超高效液相色谱快速测定饮料中的16种食品添加剂.pdf

195分析检测食品科学2010,Vol.31,No.02超高效液相色谱快速测定饮料中的16种食品添加剂王 骏，胡 梅，张 卉，张喜琦，祝建华(山东省产品质量监督检验研究院，国家加工食品质量监督检验中心(山东)，山东 济南 250100)摘 要：建立快速测定饮料中 16 种食品添加剂的分析方法。样品中的食品添加剂用甲醇-水提取，在 ACQUITYUPLC BEH C18色谱柱上分离，用二极管阵列检测器检测。结果表明，16 种食品添加剂在 5.5min 内可获得良好的分离，各组分检出限均优于 1.0mg/kg，加标回收率为 91.6%100.3%，RSD 为 0.66%2.20%，表明该方法精密度良 好。关键词：超高效液相色谱；饮料；食品添加剂；测定Rapid Determination of Sixteen Kinds of Food Additives in Beverages by Ultra Performance Liquid ChromatographyWANG Jun，HU Mei，ZHANG Hui，ZHANG Xi-qi，ZHU Jian-hua(Shandong Supervision and Inspection Institute for Product Quality,National Centre for Quality Supervision and Testing ofProcessed Food(Shandong),Jinan 250100,China)Abstract ：An ultra performance liquid chromatographic(UPLC)method was presented for the rapid determination of 16 kindsof food additives in beverages.The method was based on extraction with methanol mixed with water,separation on anACQUITY UPLC BEH C18 column and detection with diode-array detector.All the sixteen kinds of food additives were wellseparated within 5.5 minutes.The limits of detection for them were more than 1.0 mg/kg,and the recoveries at three spike levelswere 91.6%100.3%,RSD was 0.66%2.20%.Key words：ultra performance liquid chromatography(UPLC)；beverage；food additives；determination中图分类号：TS202.3；O657.72 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)02-0195-04收稿日期：2009-03-13作者简介：王骏(1972)，男，高级工程师，学士，主要从事食品及食品添加剂检测研究。E-mail：随着食品工业的快速发展，食品添加剂品种不断增加。目前全世界应用的食品添加剂品种已多达 25000 余种，我国 2007 年发布的 GB 2760食品添加剂使用卫生标准中，允许使用的 22 类食品添加剂近 2000 种。现代食品加工业中，一种食品往往同时使用多种食品添加剂，典型的如饮料中可能使用防腐剂、甜味剂、合成色素、咖啡因等添加剂，给食品安全监管工作带来了很大的困难。如按照现行标准1-5的方法进行检测，必须要用不同的方法对样品进行多次处理，分别检测不同的添加剂残留量，不仅费时费力，而且对于未明确标识的添加剂可能无法进行检测。近几年来，国内从事食品检测的研究人员对多种食品添加剂的快速同时测定技术进行了一定的研究6-9，目前报道的文献中，最多可以对 12 种食品添加剂进行同时测定。本实验应用超高效液相色谱技术，研究饮料中 16 种食品添加剂的快速测定方法，可用于各类饮料中食品添加剂的快速筛查，为食品添加剂的安全使用和监管提供技术支撑。1材料与方法1.1材料与试剂碳酸饮料、含乳饮料(各 5 批次)市售。苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、糖精钠、乙酰磺胺酸钾、柠檬黄、日落黄、胭脂红、苋菜红、诱惑红、亮蓝和咖啡因标准储备溶液(质量浓度均为 1mg/mL)国家标准物质中心；乙腈、甲醇(均为色谱纯)美国 Fisher 公司；乙酸铵(分析纯)国药集团(上海)化学试剂公司；超纯水 美国Mili-Q 纯水系统制；微孔滤膜(有机相，0.2m)。1.2仪器与设备OROR 2010,Vol.31,No.02食品科学分析检测196ACQUITY UPLC 型超高效液相色谱仪(配有二极管阵列检测器及Empower 2 色谱数据处理系统)美国Waters公司；XH-C 型涡旋混合器 江苏金坛市医疗仪器厂；3-18K型高速离心机(最高转速10000r/min)德国Sigma公司。1.3标准溶液的制备将各食品添加剂标准储备液配制成质量浓度均为50g/mL 的混合标准储备溶液，此溶液于 4冰箱中可储存 1 个月。将混合标准储备溶液用甲醇-水(1:9，V/V)依次稀释成 0.1、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0g/mL的系列标准溶液，使用前配制。1.4试样的处理称取 1.0g 碳酸饮料或含乳饮料试样于 10mL 容量瓶中，加入 1mL 甲醇，混匀，用超纯水定容至刻度，摇匀、涡漩混合2min。移取5mL于10mL离心管中，10000r/min 离心 5min，取上清液经微孔滤膜过滤后备用。1.5超高效液相色谱操作条件色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18柱(50mm 2.1mm，1.7m)；流动相：甲醇(A)、20mmol/L 乙酸铵溶液(B)，流动相梯度见表 1；流速：0.6mL/min；柱温：5 0；进样体积：5L。检测波长扫描范围：200500nm。2结果与分析2.1色谱分离条件的选择为实现多种食品添加剂的快速分析，选择粒径1.7m 的 BEH C18填料的色谱柱为分离柱，考虑到多种添加剂均为酸性结构，故采用 20mmol/L 乙酸铵溶液-甲醇体系为流动相，采用梯度洗脱的方式进行分离。经优化分离条件后所有 16 种食品添加剂在 5.5min 内均可良好分离，一次进样仅需 8min 即可完成。2.2检测波长的选择各组分经液相色谱分离，二极管阵列检测器扫描检测，取得各组分紫外光谱图，根据各组分紫外吸收情序号添加剂名称保留时间/min检测波长/nm1安赛蜜0.5502302苯甲酸0.6852303柠檬黄0.8724104山梨酸1.0452305糖精钠1.1482306脱氢乙酸1.4132307胭脂红1.7574108苋菜红2.7794109咖啡因2.83623010日落黄2.91441011诱惑红3.29941012对羟基苯甲酸甲酯3.51825613对羟基苯甲酸乙酯4.15725614亮蓝4.25441015对羟基苯甲酸丙酯4.72125616对羟基苯甲酸丁酯5.199256表2 16种食品添加剂保留时间和定量检测波长Table 2 Retention time and quantitative wavelengths of 16 kindsof food additives1.6测定步骤 体积分数配比/%时间/minAB梯度曲线0.001991.50298线性3.003070线性5.006040线性6.508020线性6.60199线性8.00199线性表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Mobile phase composition for linear gradient elution将标准工作溶液按照浓度由低到高的顺序进样测定，按照表2 中各组分定量检测波长提取对应的色谱图(图1)，以各色谱图中对应组分的峰面积对其质量浓度绘制标准曲线。试样溶液进样后，以各组分在对应检测波长色谱图中的保留时间和相应的光谱图定性，峰面积定量。OROR0.060.040.020.000.020.040.06苯甲酸AU时间/min00.51 1.52 2.533.5 44.55 5.5山梨酸糖精钠脱氢乙酸安赛蜜A.波长 230nm咖啡因0.0120.0100.0080.0060.0040.0020.0000.002柠檬黄AU时间/min00.51 1.52 2.5 33.5 44.55 5.5B.波长 410nm胭脂红苋菜红日落黄诱惑红亮蓝图1 16种食品添加剂色谱图Fig.1 Chromatograms of 16 kinds of food additives detected at230,410 nm and 256 nm wavelength,respectively0.140.120.100.080.060.040.020.00AU时间/min00.5 11.52 2.533.5 44.55 5.5对羟基苯甲酸甲酯对羟基苯甲酸乙酯对羟基苯甲酸丙酯对羟基苯甲酸丁酯C.波长 256nm197分析检测食品科学2010,Vol.31,No.02添加剂名称加标量/(mg/kg)测定值/(mg/kg)回收率/%54.9198.0安赛蜜109.8698.62019.5998.054.9599.0苯甲酸109.93100.32019.7798.854.9298.4柠檬黄109.7997.92019.4897.454.9498.8山梨酸109.8198.12019.7498.754.8597.0糖精钠109.7197.12019.5797.854.7995.8脱氢乙酸109.6796.72019.3596.854.9498.8胭脂红109.9099.02019.8299.154.9098.0苋菜红109.8598.52019.6698.354.8296.4咖啡因109.6896.82019.4897.454.8496.8日落黄109.7997.92019.3696.8表 3 回收率测定实验结果(n 3)Table 3 Recoveries for16 kinds of food additives in a blankbeverage sample spiked at three levels(n 3)况，确定在 230nm 波长处检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠、安赛蜜、脱氢乙酸和咖啡因，在 410nm 波长处检测柠檬黄、日落黄、胭脂红、诱惑红、苋菜红、亮蓝，在 256nm 波长处检测对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯。2.3样品提取方法的确定饮料中添加的食品添加剂多为水溶性，4 种对羟基苯甲酸酯类防腐剂具有一定的脂溶性，但多以钠盐的形式使用和存在。在提取时加入体积分数 10%的甲醇，可促进对羟基苯甲酸酯类的提取，且有一定的沉淀蛋白质的作用，经高速离心后，即使是含乳饮料也可获得澄清的上清液，过 0.22m 样品过滤器后进样测定，不会造成色谱柱堵塞。2.4回收率实验在一个不含任何食品添加剂的样品中，分别添加各组分含量为 5、10、20mg/kg 的食品添加剂标样。按照标准规定的方法测定，结果见表 3，加标回收率在91.6%100.3%之间。2.6线性范围和检出限将质量浓度分别为 0.1、1.0、5.0、10.0、25.0、50.0g/mL 混合标准溶液进样分析，按照各组分检测条件测定峰面积，以峰面积对相应质量浓度(g/mL)进行线性回归，各组分回归方程相关系数均优于 0.999，表明 0.150.0g/mL 范围内，各组分线性关系良好。当空白样品中添加各食品添加剂均为 1.0mg/kg 时，各组分色谱峰的信噪比均大于 20。由于通常饮料中使用的食品添加剂含量不可能很低，低含量起不到预期的防腐、增测定值/(mg/kg)测定平均RSD/%添加剂名称12345值/(mg/mL)安赛蜜10.3210.1910.2210.2910.3510.2740.66苯甲酸9.7110.029.899.9410.079.9261.40柠檬黄9.5510.019.699.789.949.7941.90山梨酸10.099.989.649.599.779.8142.20糖精钠9.929.889.699.579.499.711.94脱氢乙酸9.8810.129.9310.079.859.971.19胭脂红10.219.949.889.839.729.9161.85苋菜红10.1510.2510.1910.3310.2710.2380.69咖啡因9.929.499.819.549.679.6861.86日落黄10.2510.069.9810.1810.0110.0961.14诱惑红9.719.589.669.459.399.5581.42对羟基苯甲酸甲酯9.339.299.519.179.429.3441.38对羟基苯甲酸乙酯9.829.679.559.439.739.641.59亮蓝9.099.159.349.229.089.1761.17对羟基苯甲酸丙酯9.689.559.749.919.389.6522.07对羟基苯甲酸丁酯9.529.719.419.369.279.4541.79表4 精密度实验结果Table 4 Results of precision test for the method添加剂名称加标量/(mg/kg)测定值/(mg/kg)回收率/%54.7895.6诱惑红109.5895.82019.2296.154.7294.4对羟基苯甲酸甲酯109.4494.42019.0295.154.5891.6对羟基苯甲酸乙酯109.3493.42018.9094.554.6693.2亮蓝109.5695.62019.1295.654.7194.2对羟基苯甲酸丙酯109.4294.22019.1495.754.7094.0对羟基苯甲酸丁酯109.4594.52019.1195.6续表 32.5精密度实验对加标 10mg/kg 的样品平行测定 5 次，结果见表 4。RSD 为 0.66%2.20%，表明该方法精密度良好。2010,Vol.31,No.02食品科学分析检测198色、增味的效果，所以本方法没有去探讨如何获得更低的检出限，确定各组分 1.0mg/kg 的检出限已经可以充分满足各类检验需求。3结 论本实验所建立的超高效液相色谱测定饮料中 16 种食品添加剂的方法，具有分离效果好、定量准确，测定通量高的优点，可以用于同时测定饮料中的多种食品添加剂，也可用于未知样品中所含食品添加剂的快速 筛查。参考文献：1GB/T 5009.28 2003 食品中糖精钠的测定S.2GB/T 5009.29 2003 食品中山梨酸、苯甲酸的测定S.3GB/T 5009.35 2003 食品中合成着色剂的测定S.4GB/T 5009.139 2003 饮料中咖啡因的测定S.5GB/T 5009.140 2003 饮料中乙酰磺胺酸钾的测定S.6贾玉珠,骆和东,林健.HPLC 法同时测定饮料中 5 种添加剂的研究J.中国卫生检验杂志,2005,15(4):448-449.7陈翊,张丽,张心会.HPLC 法同时快速测定饮料中 12 种添加剂J.中国卫生检验杂志,2008,18(9):1759-1760.8黄百芬,张文娟,沈向红.高效液相色谱法同时测定酱油或饮料中的 8 种防腐剂和 3 种甜味剂J.中国卫生检验杂志,2005,15(10):1208-1212.9张秀尧.反相高效液相色谱法同时快速测定食品中常见的8种食品添加剂J.色谱,2000,18(6):539-542.