei1,DONG Yu-lan3,CHAI Tong-jie1*(1?College of A nimal Science and Technology,Shandong A gricultural University,Tai?an,271018,China;2?Shandong A cademy of A gricultural Sciences,Ji?nan 250000,China;3.College of Veterinary Medicine,China A griculturalUniversity,Beij ing 100094,China)Abstract:A mutiplex polymerase chain reaction(PCR)assay was developed for the simultaneousdetection of the four major agents of bovine mastitis,Staphycococcus aureus,Streptococcus aga-lactiae,Streptococcus dysgalactiae and yeast.T he target sequences of Staphycococcus aureus,Strep tococcus agalactiae,and Strep tococcus dysgalactiae were the 16S to 23S rRNA spacer re-gions.T he target sequence of yeast was 18S rRNA region.The results showed that the assay wasspecific.Simulation bacteria infection samples were made according to Skladny?s method.The sen-sitivity of the mutiplex PCR was lower in detecting Staphycococcus aureus,Streptococcus dysgalactiae?11 期 马保臣等:多重 PCR 检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用and yeast of the milk.The sensitivity of mutiplex PCR in detecting Staphycococcus aureus,Streptococcusagalactiae,Streptococcus dysgalactiae and yeasts was 104CFU/mL,102CFU/mL,103CFU/mL and103CFU/mL respectively.T he performance of the mutiplex PCR and traditional culture methodwere evaluated by examining 46 clinical mastitis milk samples and 167 subclinical mastitis milksamples.The results showed that mutiplex PCR was more sensitive than culture in detectingStaphycococcus aureus and yeasts(P 0?05).Key words:Mutiplex PCR;mastitis;Staphycococcus aureus;Streptococcus agalactiae;Strep to-coccus dysgalactiae;yeasts?奶牛乳腺炎(Bovine Mastitis)是限制奶业发展的最重要疾病之一,是一种世界性并且引起严重经济损失的疾病,奶牛乳腺炎发生的重要原因是病原细菌的感染。目前,国内外对临床标本中病原菌的检验大多仍采用所谓的?金标准?培养法,即采集标本后,先接种增菌培养液增菌,待出现阳性结果后,再分离单个菌落,通过形态学、生理学、生物化学、免疫学等方法最终确诊。该方法尽管较为准确,但存在敏感性较低,耗时较长,且易受细菌生理条件和抗生素使用限制等严重缺陷,故难以满足临床需求 1 2。再者,当乳样病原菌刚刚侵袭时,细菌数目很少,或当乳中有大量的淋巴细胞或体细胞存在时,能引起亚临床感染而传统的细菌学培养可能为阴性 3,PCR 方法可以弥补细菌学培养的不足,利用该方法,病原菌能在数小时内检测出来,尤其是多重PCR 方法既能节省试剂的用量又能缩短检测时间。近几年研究表明、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌是引起乳腺炎的最重要病原 4,因此建立多重 PCR 方法检测引起乳腺炎的主要病原是一项迫切任务。1?材料与方法1?1?参考菌株金黄色葡萄球菌(AT CC 29062),无乳链球菌(CCM 55934),沙门氏菌(CCM3572),大肠杆菌(AT CC 12079)购自中国兽医药品监察所。停乳链球菌、白色念珠菌、乳房链球菌、产气荚膜梭菌、上皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、沙雷菌、芽孢杆菌、牛棒状杆菌、枸橼酸杆菌、假单胞菌、空肠弯曲菌、牛链球菌、化脓链球菌、犬链球菌、粪肠球菌、鸡葡萄球菌、李斯特杆菌、新型隐球菌、光滑念珠菌、克柔氏念珠菌、牛放线杆菌、巴氏杆菌、分枝杆菌、粪肠球菌和星形奴卡菌为本实验室保存,并-20?贮存。1?2?引物根据 GenBank 收录的序列(U39769、U39765、U39767),参考金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌在16S rRNA 与 23S rRNA 之间的区域设计引物,扩增的片段长度分别为 420、270 和 200 bp。酵母样真菌参照念珠菌和隐球菌的 18S rRNA 发表的序列(DQ499512、DQ471323)设计引物,扩增的片段长度约为 730 bp。引物由上海生物工程有限公司 合 成。S.aureus-F:5?-T CTT CAGAAGAT-GCGGAATA-3?;S.aureus-R:5?-TAAGT-CAAACGT TAACAT ACG-3?。S.agalactiae-F:5?-AAGGAAACCTGCCAT T TG-3?;S.agalacti-ae-R:5?-T TAACCT AGT T TCTT TAAAAC-TAGAA-3?。S.dysgalactiae-F:5?-TT T GAGAG-GTCT TGTGGG-3?;S.dysgalactiae-R:5?-GCGT TT T CGGTT TAT T TT-3?。Yeast-F:5?-GGGAT GT AT TT ATT AGATAAAAAATCAA-3?;Yeast-R:5?-GCAGTAGT TAGT CT T CAGT A-AAT C-3?。1?3?细菌 DNA 提取细菌菌株接种于 LB 液体培养基中,37?培养过夜;5 000 g 离心菌体,悬浮于 567?L T E(10mmol/L T ris H Cl,0?5 mmol/L EDTA,pH 8?0),加 30?L 10%SDS 和 3?L 10 mg/mL 的蛋白酶K;55?温育 1 h;加入等体积的酚/氯仿/异丙醇(25?24?1)混匀,5 000 g 离心 10 min;吸取上层水相,加入等体积的氯仿/异丙醇(24?1)混匀,5 000g 离心 10 min;吸取上层水相加入 1/10 体积的 3mol/L 的乙酸钠(pH5?2)和 RNase A(终浓度达到0?25 0?3 mg/?L),37?轻摇 30 min;加入 2?5倍体积的无水乙醇,-20?放置 2 h;10 000 g 离心15 min,倒掉上清;70%乙醇洗涤 2 次,超净台内风干沉淀,重新溶于 50?L TE 中。紫外分光光度计1203畜?牧?兽?医?学?报37 卷?结合电泳方法定量所提取的 DNA 为500 ng/?L,分装后-20?放置备用。1?4?乳样中细菌 DNA 的提取取300?L 乳样加入到 267?L NTE 0?1 mol/LNaCl,20 mmol/L Tris-HCl(pH 7?4),1 mmol/LEDTA(pH 7?5)中,加 30?L 10%SDS 和 3?L10 mg/mL 的蛋白酶 K,37?温育 4 h,加入等体积的酚/氯仿/异丙醇(25?24?1)混匀,静置 3min,10 000 g 离心 3 min,取上清,重复该步骤 2次;取上清加入 60?L 3 mol/L 的乙酸钠(pH5?2)和 1?2 mL 预冷的无水乙醇,-20?放置 30 min;4?10 000 g 离心 15 min,70%的乙醇洗涤 DNA,10 000 g 离心 5 min。模板 DNA 超净台内风干,溶于 50?L TE 中。1?5?PCR条件的优化先用普通 PCR 方法对 4 种病原分别进行检测,设置不同的退火温度和时间,寻找最适的条件。然后综合 4 种病原检测的 PCR 最适条件,来确定多重PCR 条件。1?6?乳样中模拟细菌感染临床标本的制备和敏感性检测参照 Skladny 的报道 5制备模拟细菌感染临床标本,并加以改进,操作如下:用细胞计数板计数 4种细菌细胞悬液,调整细胞浓度至 107/mL,然后连续 10 倍稀释至 101/mL,分别取上述各浓度稀释菌液 100?L 加至 900?L 无菌牛奶,即得不同浓度(连续 10 倍稀释)的模拟细菌感染的临床标本。然后按照乳样细菌 DNA 的方法提取细菌 DNA。新培养的各细菌计数后,同时用生理盐水进行系列稀释,分别含菌 106/mL 1/mL,混匀后按上述细菌DNA 的提取方法提取DNA。然后进行多重 PCR。1?7?临床乳样的来源与采集检测的临床乳样来自 5 个奶牛场,分别为济宁2个奶牛场,青岛 2 个奶牛场,济南 1 个。参考文献 4 方法采样,其中临床型乳腺炎 46 个,隐性乳腺炎167 个,共计 213 个乳样。1?8?乳样的细菌学培养与鉴定将每份 5 mL 左右的乳样,2 000 3 000 r/min离心 8 min,弃去管中的上层液体,留取底部沉淀物,无菌操作吸取 0?1 mL 沉淀物分别接种于 5%绵羊鲜血琼脂培养基、沙堡弱氏琼脂,营养琼脂培养基、高盐甘露醇琼脂培养基。1?8?1?金黄色葡萄球菌的分离培养与鉴定?能在高盐甘露醇琼脂培养基成长,菌落细小,呈红色或黄色;在血液琼脂平板上能形成金黄色、湿润、光滑、隆起的中等大小的菌落,有溶血现象,染色镜检呈葡萄球状,参见文献 6 进行生化鉴定,分解甘露醇、乳糖、葡萄糖、麦芽糖、精氨酸水解酶、尿酶、蔗糖、D-松二糖,产酸不产气,透明质酸酶阳性,过氧化氢酶试验阳性,氧化酶试验阴性,不分解木糖、阿拉伯糖、纤维二糖、棉子糖、水杨苷、木糖醇。1?8?2?无乳链球菌和停乳链球菌的分离培养与鉴定?在普通平皿上生长不良,鲜血平皿上生长较好,菌落为露滴状,圆形、隆起、半透明,呈?、?或?溶血,染色镜检形态一致,成双或短链状、长链状排列。参见文献 6 进行生化鉴定,无乳链球菌能在 40%胆汁中生长,CAMP 试验阳性,水解马尿酸钠,不分解甘露醇、七叶苷、棉子糖和山梨醇。停乳链球菌不能在 40%胆汁中生长,CAMP 试验阴性,不水解马尿酸钠,不分解甘露醇、七叶苷、棉子糖和山梨醇。1?8?3?酵母真菌的分离培养与鉴定?分离株在鲜血琼脂上培养 24 h 后,呈灰白色、乳白色或微黄色;在沙堡弱氏琼脂上开始像细菌样菌落,以后菌落增厚由乳白色变为奶油样、奶酪样。直接显微镜检查发现压滴标本中有大量球形孢子,有的有假菌丝,革兰氏染色阳性,乳酸酚棉蓝染色呈蓝色。菌体大小不一,为卵圆形、椭圆形、棒状或圆形,并可见到出芽或未出芽的芽生孢,参见文献 7 进行生化鉴定,分解蔗糖、葡萄糖、水杨苷,不分解麦芽糖、菊糖、七叶苷、乳糖和棉子糖,甲基红和枸橼酸盐试验阴性。1?9?多重 PCR 产物的鉴定用多重 PCR 检测乳样时,在 PCR 产物 420、270、200、730 bp 各选取一个条带,进行凝胶回收,回收片段与 pGEM-T easy 载体进行连接,用 PCR和酶切双重鉴定重组质粒,后由上海博亚生物工程有限公司进行测序。对测序结果进行同源性分析。1?10?统计学方法对传统的细菌学培养方法与 PCR 方法检测的细菌数目用?2检验来分析。2?结?果2?1?PCR 条件的优化和多重 PCR 条件的优化经多次摸索得出的多重 PCR 的最适条件见表1。多重 PCR 的最佳反应模式:94?预变性 3 min;然后 94?变性 1 min,57?5?退火 40s,72?延伸40 s,36 个循环;72?反应 7 min。1204?11 期 马保臣等:多重 PCR 检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用表 1?PCR 反应体系Table 1?PCR reaction system试剂Reagent参考菌株Referencebacteria/?L乳样细菌Bacteria inmilk/?LPCR 反应浓度Concentrationin PCR10?buffer551?MgCl2552?5 mmol/L4?dNT P550?2 mmol/L各引物0?80?80?4?mol/LTaq DNA聚合酶0?50?50?10U/?L模板1?02?0双蒸水22?721?72?2?多重 PCR 的特异性检测多重 PCR 通过对单种和多种细菌检测(见图 1 3)表明该方法具有较好的特异性,对照细菌都没有出现特异的条带。2?3?多重 PCR 对 4 种乳腺炎病原菌提取 DNA 的敏感性检测多重 PCR 对模拟标本的敏感性检测结果表明:用生理盐水稀释后,多重 PCR 对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的最小检测浓度都为 102CFU/mL,而对牛奶中金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌检测的最小浓度分别为 104CFU/mL,102CFU/mL,103CFU/mL和 103CFU/mL。2?4?用多重 PCR和细菌学培养法对临床样品 4 种主要致病菌的检测利用多重 PCR 和细菌培养法对 213 个乳样(临床型乳腺炎 46 个,隐性乳腺炎 167 个)的检测结果表明:该方法与传统的细菌培养法对无乳链球菌和停乳链球菌的检测结果基本一致,用 PCR 较培养法对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有高的敏感性(P 0?05)。部分样品的多重 PCR 检测结果见图 4,用细菌培养法和多重PCR 对部分临床样品的检测结果对照见表 2。2?5?多重 PCR 产物的测序分析对于 PCR 产物 420、270、200、730 bp 的条带,1?白色念珠菌;2?停乳链球菌;3?无乳链球菌;4?金黄色葡萄球菌;5?大肠杆菌;6?乳房链球菌;7?克雷伯氏菌;8?牛沙门氏菌;9?沙雷菌;10?芽孢杆菌;11?牛棒状杆菌;12?枸橼酸杆菌;13?假单胞菌;14?空肠弯曲菌;15?李斯特杆菌;16?产气荚膜梭菌;M.分子量标准1?Candida albicans;2?Streptococcus dysgalactiae;3?Streptococcus agalactiae;4?Stap hylococcus aureus;5?E.coli;6?Streptococcus uberis;7?Klebsiellaspp;8?Salmonellabovismorbif icans;9?Serratia;10?Bacillus;11?Corynebacterium bovis;12 CitrobacterSpp;13?Pasturella;14?Camp ylobacterj ej uni;15?Listeria monocytogenes;16?Clostridium p erf rin-gens;M.DNA marker图 1?多重 PCR对单种细菌的特异性检测Fig.1?Specificity of mutiplex PCR to the single bacteria经测序后,将序列与 GenBank 收录的目的片段的基因序列相比较,同源性在 94%99?8%,证明 PCR产物 420、270、200、730 bp 的条带分别为金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的特异性的条带,其中金黄色葡萄球菌的临床分离菌株F14 的 16S rRNA-23S rRNA 的序列已登入 Gen-Bank,编号 DQ256396。3?讨?论3?1?用16S rRNA 与 23S rRNA 之间的区域设计引物检验金黄色葡萄球菌、无乳链球菌和停乳链球菌的可行性用 PCR 方法鉴定细菌,选取的扩增的片段应该是高度保守的,但在不同种的水平上应该是有差别的,16S rRNA 的一级结构高度保守,被广泛应用于种的鉴定 8,16S rRNA 与 23S rRNA 之间的区域近年来被证实是在种的水平上鉴定细菌的理想区段 9,10,这段区域的变异速度是 16S rRNA 的 10倍 11,这使不同种的细菌间存在差异。16S rRNA与 23S rRNA 之间的区域来检测乳腺炎病原菌已有报道 3。本试验也证明,多重 PCR 扩增 16S rRNA与 23S rRNA 之间的区域具有很好的特异性,不同种的细菌没有扩增出目的条带。1205畜?牧?兽?医?学?报37 卷?1?白色念珠菌、停乳链球菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌;2?白色念珠菌、停乳链球菌和无乳链球菌;3?白色念珠菌、停乳链球菌和金黄色葡萄球菌;4?白色念珠菌和金黄色葡萄球菌;5?停乳链球菌、无乳链球菌和金黄色葡萄球菌;6?新型隐球菌和停乳链球菌;7?光滑念珠菌和无乳链球菌;8?停乳链球菌和无乳链球菌;9?季也蒙念珠菌;10?停乳链球菌和金黄色葡萄球菌;11?无乳链球菌和金黄色葡萄球菌;12?牛放线杆菌;13?多杀性巴氏杆菌;14?牛分枝杆菌;15?粪链球菌;16?星形奴卡菌;M.分子量标准1?Candidaalbicans,Staphylococcus aureus,Streptococcusagalactiae and Strep tococcus dysgalactiae;2?Candida al-bicans,Strep tococcus agalactiae and Streptococcus dysga-lactiae;3.Candida albicans,Staphylococcus aureus,andStrep tococcus dysgalactiae;4?Candida albicansandStaphylococcusaureus;5?Staphylococcusaureus,Streptococcus agalactiae and Strep tococcus dysgalacti-ae;6.Cry ptococcuneof ormans and Strep tococcus dys-galactiae;7?Candida glabrataandStrep tococcusagalactiae;8?Strep tococcus agalactia and Strep tococ-cus dysgalactiae;9?Candida guilliermondii;10?Staphylococcus aureus and Streptococcus dysgalactiae;11?Staphylococcus aureus,and Streptococcus agalac-tiae;12?Actinomycesbovis;13?P.multocida;14?Mycobacteriumbovis15?Streptococcusf aecalis16?N ocardia asteroides;M.DNA marker图 2?多重 PCR 对多种细菌的特异性检测Fig.2?Specificity of mutiplex PCR to mut-i bacteria1?牛链球菌;2?无乳链球菌;3 肺炎链球菌;4?停乳链球菌;5?化脓链球菌;6?犬链球菌;7.粪肠球菌;8?鸡葡萄球菌;M.DL2000 分子量标准1?Strep tococcus bovis;2?Streptococcus agalactiae;3?Streptococcus pneumoniae;4?Strep tococcus dysga-lactiae;5?Strep tococcus pyogenes;6?Streptococcuscanis;7.Enterococcus f aecalis;8?Staphylococcusgallinarum;M.DL2000 DNA marker图 3?多重 PCR对球菌的特异性检测Fig.3?Specificity of mutiplex PCR to cocci3?2?用 18S rRNA 区域的保守序列设计引物检验酵母真菌的可行性真菌的 18S rRNA 高度保守,其保守区序列是真菌所共有的 12,13,在真菌间未发现明显差异,而此保守区在细菌及人类基因组均未发现。该段序列用于真菌的检测可以避免和细菌、人的基因发生交叉反应,具有很强的特异性。本试验根据真菌的18S rRNA 基因序列,在其保守区设计真菌通用引物,用于引起奶牛乳房炎的真菌的快速检测,为快速诊断真菌性乳房炎提供了有效的手段,同时也可以用于奶牛真菌感染的预防控制。3?3?多重 PCR 方法检测的敏感性用生理盐水和牛奶稀释各细菌后,多重PCR方1、4、10、14?酵母菌;2,8?金黄色葡萄球菌和无乳链球菌;7、11、16、17?金黄色葡萄球菌;12?停乳链球菌;15?无乳链球菌;M.DL2000 分子量标准1,4,10,14?Yeasts;2,8?Stap hylococcus aureus and Strep tococcus agalactiae;7,11,16,17?Staphylococcus aureus;12?Streptococcus dysgalactiae;15?Streptococcus agalactiae;M.DL2000 DNA marker图 4?部分样品的多重 PCR检测结果Fig.4?Mutiplex PCR amplifications from some of the milk samples1206?11 期 马保臣等:多重 PCR 检测奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母菌方法的建立与应用表 2?用培养法和多重 PCR 对临床样品的检测结果(n=203)Table 2?Detection of milk samples by culture and mutiplex PCR(n=203)细菌鉴定 Detection of bacteria细菌学培养 Culture多重 PCR Mutiplex PCRP金黄色葡萄球菌阳性 Positive1731P 0?05Streptococcus agalactiae阴性 Negative181180停乳链球菌阳性 Positive45P 0?05Streptococcus dysgalactiae阴性 Negative199198酵母样真菌阳性 Positive1426P 0?01Yeasts阴性 Negative189177法检测表现出不同的敏感性,用牛奶稀释后的 PCR具有稍低的敏感性,灵敏性降低 10 102倍。可能是牛奶中存在 PCR 反应的抑制剂,即使当牛奶的细菌 DNA 提取后,这种抑制作用仍然存在 3。目前已经证明在尿液、粪便和血液中存在 PCR 的抑制物质,如在血液中存在的亚铁血红素和脂多糖具有干扰 Taq 聚合酶的作用 14。乳样中存在何种物质干扰 PCR 的检测目前还不清楚。为避免乳中的物质对 PCR 的干扰作用,提高其灵敏性,在样品检测前进行培养是必要的,通过培养提高细菌的数目来提高检测的准确性和灵敏性。3?4?多重 PCR 方法与传统培养方法有不同结果的原因分析对临床样品的检测结果表明,用 PCR 较培养法对金黄色葡萄球菌和酵母真菌的检测具有高的敏感性(P 0?05)。可能是在乳腺感染金黄色葡萄球菌和真菌时,乳样中的细菌较少或被淋巴细胞、中性粒细胞吞噬,使培养呈阴性。金黄色葡萄球菌的细胞内寄生和 L 型的存在也可能是一个原因 4。有些临床型乳腺炎样品来自含抗生素的乳样,细菌学培养阴性,但 PCR 的方法能检测到细菌。PCR 方法对真菌的检测的阳性率高于培养的另一个原因可能是一些真菌的生长很困难,且临床常规培养选用的多为一些普通的真菌培养基,有些稀有真菌在这些普通培养基中很难生长,故这些真菌在培养中很难观察到 15,培养法和 PCR方法对无乳链球菌和停乳链球菌的检测结果基本一致,可能是无乳链球菌和停乳链球菌引起的乳腺炎乳样中有大量的菌体存在,使之容易检测 3。4?结?论本试验建立了对金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、停乳链球菌和酵母真菌的多重 PCR 方法,通过特异性检验、灵敏性检验以及临床应用证明该方法可行,可作为临床上一种快速检测乳腺炎病原菌的方法。参考文献:1?Lenoard J,Lascdea S R,Dryyia D.Quanlitation ofbacteria in cerebrospinal fluid and blood of childrenand its diagnostic significance J.J Clin Microbiol,1984,19(2):187?2?Teng k,Li M,Yu W,et al.Comparison of PCR 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J.郑州大学学报(医学版),2004,39(2):310 312?动物疫情快递保加利亚发生蓝舌病2006 年 10 月 19 日,保加利亚驻 OIE 代表 Nikola T.Belev 博士报告了该国的蓝舌病疫情。疫情始于2006 年 10月 11 日,并于当天得到确认,但不属临床病例,依靠实验室检测作出诊断。疫区位于 Burgas 省,Brashlian、Byala voda 和 Kalovo(2 起)3 个村庄的山羊受到感染;Evrenozovo、Rezovo 和 Zvezdets3 个村庄的牛被感染。实验室诊断在保加利亚国家蓝舌病参考实验室进行,手段为竞争 ELISA。此次疫情源自带菌者。保加利亚采取的措施:控制节肢动物、检疫、国内限制移动、筛查、区域化、感染房舍/设施消毒。美国发生马传染性子宫炎2006 年 10 月 16 日,美国农业部动植物卫生检疫局副局长 Ron DeHaven 博士向 OIE 报告了马传染性子宫炎疫情。疫情于 2006 年 10 月 4 日开始并确认,诊断系根据实验室检测作出,不是临床病例。疫区位于威斯康星州 Dane 郡的 Mount Horeb。共发现 2例病例和 16 例临床健康的疑似动物。感染动物是 2 匹自东欧进口的利比扎种马。这 2 匹马一直在 Dane 郡的一个马繁殖和研究场所,正是在这里,在一次繁殖健康试验中它们被发现呈马生殖道泰勒氏杆菌(T aylorella equigenitalis)阳性。实验室诊断在国家兽医服务实验室进行,采用方法为细胞培养后病原分离。此次疫情感染来源:引入新的动物或动物产品;合法的动物移动。采取的控制措施:检疫和感染房舍/设施消毒。英国发生新城疫2006 年 10 月 13 日,英国环境、食品及农村事务部动物卫生局官员 Debby Reynolds 博士向 OIE 报告了新城疫疫情。病原是禽副黏病毒 1 型鸽变异株。本次暴发于 2006 年 9 月 21 日开始,2006 年 10 月 13 日确认。疫区位于苏格兰 Lothian,感染动物为 2 000 只室养的供人消费的灰色的鹧鸪(17 000 只疑似动物)。实验室诊断在设于 Surrey 郡 Weybridge 的兽医实验所国家实验室进行,方法为病毒分离。疫情源自接触野生动物。采取的控制措施:扑杀、国内控制移动、筛检、区域化和感染房舍/设施消毒。据分析,该禽副黏病毒 1型鸽分离株具有毒性裂解位点 RRQKRF,进一步的试验正在进行中。1208