环境微生物检验样品前处理讲解课件.pdf

2020/3/201环境微生物检验样品前处理野兽食品伙伴网论坛提要 CONTENTS微生物检验样品前处理需求检验样品前处理的方法分类现行标准的样品前处理技术微生物检验前处理技术展望201微生物检验样品前处理需求3样品检验过程05报告结果04数据处理02样品处理01样品采集03检验操作4目标菌不同发育阶段自身结构复杂相互差异极大微生物学检验复杂程度是非专业人士不能想象的受环境中各种理化因素的干扰往往存在微生物间的相互干扰采样及检验时机影响最终结果5微生物学检验环境中微生物的特点环境中微生物分布不均匀，常常聚集或粘附在悬浮于固体颗粒上；一旦环境被污染，微生物可大量繁殖，或者因接触食物而污染，导致繁殖机会持续存在甚至增加；病原体造成感染的可能与饮水量、吸入量有关；与化学污染物不同，病原体的剂量反应关系并不是累积性的。61234562020/3/202标准限量要求越来越低安全从环境采集样品直接检验的可能性很小，一般都要经过样品前处理才能完成。各种指示菌限量标准总大肠菌群 MPN/100 mL粪大肠菌群 MPN/L空气浮游菌 CFU/m空气沉降菌 CFU/皿99%0.5%20%80%各种目标菌限量标准空气中军团菌、溶血性链球菌/1 m2 m空调冷却水、冷凝水、沐浴用水中军团菌/500 mL？肠球菌、产气荚膜梭状芽孢杆菌CFU/100mL污水中沙门氏菌、志贺氏菌/200 mL污水中结核杆菌/500 mL7GB 184662005医疗机构水污染物排放标准8GB 184662005附录E医疗机构污水和污泥中结核杆菌的检验方法9微生物学检验样品前处理环境微生物学检验样品无论是气体、液体或固体，未经处理，几乎都不能直接进行检验。尤其是环境样品中的多数微生物，基本都是不均匀的方式，呈团块状附着在如空气、水中的颗粒物上。所以，采集的环境样品必须经过处理后才能进行微生物学检验。10提高灵敏度捕获极少量的目标菌，降低方法检出限去除干扰物质去除样本中的多余基体与其他干扰物质保护目标菌保护目标菌，避免运输途中增殖或死亡便于样品运输缩小样本的质量与体积，便于运输和保存样本前处理目的0102030411优先采样无菌采样布点原则样品运输样本前处理通用要求127891011122020/3/20302检验样品前处理的方法分类13样品前处理样品的前处理涉及很多方面，但主要应考虑三个方面。微生物学检验样品的类型被检验目标微生物的性质检验方法的适用性和需求14检验样品的类型根据应依据微生物学检验样品的类型，决定样品的分离、纯化技术。不同样品中，微生物的含量可能相差很大。目标微生物含量高的样品，对前处理要求可稍低。含量越低，则样品前处理要求越高例如，需要检验嗜肺军团菌时，需浓缩大量空气或水样，否则大量样品太重或者体积太大，无法运送回实验室。15样品含有的干扰物质根据根据样品含有的干扰物质浓度等，采取相应的前处理方法。水中余氯或空气中臭氧，除了过滤技术，还可以考虑使用相应中和剂的可能性。注意杀菌剂或抑菌剂的作用原理不同，样品前处理也应相应调整此外，各种微生物常产生不同代谢产物，其中一些代谢物甚至有抑菌活性，需要排除杂菌，以避免对目标菌生长造成干扰。16根据样品中目标菌浓度等环境微生物学样品因为环境样品中目标菌浓度可能很低，经过前处理的样品首先可以起到浓缩目标菌的作用，就很容易用各种方法检验，从而提高方法的灵敏度，降低最低检出限。1703现行标准的样品前处理技术181314151617182020/3/204GB/T 182032000室内空气中溶血性链球菌卫生标准GB/T 188832002室内空气质量标准GB 57492006生活饮用水卫生标准GB 374882019公共场所卫生指标及限值要求现行环境标准的微生物限量19GB/T 182032000室内空气中溶血性链球菌卫生标准20前言本标准遵循“引进”和必要的验证原则，结合我国国情，经过检索国内外的有关资料数据，并进行了验证性的研究及室内外水平的调查。综合分析后，制定出室内空气中溶血性链球菌卫生标准。本标准起草单位：同济医科大学、深圳市卫生防疫站。本标准主要起草人：应晨江、蔡文德、赵美英、袁涛、谢虹、石磊、段文华。GB/T 182032000室内空气中溶血性链球菌卫生标准附录AA4.2 测定将血平皿置于微生物采样器的撞击盒内，以25 L/min流速，采集0.52.0 min，经37培养24h，观察菌落及其溶血圈，必要时涂片、染色、镜检。A6 检出限和加标回收率血平皿上生长的溶血性链球菌菌落数不得超过20 cfu；样品加标回收率88.6%4.82%。21空气中溶血性每皿平均菌落数（cfu）链球菌含菌量100cfu/m采样时间（min）采样流量（L/min）采样时间（min）溶血菌落数（cfu）结果计算（cfu/m）0.51801.01402.0120GB/T 188832002室内空气质量标准224 室内空气质量4.1 室内空气应无毒、无害、无异常嗅味。4.2 室内空气质量标准见表1。表1室内空气质量标准菌落总数2500 cfu/m（依据仪器定，见附录D）23选点要求A.2.1 采样点的数量：原则上小于50的房间应设13个点；50100设35个点；100以上至少设5个点。采样高度A.2.3 采样点的高度：原则上与人的呼吸带高度相一致。相对高度0.5m1.5m之间消毒概念消毒只是杀死致病菌，并非杀死所有微生物报告结果多点采样后，按照所有采样点的平均值报告结果还是按照最大值报告结果？GB/T 188832002室内空气质量标准241920212223242020/3/20525GB/T 188832002室内空气质量标准采样时，监督采样人员是否能够正确执行无菌操作等细节。GB 374882019公共场所卫生指标及限值要求4.2 室内空气质量4.2.2 细菌总数对有睡眠、休憩需求的公共场所，室内空气细菌总数不应大于1500 CFU/m或20 CFU/皿；其他场所室内空气细菌总数不应大于4000 CFU/m或40 CFU/皿。注：根据细菌总数不同采样方法选取不限值要求。26A.2 撞击法采样布点要求A.2.3 采样点距离地面高度1.2 m1.5 m，距离墙壁不小于1 m。A.2.4 采样点应避开通风口、通风道等。GB/T 18204.32013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物27空气采样GB/T 18204.320133.2.3.2 采样环境条件：采样时关闭门窗15 min30 min，记录室内人员数量、温湿度与天气状况等。283.2.3.3 采样方法：以无菌操作，使用撞击式微生物采样器（3.2.1.1）以28.3 L/min流量采集5min15 min。采样器使用按照说明书要求进行。GB/T 18204.32013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物293.2 撞击法3.2.3 采样3.3.3.3 采样方法：将营养琼脂平板置于采样点处，打开皿盖，暴露5 min。GB/T 18204.32013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物303.3 自然沉降法3.3.3 采样2526272829302020/3/206区卫生计生监督执法大队开展公共场所卫生专项监督检查GB/T 18204.32013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物31GB/T 162932010医药工业洁净室（区）浮游菌的测试方法32GB/T 162942010医药工业洁净室（区）沉降菌的测试方法GB/T 1629320104.9 测试步骤4.9.1 测试前仪器、培养皿表面必须严格消毒。4.9.1.1 采样器进入被测房间前先用消毒房间的消毒剂灭菌，用于100级洁净室的采样器宜预先放在被测房间内。4.9.1.2 用消毒剂擦净培养皿的外表面。33GB/T 1629320104.9 测试步骤4.9.1.3 采样前，先用消毒剂清洗采样器的顶盖、转盘以及罩子的内外面，采样结束，再用消毒剂轻轻喷射罩子的内壁和转盘。4.9.1.4 采样口及采样管，使用前必须高温灭菌。如用消毒剂对采样管的外壁及内壁进行消毒时，应将管中的残留液倒掉并晾干。34GB/T 1629320104.9 测试步骤4.9.1.5 采样者应穿戴与被测洁净区域相应的工作服，在转盘上放入或调换培养皿前，双手用消毒剂消毒或戴无菌手套操作。354.9.1.6 采样仪器经消毒后先不放入培养皿，开启浮游菌采样器，使仪器中的残余消毒剂蒸发，时间不少于5 min，并检查流量并根据采样量调整设定采样时间。GB/T 1629320104.9 测试步骤363132333435362020/3/2074.9.1.7 关闭浮游菌采样器，放入培养皿，盖上盖子。4.9.1.8 置采样口于采样点后，开启浮游菌采样器进行采样。GB/T 1629320104.9 测试步骤375.4.4 采样注意事项5.4.4.1 对于单向流洁净室（区）或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；对于非单向流洁净室（区），采样口向上。GB/T 1629320105.4 浮游菌浓度计算38GB/T 1629420104.4 测试步骤4.4.1 测试前培养皿表面必须严格消毒。4.4.2 将已制备好的培养皿按采样点布置图逐个放置，然后从里到外逐个打开培养皿盖，使培养基表面暴露在空气中。4.4.3 静态测试时，培养皿暴露时间为30 min以上；动态测试时，培养皿暴露时间为不大于4 h。3940GB/T 1629420105.4 沉降菌菌落数计算5.4.1 采样点数量及其布置5.4.1.2 采样点的位置a）工作区采样点位置离地0.8 m1.5 m左右（略高于工作面）；5.4.4 采样注意事项5.4.4.1 对于单向流洁净室（区）或送风口，采样器采样口朝向应正对气流方向；对于非单向流洁净室（区），采样口向上。GB/T 1629420105.4 沉降菌菌落数计算41GB/T 1629420105.4 沉降菌菌落数计算5.4.4 采样注意事项5.4.4.2 布置采样点时，至少应尽量避开尘粒较集中的回风口。5.4.4.3 采样时，测试人员应站在采样口的下风侧，并尽量少走动。423738394041422020/3/208435.5 记录测试报告应包含以下内容：a）测试者的名称和地址，测试日期；b）测试依据；c）被测洁净室（区）的平面位置（必要时标注相邻区域的平面位置）；d）有关测试仪器及其测试方法的描述：包括测试环境条件，采样点数目以及布置图，测试次数，采样流量，或可能存在的测试方法的变更，测试仪器的检定证书等；若为动态测试，则还应记录现场操作人员数量及位置，现场设备运转数量及位置等。4.4.1 人工游泳池水4.4 游泳池水、沐浴用水指标要求菌落总数/（CFU/mL）200大肠菌群/（CFU/100 mL或MPN/100 mL）不得检出4.4.3 沐浴用水沐浴用水中不得检出嗜肺军团菌，池水浊度不应大于5 NTU，池水原水及补充用水应符合GB5749的要求。445 检验方法5.2 游泳池水温度、尿素、透明度和沐浴用水中嗜肺军团菌的检验按GB/T 18204执行，游泳池水氰尿酸的检测按CJ/T 244执行，游泳池水中氧化还原电位测定按SL 94执行，游泳池水、沐浴用水水质其他指标和生活饮用水指标检验按GB/T 5750执行。GB 374882019公共场所卫生指标及限值要求457 水样采集7.1 一般要求7.2 水源水的采集7.3 出厂水的采集7.4 末梢水的采集7.5 二次供水的采集7.6 分散式供水的采集GB/T 5750.22006生活饮用水标准检验方法水样的采集和保存4 采样容器46容器洗涤：用自来水和（无增白剂等）洗涤剂洗涤，盐酸浸泡过夜，依次用自来水、蒸馏水洗净。干热160 2 h或121 15 min。高压蒸汽灭菌后，如不立即使用应及时将瓶内冷凝水烘干。灭菌后的容器应在2周内使用。容器洗涤灭菌方式保存时限47GB/T 5750.22006生活饮用水标准检验方法水样的采集和保存优先采集，避免采样污染01微生物检验样品应单独采集0248GB/T 5750.220064344454647482020/3/2097.4 末梢水的采集采样前，放水几分钟。消毒龙头0349GB/T 5750.22006生活饮用水标准检验方法水样的采集和保存缺少现场空白和运输空白0450GB/T 5750.22006缺少平行样和现场加标或质控样0551GB/T 5750.22006GB/T 18204.62013公共场所卫生检验方法第6部分：卫生监测技术规范游泳池水、沐浴用水采样52GB/T 18204.62013公共场所卫生检验方法第6部分：卫生监测技术规范游泳池水、沐浴用水采样53游泳池水、沐浴用水采样544950515253542020/3/2010容器材质1234保存方法取样体积备注GB/T 5750.22006生活饮用水标准检验方法水样的采集和保存55容器材质1234保存方法取样体积备注HJ 4932009水质采样样品的保存和管理技术规定56GB 85382016食品安全国家标准饮用天然矿泉水检验方法57容器材质1234保存方法取样体积备注中和100 mL水样需要的0.1 mol/L硫代硫酸钠数量卫生标准标准号对应指标余氯（mg/L）硫代硫酸钠（mL）生活饮用水GB 57492006管网末梢水低限0.050.003生活饮用水GB 57492006出厂水低限0.30.017生活饮用水GB 57492006出厂水高限40.226人工游泳池水GB 374882019游泳池水低限0.30.017人工游泳池水GB 374882019游泳池水高限1.00.056582 总大肠菌群2.2 滤膜法1974年，加拿大卫生部研究所Sharp AN发表检验饮用水中大肠菌群的滤膜法。之后，加拿大、AOAC、美国FDA都陆续采纳为标准方法。GB/T 5750.122006良好的前处理技术富集大量清洁的水样；减少样品中干扰物质；采样后及时处理样品；转贴修复受损伤细菌。592 总大肠菌群2.2 滤膜法2.2.5 检验步骤2.2.5.2 过滤水样用无菌镊子夹取灭菌滤膜边缘部分，将粗糙面向上，贴放在已灭菌的滤床上，固定好滤器，将100 mL水样（如水样含菌数较多，可减少过滤水样量，或将水样稀释）注入滤器中，打开滤器阀门，在负0.5 大气压下抽滤。60GB/T 5750.1220065556575859602020/3/2011样品不同结果的相关性61公共场所集中空调通风系统应符合WS394的要求。4.5 集中空调通风系统62公共场所集中空调通风系统应符合WS394的要求。4.5 集中空调通风系统63D.5 采样D.5.1 采样点：每套空调系统选择3个5个送风口进行检测，每个风口设置1个检测点，一般设在送风口下方15 cm20cm、水平方向向外50 cm100 cm处。4.5 集中空调通风系统D.5.2 采样环境条件：采样时集中空调系统必须在正常运转条件下，并关闭门窗15min30 min以上，尽量减少人员活动幅度与频率，记录室内人员数量、温湿度与天气状况等。D.5.3 采样方法：以无菌操作，使用撞击式微生物采样器（D.3.1）以28.3 Lmin流量采集5 min-15 min。64GB/T 18204.52013公共场所卫生检验方法 第5部分：集中空调通风系统656.2.1微生物气溶胶浓缩器：采样流量100 L/min，对于直径3.0 m以上粒子的捕集效率应80%（或浓缩比8）。GB/T 18204.32013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物666 嗜肺军团菌6.2 仪器和设备6.1 原理采用液体冲击法采样、培养法定性测定公共场所空气中的嗜肺军团菌。无此术语和定义6162636465662020/3/20126.2.2 液体冲击式微生物气溶胶采样器：采样流量7 L/min15 L/min，对于0.5 m以上粒子的捕集效率应90%。GB/T 18204.32013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物676 嗜肺军团菌6.2 仪器和设备686.4.1 采样点：见附录A。6.4.2 将采样吸收液1（GVPC液体培养基）20 mL倒入微生物气溶胶采样器（6.2.2）中，然后用吸管加入矿物油1滴2滴。6.4.3 将微生物气溶胶浓缩器（6.2.1）与微生物气溶胶采样器（6.2.2）连接，按照微生物气溶胶浓缩器和微生物气溶胶采样器的流量要求调整主流量和浓缩流量。6.4.4 按浓缩器和采样器说明书操作，每个气溶胶样品采集空气量1 m2 m。6.4.5 将采样吸收液2（酵母提取液）20 mL倒入微生物气溶胶采样器（6.2.2）中，然后用吸管加入矿物油1滴2滴；在相同采样点重复6.4.3、6.4.4步骤。6.4.6 采集的样品不必冷冻，但要避光和防止受热，4 h内送实验室检验。GB/T 18204.32013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物6 嗜肺军团菌6.4 采样6.5.1 样品的酸处理：对采样后的吸收液1（6.3.1）和吸收液2（6.3.2）原液各取1mL，分别加入盐酸氯化钾溶液（6.3.3）充分混合，调pH至2.2，静置15 min。6.5.2 样品的接种：在酸处理后的两种样品（6.5.1）中分别加入1 mol/L氢氧化钾溶液，中和至pH为6.9，各取悬液0.2 mL0.3 mL分别接种GVPC平板（6.3.4）。6 嗜肺军团菌6.5 检验步骤69GB/T 18204.32013公共场所卫生检验方法第3部分：空气微生物70大多数环境微生物学检验方法标准，都未规定涉及致病菌检验时应采取的的生物安全防护措施。检验机构应自行规定。样品前处理注意生物安全04微生物检验前处理技术展望71环境微生物学检验发展缓慢在过去几十年中，研究集中在满足新标准提出的新目标与高要求，忽视了对样品前处理方法与技术的研究。研究如何提高检验方法灵敏度提高培养基选择性及培养速度如何应用更高大上的分析仪器726768697071722020/3/2013微生物学检验发展缓慢环境目前，环境微生物学检验受到的重视程度总体明显不足。通常，样品的前处理只需几分钟最多几十分钟。后续的样品检验，却要延续几天甚至几周时间。样品前处理方法常被检验机构忽视。学习检样前处理的时间，比学习样品检验技术所花费的时间差了数个数量级。73环境微生物学检验发展缓慢接种计数染色各种新技术与新方法的探索与研究，已成为环境微生物学检验的重要发展方向，快速简便、自动化的前处理技术不仅可以省时、省力，而且可以减少由于不同人员的操作及样品多次转移带来的误差，对避免生物安全污染也有深远的意义。7475环境微生物学检验随着样品前处理技术研究的深入开展，必将推动环境微生物学检验的发展，达到新的高度。谢谢QFMA7673747576