复合酶法提取南瓜多糖及其抗氧化性的研究.pdf

复合酶法提取南瓜多糖及其抗氧化性的研究孙 婕,尹国友,陈兰英,刘瑞芳,朱艳青,牛美艳,王 宁?(河南城建学院生物工程系,河南平顶山 467044)摘要?目的 优化复合酶法提取南瓜多糖的工艺条件,研究南瓜多糖的抗氧化性。方法 采用单因素试验设计研究了不同提取时间、温度、料液比、p H 值对南瓜多糖提取率的影响,并通过正交试验确定了提取南瓜多糖的最佳复合酶配比和最佳提取条件。采用水杨酸法检测南瓜多糖对羟基自由基(?OH)和改进的邻苯酚自氧化法检测其对超氧阴离子自由基(O-2)的清除效果。结果 当纤维素酶的浓度为 1.0%、果胶酶为 1.5%、木瓜蛋白酶为 1.0%时,以及温度为 40?、pH=4.6、料液比为 1?30、提取时间为 30 m in的条件下南瓜多糖的提取率最高;南瓜多糖对?OH 具有较好的清除效果,对 O-2有部分清除作用。结论 该研究为南瓜多糖的研究及应用提供了基础资料。关键词?复合酶法;南瓜多糖;提取;抗氧化活性中图分类号?S642.1?文献标识码?A?文章编号?0517-6611(2010)32-18064-03Extraction ofPu mpkin Polysaccharide by Complex Enzy m eM ethod and ItsAntioxidantResearchS UN Jie et al?(BiologicalEngineering Departmen,t H enan College ofUrban Constrction,Pingdingshan,Henan 467044)Abstract?Ob jective This paper am i s to study a ne w m ethod of extracting pumpkin polysaccharide fro m pumpk in.S ingle factor experm i entswere conducted to exam ine the effects ofextracting tm i e,temperature,the solid-liquid ratio and pH value on the extraction yield ofpolysaccha-ride fro m pumpkin.M ethod The best enzyme ratio and extraction cond itions for complex enzy m es extractionw ere deter m ined through orthog-onal tests.Scavenging?OH and O-2activities ofpu m pkin polysaccharideswere also investigated by salicylic acid and m i proved sel-f oxidationof o-pheno methods respectively.Result The results sho w ed that the biggest extraction yield of polysaccharide fro m pumpkin can be gotwhen adding 1%cellu lose enzy m e,1.5%pectinase,1.0%papain and Na2HPO4-citric acid buffer solution(pH w as 4.6),and oscillatingfor 30 m in underwater at40?w ith the solid-liquid ratio of1?30.In addition,pumpkin polysaccharides had a strong activity of elm i inatingo OH,butvery weak activity to scavenge O-2.Conclusion This study provided basic data for research and application ofPu m pk in polysac-charide.Key words?Co mplex enzy m esm ethod;Pu m pkin polysaccharide;Extraction;Antioxidant activity基金项目?河南省科技计划重点科技攻关项目(102102110157);河南城建学院科学研究基金项目(2010JZD008)。作者简介?孙婕(1976-),女,黑龙江海林人,博士,讲师,从事食品营养与加工研究。*通讯作者,E-mai:l sunjie124 。收稿日期?2010-06-17?南瓜为葫芦科南瓜属 1年生蔓性草本植物,具有较好的食疗保健作用 1。中医史书?滇南本草?中记载:?南瓜性温、味甘无毒,入脾、胃二经,能润肺益气、化痰排脓、驱虫解毒,治咳嗽、哮喘、肺痈、便秘等症?。?本草纲目?记载,南瓜有?补中、补肝气、益心气、益肺气、益精气?的作用。从南瓜中分离提取出的南瓜多糖对防治糖尿病具有一定作用,还具有降血脂、清除胆固醇、防止动脉硬化2的功效。目前,南瓜多糖的提取方法多为传统的热水浸提法3和超声辅助提取 4等,而且关于南瓜多糖的抗氧化活性研究较少。该研究探讨了复合酶法提取南瓜多糖的复合酶配比及提取工艺条件,并对南瓜多糖的抗氧化性能进行了研究。1?材料与方法1.1?材料?南瓜购自于平顶山九头崖超市。1.2?试剂?纤维素酶(1200 I U/mg)由北京拜尔迪生物公司生产;果胶酶(3.0万/g)由北京双旋微生物培养基制品厂生产;木瓜蛋白酶(活性?50万单位/g)由北京索莱宝科技有限公司生产;葡萄糖、苯酚、浓硫酸、柠檬酸、磷酸氢二钠、无水乙醇均为分析纯,购于平顶山市伟业物资经营公司。1.3?仪器设备?T6新世纪紫外可见分光光度计由北京普析通用仪器有限责任公司生产,LSHZ-300冷冻水浴恒温振荡器由太仓市生化仪器厂生产,电子天平(FA10084)由上海精密科学仪器有限公司生产,低速台式离心机(TDL-5)由上海安亭科学仪器厂制造,电热鼓风干燥箱由菏泽市石油化工学校仪器设备厂生产。1.4?方法1.4.1?原料预处理。南瓜用清水洗净后,去皮、瓜瓤后切成薄片晾干,随后放入 60?烘箱中烘干,用粉碎机将烘干的南瓜片粉碎成南瓜粉,放入保鲜袋中保存备用。1.4.2?试验流程。南瓜粉?复合酶水解?升温 90?灭酶活?离心去杂?乙醇沉淀多糖?干燥,得粗多糖。1.4.3?单因素试验。在其他条件相同的前提下,研究料液比(1?10、1?20、1?30、1?40)、pH 值(3?8、4?2、4?6、5.0)、提取时间(30、40、50、60m in)、提取温度(30、40、50、60?)等单因素对提取率的影响。1.4.4?正交试验。1.4.4.1?复合酶配比的正交试验。以不同百分比浓度的不同酶,包括纤维素酶(0.5%、1.0%、1.5%)、果胶酶(0.5%、1.0%、1.5%)、木瓜蛋白酶(0.5%、1.0%、1.5%),设计L9(33)正交试验,确定复合酶的最佳配比。1.4.4.2?提取条件的正交试验。为优化复合酶提取工艺条件,根据单因素试验要求,每个因素选取了 3个不同水平:温度(30、40、50?)、料液比(1?20、1?30、1?40)、pH 值(3?8、4.2、4.6)、时间(30、40、50 m in)设计 L9(34)正交试验,确定最佳的提取工艺条件。1.4.5?南瓜多糖的初步纯化。对复合酶法水解的多糖进行灭酶活后离心,得上清液,用 95%的乙醇沉淀,静置一段时间后离心去除上清液,将沉淀烘干称重,得粗多糖的重量。1.4.6?南瓜多糖抗氧化性研究。将得到的粗多糖加水稀释成不同浓度,并以相同浓度的 Vc作为对照研究其抗氧化的能力。1.4.6.1?清除?OH 能力的测定 5。反应体系中加 9 mmol/LFeSO4和 9mmol/L水杨酸-乙醇各 2m,l不同浓度多糖样品3m,l最后加 2m lH2O2(8.8mmol/L)启动反应。37?反应 1责任编辑?陈娟?责任校对?傅真治安徽农业科学,Jour nal ofAnhuiAgr.i Sc.i 2010,38(32):18064-18066h,以蒸馏水为参比,在 510 nm 下测量各浓度的吸光值,以 2m lFeSO4(9mmol/L)、2 m l水杨酸-乙醇(9 mmol/L),分别取不同浓度多糖样品 3和 2m,l并以蒸馏水作为待测溶液的本底吸光值。清除率=A0-(Ax-Ax?)/A0?100%式中,A0为空白对照液的吸光度,Ax为加入待测溶液后的吸光度,Ax?为不加显色剂 H2O2的待测溶液吸光度。1.4.6.2?清除 O-2能力的测定。应用改进的邻苯三酚自氧化法(简称 325 nm法)6进行测定,具体情况见表 1。表 1?325 nm法加样Table1?Reagentof325 nm met hodm l项目Item50mmol/LTris-HCl缓冲液50mmol/LTris-HClbuffer solution水Water45 mmol/L邻苯三酚45 mmol/Lpyrogallol多糖样液PolysaccharidesampleCK4.50.02-自氧化4.50.010.01-Autoxidation样品管4.5-0.010.01Sample tube?注:Tris-HCl缓冲液中含 1mmol/L EDTA,p H值 8.2。?Note:Tris-HCl buffersolution contains 1mmol/L EDTA,pH value is 8.2.?首先加入缓冲液、H2O、多糖样液,25?保温 20 m in后,再加入邻苯三酚,并立即摇匀,以空白样作对照,在 325 nm波长下,每隔 30 s测一次吸光值。2?结果与分析2.1?单因素试验2.1.1?料液比对南瓜粗多糖提取率的影响。由图 1可知,料液比为 1?40时,南瓜粗多糖的得率最大(达到 20?47%),而料液比为 1?30时,粗多糖的得率为 19?54%与最大值相差很小,但使用的缓冲液试剂要少,另外,过高的料液比会加大乙醇沉淀过程中的乙醇用量。所以,在实际操作中笔者选择1?30的料液比。图 1?料液比对南瓜粗多糖得率的影响Fig.1?The effect of the solid-liquid ratio on pumpkin polysac-charide yield2.1.2?p H 值对南瓜粗多糖得率的影响。由图 2可知,p H 值为 4.2时南瓜粗多糖的得率最大。pH 值可通过影响酶的空间结构从而影响其活性,进而影响南瓜粗多糖的得率。2.1.3?提取时间对南瓜粗多糖得率的影响。由图 3可知,当提取时间为 40m in时,粗多糖的得率最大。随着时间的延长,多糖的得率反而下降,吴素萍等 7认为,可能是提取时间太长引起糖结构的变化,甚至使碳环裂解,导致多糖含量降图 2?pH对南瓜粗多糖得率的影响Fig.2?The effect of pH value on pumpkin polysaccharide yield低。张驰等 8认为,多糖扩散到溶液后,细胞内外的多糖浓度达到一种动态平衡,另外,酶促反应的产物随着在溶液中浓度的积累会对酶促反应造成抑制等。这 2种学说都可以用于解释该试验结果,但其机理需要进一步研究。图 3?提取时间对南瓜粗多糖得率的影响Fig.3?The effect of extraction ti me on pumpkin polysaccharideyield2.1.4?温度对南瓜粗多糖得率的影响。由图 4可知,温度为 40?时,南瓜粗多糖的得率最大。温度是影响酶活的一个重要因素,从而影响酶对底物的作用效果,即影响了南瓜粗多糖的得率。图 4?温度对南瓜粗多糖得率的影响Fig.4?The effect of temperat ure on pumpkin polysaccharideyield2.2?正交试验2.2.1?复合酶配比的正交试验结果。从试验结果(表 2)中得出:最佳配比为 1.0%纤维素酶?1.5%果胶酶?1.0%木瓜蛋白酶,其中,3因素对结果的影响为 A C B,即纤维素酶果胶酶木瓜蛋白酶。2.2.2?提取条件优化的正交试验结果。从试验结果(表 3)1806538卷 32期?孙 婕等?复合酶法提取南瓜多糖及其抗氧化性的研究中得出:最佳提取条件为温度 40?、料液比 1?30、pH值 4?6、时间 30 m in。其中,4因素对结果的影响大小为:A C DB,即温度 pH 值时间 料液比。表 2?复合酶配比的正交试验结果Table2?The results of co mplex enzy mes proportioning tests次数Ti mes因素 FactorA纤维素酶Cellulose enzymeB果胶酶PectinaseC木瓜蛋白酶Papain提取率?%Extractionratio11(0.5)1(0.5)1(0.5)17.49212(1.0)2(1.0)17.29313(1.5)3(1.5)17.4142(1.0)1219.72522318.39623119.8773(1.5)1316.06832117.81933218.43k117.4017.7618.39k219.3317.8318.48k317.4318.5717.29R1.930.811.19表 3?提取条件的正交试验结果Table 3?The orthogonal testresults of extraction condition次数Ti mes因素 FactorA 温度?Te mperatureB料液比g/m lSolid-liquidratioC pH值pH valueD 时间?minTi me提取率?%Extractionratio1111118.382122218.163133319.574212319.765223120.136231219.687313219.098321319.659332118.24k118.7019.0819.2418.92k219.8619.3118.7218.98k318.9919.1619.6019.66R1.160.230.880.742.3?抗氧化活性试验2.3.1?清除?OH 的能力。由图 6可知,南瓜粗多糖对?OH有很好的清除作用,其清除率大约为 Vc标准品的 50%,并且随着粗多糖样品浓度的增加,其对?OH 的清除率越大。图 5?南瓜多糖清除?OH的能力Fig.5?The ability of eli m inating?OH2.3.2?清除 O-2的能力。用相同浓度梯度(0.02,0.06,0?10,0.14,0.18,0.22mg/ml)的南瓜粗多糖研究清除 O-2的试验,结果发现,南瓜粗多糖对 O-2的清除率接近于零,而当所使用的南瓜多糖样品浓度达到 0?18 mg/m l时,其对 O-2的清除率为 15?72%。由此可以看出,分离得到的南瓜粗多糖样品对 O-2也有部分清除作用,但效果与其对?OH的清除作用相比不明显。李俊丽等 9对水提法得到的南瓜多糖的抗氧化研究结果表明,南瓜多糖对 AP-TEMED体系产生的 O-2具有一定的抑制作用,但与清除?OH能力相比,较弱,而低浓度的南瓜多糖对 O-2几乎没有清除作用。3?结论提取南瓜多糖的传统工艺复杂,产品得率低,且产品纯度不高,将酶法技术应用于南瓜多糖的提取制备中,不仅操作简便,成本低廉,而且可提高其提取率和纯度。在试验中,由单因素及正交试验所确定的复合酶法提取南瓜多糖的最优工艺参数为纤维素 1.0%、果胶酶 1.5%、木瓜蛋白酶1?0%,且在温度 40?、pH=4.6、料液比 1?30、提取时间 30m in的条件下南瓜多糖的提取率最高。抗氧化试验结果表明,南瓜多糖对?OH 具有较好的清除效果,对 O-2也有一定清除作用,但效果不明显。南瓜多糖提取工艺条件的优化是对其研究及应用的基础,而南瓜多糖具有的抗氧化活性则使其在作为天然抗氧化剂和功能性食品方面有望得到开发利用。参考文献 1 田秀红,刘鑫峰,姜灿.南瓜的营养保健作用与产品开发 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