超高效液相色谱法同时测定饮料中的10种食品添加剂.pdf

建立了一种超高效液相色谱法测定饮料中 10 种常见的食品添加剂。经 ACQUITYUPLCBEHC18（2.1mm50mm，1.7m）色谱柱进行分离，以 0.02mol/L 乙酸铵和甲醇溶液作为流动相进行梯度洗脱，柱温30，流速 0.15mL/min，检测器波长在 230nm 处进行检测，并以外标法进行定量。通过优化色谱分离条件，该方法实现了饮料中 10 种食品添加剂在 10min 内各组分可得到完全分离，标准曲线在 0.050 50.0g/mL 范围间呈良好的线性关系，方法检出限为 0.0017 0.0034g/mL，加标回收率为 97.9%101.1%，相对标准偏差 RSD 为 0.69%2.8%。结果表明，该方法具有线性范围宽、检出限低、灵敏度高、重复性好等优点，能满足饮料中 10 种食品添加剂的快速检测要求。关键词：食品添加剂；超高效液相色谱法；饮料；同时测定中图分类号：TS27/TS202.3 文献标识码：A 文章编号：1006-2513（2020）06-0099-06doi：10.19804/j.issn1006-2513.2020.06.016Simultaneous determination of ten kinds of food additives in beverage by Ultra-Performance Liquid Chromatography（UPLC）methodTAN Jing-hui*，XIE Hong-bin，ZHOU Wu-xiong（Hengyang Center for Disease Control and Prevention，Hengyang 421001）Abstract：This purpose of this study is to establish a method of UPLC for the determination of 10 kinds of food additives.Separated by ACQUITY UPLCBEH C18（2.1mm50mm，1.7m）with ammonium acetate（0.02mol/L）/methanol as the gradient element with a flow rate 0.15mL/min at 30，and a diode array detector was used to detect at 230nm.The optimized separation of ten kinds of food additives in 10 min was carried out by optimizing the pretreatment process.The linear relationship between ten kinds of food additives was better under optimized conditions.The standard curves had good linearity within the range of 0.050 50.0g/mL，the detection limit was 0.0017 0.0034g/mL，the relative standard deviation（RSDs）was 0.69%2.8%，and the average recovery rate was 97.9%101.1%.The results showed that the method has the advantages of low detection limit，high sensitivity and good reproduction，and can meet the requirements for the determination of ten food additives in beverage.Key words：food additives；ultra-performance liquid chromatography（UPLC）method；beverage；simultaneous determination.收稿日期：2019-12-19 *通讯作者作者简介：谭璟慧（1988-），女，硕士，主管技师，研究方向：卫生检验学分析，食品检验学分析，环境（空气、水质）学分析，E-mail：。1002020年第6期中国食品添加剂China Food Additives分析测试在饮料加工行业中，通常加入各种食品添加剂用以改善饮料的口感、品质和色泽，并可延长保质期1。饮料中常见的食品添加剂包括甜味剂（糖精钠）、人工合成色素（日落黄、亮蓝、苋菜红、诱惑红、胭脂红、柠檬黄）、防腐剂（山梨酸、苯甲酸）及咖啡因等。尽管我国国家标准2中已经明确规定了食品添加剂允许使用的范围和用量，但长期、大量食用含有食品添加剂的饮料，同样会对人体健康造成一定的风险。因此，检测饮料中多种食品添加剂的含量对保障食品安全具有重要意义。近年来，同时检测多种食品添加剂的方法越来越多，常用的检测方法有高效液相色谱 法3-6、薄层色谱法7、质谱联用法8-12、气相色谱法13、极谱法14等。然而，对于多组分混合物的分析，大部分方法均存有一定的局限性。如薄层色谱法测定多组分混合物时，操作步骤繁琐，且定量准确度较差；色谱-质谱联用法虽然在分辨率和灵敏度方面有一定优势，但其仪器昂贵、不易普遍推广；极谱法易受多种干扰因素的影响，定性较为困难；液相色谱法是目前应用最广泛的分析方法，但传统的液相色谱法对于同时检测多组分混合物时，分析耗时长、进样量大、检测效率低。本研究利用超高液相色谱（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC）技术同时快速检测日落黄、亮蓝、苋菜红、诱惑红、胭脂红、柠檬黄、山梨酸、苯甲酸、糖精钠及咖啡因等 10种食品添加剂，可大幅度增强多种组分的分离能力，提高了分析速度及灵敏度，为食品安全的检测提供了必要的技术支持。1 实验部分1.1 主要仪器和试剂仪器：超高效液相色谱仪Waters Acquity H-Class，配 二 极 管 阵 列 检 测 器（PDA），Empower 3 色谱工作站；ACQUITY UPLCBEH C18（2.1mm50mm，1.7m）；紫 外 可 见 分 光光度计（SP-1900UV）；中文液晶超声波清洗器（昆山美美超声仪器有限公司）；TB-214 型 1/万分之一电子天平（北京赛多利斯）；高速冷冻离心机（Thenmo Fisher）；超纯水机（Millipore 公司）；0.22m 微孔滤膜过滤器。标准品：日落黄、亮蓝、苋菜红、胭脂红、柠檬黄、咖啡因标准品浓度均为 0.5 mg/mL，诱惑红、混合溶液（苯甲酸、山梨酸、糖精钠）标准品浓度均为 1.0 mg/mL，均购自中国计量科学研究院。试剂：乙酸铵（优级纯、CNW Ammonium acetate for HPLC）；甲 醇（色 谱 纯、美 国MERCK 公司）；乙腈（色谱纯、美国 MERCK公司）；实验用水均由 Milli-Q 超纯水机制取。50g/mL 10 种添加剂混合标准储备液配置：分别准确吸取 2.5mL 浓度均为 0.5mg/mL 的日落黄、亮蓝、苋菜红、胭脂红、柠檬黄、咖啡因标准品及 1.25mL 浓度均为 1.0mg/mL 诱惑红、混合溶液（苯甲酸、山梨酸、糖精钠）标准品于25mL 容量瓶中，用水定容至刻度。混合标准系列：准确吸取一定体积的混合标准储备液（50g/mL）分别配制成质量浓度为 0、0.05、1.0、5.0、10.0、20.0、40.0、50.0g/mL 标准溶液系列。1.2 色谱条件色 谱 柱 为 ACQUITY UPLCBEH C18（2.1 mm50mm，1.7m），柱 温 30，进 样 量：3L，流速为 0.15 mL/min，检测波长为 230 nm。流动相分别为甲醇（A）和 0.02mol/L 乙酸铵（B），流动相的梯度洗脱程序如下表所示：表 1 梯度洗脱表 Table 1 Program of gradient elution时间（min）甲醇（A）0.02 mol/L 乙酸铵（B）0.020803.040605.070307.080209.0604010.020802 结果与讨论2.1 实验条件的优化2.1.1 色谱柱的选择本试验考察了色谱柱 ACQUITY UPLCBEH 1012020年第6期中国食品添加剂China Food Additives分析测试C18（2.1mm50mm，1.7m）与色谱柱ACQUITY UPLCBEH C18（2.1mm100mm，1.7m）的分离效果。结果表明，选择柱长为100mm 的色谱柱时，各组分出峰时间延长，并且色谱峰响应值低；而选择柱长为 50mm 色谱柱时，所有组分混合物可在 10min 内满足快速分离的需要，所得峰形尖锐且分离度好。因此，本 试 验 选 择 ACQUITYUPLCBEH C18（2.1mm50mm，1.7m）作为方法最佳色谱柱。2.1.2 检测波长的选择用紫外-可见分光光度计在 200 800nm 波长处对 10 种食品添加剂进行扫描，用水作参比。其主色峰：柠檬黄 428nm、日落黄 475nm、诱惑红 506nm、胭脂红 511nm、苋菜红 522nm、亮蓝637nm、苯甲酸 228nm、山梨酸 248nm、糖精钠251nm、咖啡因 273nm，可初步定性判定 10 种食品添加剂在紫外-可见分光光度计的最大吸收波长。再利用 UPLC-PDA 检测器在 200 600nm波长范围内对混合标准溶液进行扫描，发现在230nm 波长处 10 种食品添加剂分离度好、灵敏度高，故最终选择 230nm 作为检测波长。2.1.3 流动相的选择本试验分别考察乙腈/甲醇-乙酸铵缓冲液，乙腈/甲醇-磷酸二氢钾缓冲液，乙腈/甲醇-水缓冲液作为流动相体系的分离效果。结果表明，当流动相为甲醇-乙酸铵缓冲液时，10 种目标物实现完全分离，同时本试验对乙酸铵溶液1.00.50.0400123456500600700Wavelength（nm）Abs8001.柠檬黄 2.日落黄 3.诱惑红 4.胭脂红 5.苋菜红 6.亮蓝图 1 6 种着色剂的紫外-可见光谱图 Figure 1 UV-Vis spectra of the 6 colorants1.00.80.60.40.20.03003214400500Wavelength（nm）Abs1.糖精钠 2.山梨酸 3.苯甲酸 4.咖啡因 图 2 4 种防腐剂的紫外-可见光谱图 Figure 2 UV-Vis spectra of the 4 preservatives 浓度分别为 10、20、40 mmol/L 进行了比较。结果表明，当乙酸铵浓度小于 20mmol/L 时，苯甲酸和山梨酸色谱峰得不到完全分离，亮蓝和咖啡因色谱峰重叠在一起（见图 3a）；当乙酸铵浓度大于 20mmol/L 时，各组分分离度差，影响方法难以定性（见图 3b）。此外，当流动相中盐类溶液浓度过高，容易引起 UPLC 色谱柱堵塞，影响色谱柱的柱效。所以本试验选用甲醇-20mmol/L乙酸铵溶液作为流动相体系，不仅可以改善分离效能，还能够达到缩短检测时间的目的。2.1.4 流速的选择流速的改变会影响梯度洗脱时间和分离效果。试验考察了 0.10 0.60mL/min 范围间 10 种目标化合物的分离效果。当流速大于 0.2mL/min时，出峰时间提前，容易造成各目标物之间分离度和峰型都不理想。当流速小于 0.15mL/min 时，延长了目标物出峰时间，降低了工作效率。所以，本试验选用 0.15mL/min 作为方法最佳流速。2.1.5 梯度洗脱程序的选择试验分析了流动相中甲醇初始比例对分离度的影响。当甲醇比例大 20%时，前 4 种目标化合物出峰较快，但色谱峰响应值低，易出现色谱峰重叠现象；当甲醇比例小于 20%时，各目标物出峰时间延长，并且峰形差，所以选择甲醇的初始比例为 20%，0.02mmol/L 乙酸铵的初始比例为80%。梯度洗脱程序运行到 10min 时，甲醇比例1022020年第6期中国食品添加剂China Food Additives分析测试0.250.200.150.100.050.00AU0112233，44556677at（min）8899，10甲醇-乙酸铵10mmol/L100.250.200.150.100.050.00AU01234567bt（min）89甲醇-乙酸铵40mmol/L10（a）甲醇-乙酸铵（10mmol/L）（b）甲醇-乙酸铵（40mmol/L）1.柠檬黄 2.苋菜红 3.苯甲酸 4.山梨酸 5.糖精钠 6.胭脂红 7.日落黄 8.诱惑红 9.亮蓝 10.咖啡因图 3 甲醇-乙酸铵（10mmol/L、40mmol/L）流动相下所测得的 10 种食品添加剂色谱图 Figure 3 Chromatograms of mixed 10 kinds of food additives with mobile phase of methanol-ammonium acetate（10mmol/L、40mmol/L）再重新回到 20%，目的是稳定基线，方便下一个目标物实现更好的分离。2.1.6 柱温的选择本试验考察了柱温在 20 50范围间的检测结果，当 T 30时，各组分分离效果较差；当 T 30时，柱效降低。因此，选择30为最佳检测柱温温度。在优化的实验条件下，10 种食品添加剂在10min 内能满足快速分离的需要，且分离度与灵敏度都较好。标准色谱图见图 4。0.250.200.150.100.050.00AU011223344556677t（min）889910101.柠檬黄 2.苋菜红 3.苯甲酸 4.山梨酸 5.糖精钠 6.胭脂红 7.日落黄 8.诱惑红 9.亮蓝 10.咖啡因图 4 10 种食品添加剂混合标准溶液色谱图（10g/mL）Figure 4 Chromatogram of mixed 10 kinds of food additives standard solution（10g/mL）3 标准曲线、检出限及精密度测定3.1 标准曲线、检出限的测定按优化好的试验条件对 10 种食品添加剂混合标准溶液系列进行色谱分析，以各组分的峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标，并绘制标准曲线。结果表明，在 0.050 50.0g/mL 范围内，10 种食品添加剂的质量浓度与峰面积呈良好的线性关系，相关系数 R2均大于 0.999，以 3 倍信噪比（3S/N）计算方法检出限，方法检出限介于0.0017 0.0034g/mL 之间。标准曲线、相关系数、检出限及线性范围见表 2。3.2 精密度试验本 试 验 分 别 对 5.0g/mL、10.0g/mL 和40.0g/mL 三组浓度的混合标准溶液进行 7 次平行测定。如表 3 所示，测定低、中、高三组浓度的相对标准偏差（RSD）范围在 0.69%2.8%之间，表明本试验精密度良好。4 样品前处理及样品分析取 10g 饮料样品（精确称量至 0.001g）于50mL 具塞离心管中，加适量水，超声 15min，用水定容至刻度，经高速离心机（4000r/min）离心 10min，再用 0.22m 微孔滤膜过滤，滤液供UPLC 测定。1032020年第6期中国食品添加剂China Food Additives分析测试表 2 10 种食品添加剂的标准曲线、相关系数、线性范围及检出限 Table 2 Linear equations，correlation coefficient（R2），linear ranges and limits of detection（LOD）of ten kinds of food additives添加剂名称标准曲线相关系数 R2检出限（g/mL）线性范围（g/mL）日落黄y=35570.1x 344360.99950.00290.050 50.0亮蓝y=806213.9x 4708.20.99980.00320.050 50.0苋菜红y=176529.0 x 3923.70.99960.00310.050 50.0诱惑红y=134201.8x 75200.99990.00300.050 50.0胭脂红y=304764.0 x 136.90.99970.00280.050 50.0柠檬黄y=28447.3x 411.80.99980.00290.050 50.0糖精钠y=606619.2x 759.10.99970.00250.050 50.0苯甲酸y=163142.5x 635.60.99990.00170.050 50.0山梨酸y=219358.0 x 688.80.99990.00200.050 50.0咖啡因y=498295.2x 1004.80.99940.00340.050 50.0表 3 精密度实验结果（n=7）Table 3 Results of precision experiment（n=7）添加剂名称RSD（%）5.0g/mL10.0g/mL40.0g/mL日落黄2.71.21.7亮蓝2.51.71.1苋菜红2.81.81.8诱惑红2.21.91.4胭脂红2.11.41.4柠檬黄2.51.41.3糖精钠1.21.10.69添加剂名称RSD（%）5.0g/mL10.0g/mL40.0g/mL苯甲酸1.71.30.78山梨酸1.81.20.81咖啡因2.72.52.0在样品上进行 5.1g/mL 加标回收率试验，每组进行 6 次平行测定，并与传统液相色谱法进行对照分析，如表 4 所示，UPLC 检测的各组分样品回收率在 97.9%101.1%之间，所有目标物的相对标准偏差均小于 5.0%，且两种方法所得到的结果有良好的一致性。表 4 10 种食品添加剂样品加标回收率实验结果（n=6）Table 4 Recovery results of 10 kinds of food additives（n=6）添加剂名称测定均值（UPLC）（g/mL）加标后测定值（UPLC）（g/mL）标准加入量（g/mL）回收率（%）（UPLC）RSD（%）（UPLC）加标后测定值（HPLC）（g/mL）日落黄ND5.1015.1100.0%4.85.141亮蓝ND4.9935.197.9%4.55.126苋菜红ND5.0415.198.8%4.85.143诱惑红ND5.0195.198.4%4.55.134胭脂红ND5.1015.1100.0%3.85.142柠檬黄0.0415.1985.1101.1%4.85.122糖精钠0.0815.1055.198.5%4.55.1131042020年第6期中国食品添加剂China Food Additives分析测试添加剂名称测定均值（UPLC）（g/mL）加标后测定值（UPLC）（g/mL）标准加入量（g/mL）回收率（%）（UPLC）RSD（%）（UPLC）加标后测定值（HPLC）（g/mL）苯甲酸ND5.1015.1100.0%3.85.038山梨酸ND4.9965.198.0%2.25.132咖啡因0.0725.1195.199.0%4.85.122ND：not detected.5 结论本方法采用超高效液相色谱法测定饮料中 10种食品添加剂，在优化后的试验条件下，各组分在 10min 内可达到完全分离，且具有良好的线性关系，检出限为 0.0017 0.0034g/mL，样品加标回收率为 97.9%101.1%。此方法与传统液相色谱法相比，可大大缩短测定的分析时间，有效提高了检测效率，具有现实指导意义，为应用于食品中添加剂的检测奠定了基础。参考文献：1李小云，赵喜玲，李琪，等.食品中 10 种色素的高效液相色谱同时检测方法 J.四川师范大学学报：自然科学版，2016，39（6）：895-899.2中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.食品安全国家标准 食品添加剂使用标准：GB 27602014S.北京：中国标准出版社，2015.3尤妍，潘辉国，陈盼盼，等.高效液相色谱法同时测定饮料中 5 种添加剂 J.食品研究与开发，2016，37（4）：164-166.4阮丽萍，吉文亮，刘华良，等.高效液相色谱法同时测定食品中 10 种合成着色剂 J.中国食品卫生杂志，2011，23（2）：151-154.5王维静，曾红燕.饮料中 8 种食品添加剂的高效液相色谱法测定方法研究 J.解放军预防医学杂志，2017，35（8）：895-898，927.6Luo Z G，Tang H T，Sun B W.Simultaneous determination of synthetic pigment，sweeteners and preservatives in beverages by high performance liquid chromatography J.Pract Prev Med，2010（8）：1656-1658.7张存新.薄层色谱法测定调味品中苯甲酸的研究 J.理化检验：化学分册，2005，41（10）：753-754.8米建萍，徐远金，朱平川，等.液质联用技术在滥用食品添加剂及食品中违法添加物测定中的应用及研究进展 J.基因组学与应用生物学，2015，34（7）：1579-1586.9桂茜雯，柳菡，许蔚，等.葡萄酒中 26 种添加剂的高效液相色谱-高分辨质谱筛查法 J.质谱学报，2015，36（2）：148-155.10闫震，聂继云，李志霞，等.超高效液相色谱-串联质谱法同时检测果汁中 7 种甜味剂 J.农产品质量与安全，2018（4）：25-30，39.11鞠福龙，李春娟，李东刚.气相色谱-质谱联用法同时检测调味品中 7 种防腐剂 J.中国调味品，2009，34（10）：79-81，84.12Ochiai N，Sasamoto K，Takino M，et al.Simultaneous determination of preservatives in beverages，vinegar，aqueous sauces，and quasi-drug drinks by stir-bar sorptive extraction（SBSE）and thermal desorption GC-MS J.Analytical and Bioanalytical Chemistry，2002，373（1-2）：56-63.13何凤云，余辉，殷婷婷，等.快速程序升温气相色谱法同时测定食醋中六种常见防腐剂 J.中国调味品，2010，35（6）：108-110.14谢东华，叶鹿鸣，裘立晓，等.单一底液连续直接测定饮料中色素、糖精钠的示波极谱法 J.中国卫生检验杂志，1998，8（2）：84-85.中国食品添加剂杂志中国科技核心期刊 欢迎您通过唯一渠道本刊在中国知网的期刊编审系统投稿 网 址：http:/