红花中黄酮类化合物抑制基质金属蛋白酶活性的实验研究样本.doc

资料内容仅供您学习参考，如有不当或者侵权，请联系改正或者删除。第一章 前 言1.1 红花简介红花( Carthamus tinctorius L)为菊科植物, 红花属红花的干燥花, 生长周期为12年, 在国际上, 印度、 美国、 埃塞俄比亚、 澳大利亚等地为红花主要种植地, 在中国则主产于河南、 云南、 浙江等地, 由于其在种植方面有较好的抗旱、 耐盐碱、 抗寒、 用途广泛等诸多优点, 在中国栽培种植已经有两千多年的历史1-3 在历史上, 红花被赋予了多种意义, 不但能够用来药用, 还可用于食用、 染料和油料等。虽然红花成分较为复杂, 但已被分离鉴定的化学成分有60多种, 主要分为黄酮类、 木脂素类、 多炔类等几大类, 而且存在着200多种色素类成分, 其中含有丰富的黄色素和红色素, 这是一种纯天然染色剂。其它类型的黄酮类物质, 主要有山奈酚( Kaempferol) 和槲皮素( Quercertin) 为基本母核的一系列衍生物及芦丁( Rutin) , 杨梅素( Myricetin) , 芹黄素( Apigenin) , 木樨草素( Luteoline) 等。研究表明红花有效成分主要为红花黄色素, 是一组水溶性查尔酮类成分, 红花中查尔酮类化合物多为色素类成分, 而其中最重要的就是红花黄色素( safflower yellow, SY) 。SY由红花黄色素A( HSYA) 和红花黄色素B(SY-B)及其衍生物组成, 羟基红花黄色素( Hydroxyl safflower yellow A, HSYA) 的研究是最为广泛的, 日本学者龟高德平首先从中国河南承德红花干花中分得红色素( 含0.3%0.6%) , 它是红花中含量最高的成分4-7。红花黄色素有改进心肌及脑组织微循环障碍的作用8, 亦有扩张冠脉, 抗氧化, 保护心肌, 降血压, 免疫抑制和脑保护的多种药理学功效9。1.2基质金属蛋白酶( MMPs) 简介ECM( extracellular matrixc) 是一种存在于细胞间隙中的大分子物质, 其临床方面对于研究肿瘤转移有着极其重要的意义, 应用蛋白酶降解ECM是治疗多种疾病的有效方法, 如强直性脊柱炎, 心脑血管疾病, 肿瘤, 糖尿病, 炎症等10-12。基质金属蛋白酶( matrix metalloproteinases, MMPs) 是一类与Ca2+, Zn2+金属离子结合, 可对ECM有极强降解作用的超酶家族, 据现阶段研究表明MMPs已鉴定出28种, 其又能够分为5大类, 分别为胶原酶、 明胶酶、 基质裂解酶、 膜型金属蛋白酶、 其它型。这里, 胶原酶主要包含MMP-1、 MMP-8、 MMP-13, 明胶酶主要包含MMP-2、 MMP-9, 基质裂解酶主要包含MMP-3、 MMP-10、 MMP-11, 膜型金属蛋白酶主要包含MMP-14, MMP-15, MMP-16、 MMP-17、 MMP-24、 和MMP-25。酶本身的活性点各不相同, 这种不同主要是由于染色体序列不同所导致, 由此各蛋白酶对应的底物与抑制剂也各有不同。根据报道, MMPs活性的抑制对肿瘤细胞的行为有重要的影响, 而MMP-2的活性也与癌栓及肿瘤大小密切相关 13 15。本实验研究红花体外抑制基质金属蛋白酶- 2活性的作用及抗肿瘤机理, 从而为从分子水平上研究红花的治病机理奠定基础, 也为进一步从红花中提取基质金属蛋白酶抑制剂提供实验依据。第二章 实验部分2.1 实验材料、 试剂红花药材购买于北京同仁堂大药房( 长春汽车厂分店) 。羟基红花黄色素A( Hydroxyl safflower yellow A, HSYA) 标准物质购于中国药品检验所( 北京) 、 红花黄色素B( Anhydrosafflor yellow B, SY-B) 标准品为实验室自主分离( 纯度达98%) 。HEPES( Promega) , 基质金属蛋白酶-2( MMP-2, Sino-Bilogical) , GM-6001( ENZQ) , 0.05% Brij-35( SANTA) , 荧光底物DQ( TM) GELTIN FROM PIG( Life) , 无菌水, DMSO等。2.2 仪器设备96孔酶标板( 鼎国) , Thermo Scientific Varioskan Flash 全波长扫描式多功能读数仪( Beckman) , 恒温培养箱( 德国) 。2.3 样品制备自制HEPES缓冲溶液( pH 7.0) , 其成分为50 mM HEPES、 0.2 M NaCl、 10 mM CaCl2、 20 M ZnSO4及0.05% Brij-35。精密称取适量广谱MMP的抑制药物GM-6001, 用DMSO溶解, 配置成15 nmol/L GM-6001溶液待用, 于-20下保存。精密称取适量荧光底物DQ-gelatin, 用HEPES缓冲溶液溶解, 配置成每50mL缓冲溶液中含有0.2 mg的DQ-gelatin溶液待用, 于-20下保存。称取100 g 红花药材粉末( 过40目筛) , 75%乙醇室温下浸泡提取6次, 每次提取12小时, 将75% 乙醇提取液过滤合并, 减压浓缩得水液。水液部分用石油醚脱脂2次, 弃去石油醚溶液, 再用乙酸乙酯溶液萃取5次, 弃去乙酸乙酯溶液, 水溶液减压回收蒸干, 得到红花水提取物。称取适量的红花水层提取物, 超纯水溶解过0.45 mm 滤膜, 配置成浓度为10 mg/mL, 8 mg/mL, 5 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL的样品溶液。于-20下保存, 用于抗炎活性测定。精密称取羟基红花黄色素A和红花黄色素B两种标准品适量, 加超纯水溶解, 分别配置成浓度为10 mg/mL, 8 mg/mL, 5 mg/mL, 2 mg/mL, 1 mg/mL系列标准品溶液。于-20下保存, 用于抗炎活性测定。精密称取适量的基质金属蛋白酶-2, 加入无菌水, 配置成浓度为100 ng/mL的储备液, 于-20下保存16 17。2.4实验原理和方法( 1) 实验原理对样品的抑制活性进行测定, 本实验所需的试剂有基质金属蛋白酶( MMP-2) 、 底物DQ-gelatin、 MMPs广谱抑制抑GM-6001, 以及样品试剂。在实验中, 由于DQ-gelatin为荧光底物, 被MMP-2降解DQ-gelatin后会发出荧光。生物小分子的蛋白酶活性的测定中, 向反应中加入红花样品溶液, 红花样品与MMP-2结合后, 底物不会被MMP-2降解, 最终抑制荧光强度的变化。( 2) 抑制活性的测定将一定量的MMP-2分别与5 L不同浓度的红花水提取物及标准品溶液(10, 8, 5, 2, 1 mg/mL)、 1 L无菌蒸馏水、 1 L 15 nmol/L的GM-6001加入96孔酶标板中, 然后加入HEPES缓冲溶液, 终体积为50 L, 放入37培养箱中孵育30 min; 然后加入含有0.2 g DQ-gelatin的缓冲溶液50 L, 最终反应体系为100 L, 红花样品最终浓度分别为0.2, 0.16, 0.1, 0.04, 0.02 mg/mL, 立即用酶标仪进行检测, 激发波长为460 nm, 发射波长为520 nm。检测10 min。检测的荧光强度变化就代表酶降解底物活力的强弱。( 3) 抑制活性计算抑制百分数Inhibition( %) 公式为: Inhibition( %) = 1 Vi / VoVi代表加入红花样品的荧光强度变化; 用Vo代表没有加入红花样品的荧光强度变化。当抑制百分数为50%时, 则为红花样品抑制酶活性的IC5018。第三章 结果与分析3.1 不同浓度红花水层提取物对基质金属蛋白酶-2的影响图16为红花水层提取物对基质金属蛋白酶-2体外抑制实验结果, 依次为空白组、 红花浓度分别为20, 40, 100, 160, 200 g/mL的实验组以及阳性抑制药物的实验结果。底物降解速率用”Mean V”表示, 也就是荧光强度随时间变化的变化速率, 根据公式Inhibition( %) = 1Vi / Vo, 能够计算出不同浓度的红花水层提取物对基质金属蛋白酶-2的抑制率。由图17所示, 空白组实验时, 无菌蒸馏水对蛋白没有活性抑制, 随着测定时间的变化, 荧光强度逐渐增强; 阳性对照组实验, 基质金属蛋白酶光谱抑制剂GM-6001对蛋白有非常好的抑制效果, 荧光强度保持不变; 当加入样品溶液时, 随着样品浓度的逐渐增大, 对基质金属蛋白酶-2的活性抑制随之加强, 当样品浓度达到200g/mL时, 抑制效果已经与GM-6001基本相近。基于上述实验结果, 我们能够推测出基质金属蛋白酶-2活性抑制达到50%时, 需要的红花水层提取物的含量( IC50) 。如图8, 所示IC50=5 g/mL。而且, 红花水层提取物对基质金属蛋白酶的抑制百分数与样品浓度成正比例关系, 说明在红花中, 可能存在对基质金属蛋白酶有活性抑制的成分。图1 空白组:MMP-2+底物DQ-gelatin+无菌蒸馏水5L、 图2 Test 1 MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液1 mg/mL 图3 Test 2 MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液2 mg/mL 图4 Test 3 MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液5 mg/mL图5 Test 4 MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液8 mg/mL图6 Test 5 MMP-2+底物DQ-gelatin+红花水层提取物溶液10 mg/mL图7 阳性组:MMP-2+底物DQ-gelatin+15nM/L GM6001图8 不同浓度的红花水层提取物对基质金属蛋白酶-2活性的抑制作用3.2 不同浓度红花标准品对基质金属蛋白酶-2的影响对红花水层粗提物进行分离, 得到两种主要色素类成分, 羟基红花黄色素A和红花黄色素B, 表1为两种成分对基质金属蛋白酶-2的抑制影响结果。Mean V 表明随着时间的改变荧光强度变化率, 由实验结果, 两种有效成分对基质金属蛋白酶的抑制百分数与样品浓度成正比例关系, 经过对实验数据的推导, 基质金属蛋白酶-2活性抑制达到50%时, 需要的羟基红花黄色素A( HSYA) 的含量IC50=84 g/mL, 需要的红花黄色素B( SYB) 的含量为IC50=3g/mL。由此可知, 两种化合物对于基质金属蛋白酶有明显的体外抑制活性, 且红花黄色素B的活性强于羟基红花黄色素A。表1 红花主要成分标准品对基质金属蛋白酶-2的影响GROUPMean VHSYASY-BBLANK24.627POSITIVE CONTROL1.832TEST115.1710.91TEST213.268.53TEST311.995.17TEST49.6032.451TEST58.0091.757IC50(mg/mL)0.084 0.003Blank: MMP-2+DQ-gelatin; Positive Control: MMP-2+DQ-gelatin+GM-6001; Test 1, 2, 3, 4, 5: MMP-2+DQ-gelatin with different concentration( 20、 40, 100, 160, 200 g/mL) sample3.3 结论据文献报道, 基质金属蛋白酶( MMPs) 有促进炎症产生的作用19-20, 而红花经过对MMPs抑制作用, 具有较好的抗炎活性。经过上述体外酶抑制实验证实, 红花水层提取物具有较强的基质金属蛋白酶的抑制活性, 且两种主要成分都对基质金属蛋白酶有活性抑制效果, 经过推断SYB对MMP-2的抑制作用要强于HSYA。实验结果为从分子水平上研究红花治疗相关疾病的机理奠定了基础, 也为今后进一步从红花中提取基质金属蛋白酶抑制剂并开发出以MMPs为靶点的中药新药提供了理论依据。参考文献1 施峰,刘焱文.红花的化学成分及药理研究进展J.时珍国医国药, ,17(9): 1666-1667.2 范云鹏,李十中.药用植物红花及其生物活性成分红花黄素的提纯J.中国医学生物技术应用杂志, ,3:73-76.3 常海涛,韩宏星,屠鹤飞等.中药红花化学成分及药理作用J.国外医药,1999,14 (5):201-203.4 赵明波,邓秀兰,王亚玲.高效液相色谱法测定红花中的羟基红花黄色素AJ.色谱, ,21(6): 593-595.5 臧宝霞,金鸣,司南.羟基红花黄色素A对血小板活化因子的拮抗作用J.药学学报, ,37(9):696-699.6 武永刚,李雪莹.中压制备与大孔树脂联用快速分离羟基红花黄色素AJ.湖北农业科学, ,51(7).7 刘红,郁晓艺,徐小燕.红花中羟基红花黄色素A含量的紫外分光光度法测定J.石河子大学学报, ,22(6):517-518.8杨捷威,吴婷婷,郭美丽.红花组织培养的研究进展J. 药学服务与研究, ,12 (1):58-62.9 Bell J A, Griinari J M, Kennelly J J. 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