GC和GC_MS法测定饮料中香兰素和乙基香兰素含量.pdf

本文建立了一种气相色谱(GC)和气相色谱-质谱（GC-MS）法测定饮料中香兰素和乙基香兰素含量的方法。无色样品经乙醚萃取、离心、取上清液浓缩定容经 0.22 m 有机相滤膜净化进样，有颜色样品经乙醚萃取、离心、取乙醚上清液浓缩至近干，丙酮溶解混匀，过石墨化碳黑柱净化，浓缩定容，分别进GC-FID 和 GC-MS 测定及确证，外标法定量。GC 法测定香兰素和乙基香兰素的添加回收率范围为 80%105%，相对标准偏差(RSD)小于 6.0%。GC-MS 法测定香兰素和乙基香兰素的添加回收率范围为 81%110%，相对标准偏差(RSD)小于 6.0%。该方法中 GC 仪器操作简单、成本较低，可广泛应用于饮料中香兰素和乙基香兰素日常检测，GC-MS 法采用选择离子扫描(SIM)排除 GC 法测定的假阳性结果，使测定结果更准确可靠，两种方法互补使用，适合饮料中香兰素和乙基香兰素的日常分析检测和质量控制。关键词：关键词：香兰素，乙基香兰素，饮料，气相色谱，气相色谱-质谱 Determination of vanillin and ethyl vanillin contents in beverages by GC and GC-MS Feijin Peng*Xing Xu Ping Shu Yongyang Mao Yan Zhang Haojun Zhao Weihua Yang Qixin Guo（Dali Comprehensive Inspection Centre of Quality and Technical Supervision，Dali Yunnan 671000）Abstract:A method for determination of vanillin and ethyl vanillin in beverages by gas chromatography(GC)and gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)was established.If samples were colorless,firstly extracted by ether,centrifuged and then the supernatant fluid were purified by 0.22 m organic phase membrane and quantified by GC and GC-MS.If samples were color，firstly extracted by ether,centrifuged and then the supernatant fluid were collected and enrichment to nearly dry，then dissolved by acetone,purified and concentrated by Carbon-GCB.Finally，they were quantified and certified by GC and GC-MS,using external standard.The recoveries of vanillin and ethyl vanillin by the GC method and GC-MS method ranged from 80 to 105 and from 81 to 110 respectively,as well as RSD was less than 6.0%.GC instrument was operated simply and that the cost of operation was relatively low，so it can be widely used in vanillin and ethyl vanillin daily testing in beverages.GC-MS method using selected ion scan(SIM)to rule out false positives sample which was tested by GC method and made the results more accurate and reliable.The two methods were complement each other,which were suitable for the daily determination and quality control of vanillin and ethyl vanillin contents in beverages.Key words:vanillin；ethyl vanillin；beverages；gas chromatography(GC)；gas chromatography-mass spectrometry(GC-MS)中图分类号：TS207.3 文献标识码：A 文章编号：香兰素（Vanillin），又名香草醛，学名3-甲氧基-4-羟基苯甲醛,乙基香兰素,学名3-乙氧基-4-羟 *通迅作者：姓名：彭飞进（1982-），女，硕士研究生，工程师，研究方向主要为产品质量检验及食品中添加剂及污染物限量检测。E-mail:.基金项目：云南省 2014 年制定/修订食品安全地方标准项目（云卫2014DB003）网络出版时间：2015-02-11 15:38网络出版地址：http:/ 基苯甲醛，可在香荚兰的种子中找到，也可以人工合成，两者均是食品中重要的香味添加剂，广泛运用在各种调香食品中，如饮料、糕点、乳制品、巧克力、糖果、婴幼儿配方食品等。除香兰素和乙基香兰素可被人工添加外，国外许多研究表明香兰素自然存在于一些水果1中，如桔子、柠檬、芒果和葡萄柚等。而香兰素的安全性在国内外仍然存在一定争议，欧盟专家委员会经过多年的实验研究发现，大剂量的使用香兰素对人体有较大的危害，过度摄入可导致头痛、恶心、呕吐、呼吸困难，甚至损伤肝肾等2。饮料是消费量较大的食品，因此建立饮料中香兰素和乙基香兰素检测，有利于生产企业日常质量控制和监管部门的日常监督和风险监测，保障食品安全。目前食品中香兰素和乙基香兰素检测方法主要涉及婴幼儿配方奶粉、牛奶、饼干和蛋糕等毛细管电泳法3-5、修饰电级法6、高效液相色谱法7-9、液相色谱质谱联用法10-12、气相色谱法13-14 和气相色谱质谱联用法等15-18，然而饮料中检测香兰素和乙基香兰素的气相色谱法和气相色谱质谱法未见报道。本实验采用实验室易得的乙醚，无水乙醇等毒性低的试剂提取，前处理简单快速，方法中GC仪器操作简单，成本较低，应用范围广，GC-MS法采用选择离子扫描(SIM)排除假阳性使测定结果更准确可靠，两种方法互补使用，为一般实验室测定饮料中香兰素和乙基香兰素提供了一个准确度高、简便易得的方法。1 材料与方法材料与方法 1.1 材料与试剂 5 种有色饮料样品和 4 种无色饮料样品 当地市场购买所得。香兰素(纯度99%)Sigma-Aldrich 公司；乙基香兰素(纯度99%)Sigma-Aldrich 公司。无水乙醇（色谱纯）德国默克公司；乙醚（分析纯）利安隆博华（天津）医药化学有限公司；丙酮（色谱纯）德国默克公司；石墨化碳黑柱（Carbon-GCB，250 mg/3 mL）上海安谱实验科技股份有限公司。1.2 仪器与设备 GC-2010plus 气相色谱仪和 GCMS-QP2010 气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；AB204-E 电子天平，梅特勒一托利多仪器（上海）有限公司；TG16-WS 台式高速离心机，湖南湘仪离心机仪器有限公司；氮吹仪，天津澳特赛恩斯仪器公司。其它为实验室常用设备。1.3 实验条件 1.3.1 气相色谱（GC）仪器条件 色谱柱：毛细管柱为 DB-1701 柱（30.0 m0.250 mm0.25m）；升温程序：60 保持 2 min，以 10/min 升至 250，保持 2 min；载气为氮气（99.999%）流速 1.58 mL/min，压力 114.4 kPa，进样量 1 L；分流比 2:1；进样口温度 240；FID 检测器温度 250.0。1.3.2 气相色谱质谱联用（GC-MS）仪器条件 色谱柱：毛细管柱为 DB-1701 柱（30.0 m0.250 mm0.25 m）；升温程序：70 保持 1 min，以 10/min 升至 240，保持 1 min；载气为氦气（99.999%）流速 1.51 mL/min，压力 98.8 kPa，进样量 1 L；不分流方式；进样口温度250。电子轰击（EI）离子源；电子能量 70 eV；接口温度 280；离子源温度 230；溶剂延迟时间 5 min；母离子 m/z 151 和 137；激活电压 0.9 V。SCAN 质量扫描范围 m/z 50.00250.00，扫描时间 515 min。定量：SIM 扫描。香兰素扫描离子：151，152，81。其中，特征离子为 151，参考离子为 152，81。乙基香兰素扫描离子：137，166，138。其中，特征离子为 137，参考离子为 166，138。1.3.3 标准溶液的配制与标准曲线绘制 准确称取 20 mg 香兰素和乙基香兰素标准物质，溶于 100 mL 容量瓶中，用无水乙醇定容至刻度，摇匀备用，配制成浓度为 200 mg/L 的混合标准储备液。精密吸取 0.1、1、2、5、8、10 mL 和 20 mL 混合标准储备液于 100 mL 容量瓶中，各加无水乙醇定容至刻度，分别配制成浓度为 0.2、2、4、10、16、20、40 mg/L 标准系列。按照上述色谱条件进行测定，作峰面积对浓度的标准曲线，求出线性回归方程。1.3.4 样品处理 无色饮料样品称取约 10 g（精确至 0.0001 g）于 25mL 比色管中，加入约 3 g（精确至 0.01 g）氯化钠，10 mL 乙醚萃取（如有必要离心，以不低于 3500 r/min 离心 3 min），取上清液经 0.22 m 有机相滤膜过滤，分别上 GC 和 GC-MS 仪器测定。有色饮料样品称取约10 g（精确至 0.0001 g）于 25 mL 比色管中，加入约 3 g（精确至 0.01 g）氯化钠，10 mL 乙醚萃取（如有必要离心，以不低于 3500 r/min 离心 3 min），取上清液 2.5 mL 氮吹浓缩至近干，用 2.5 mL 丙酮溶解定容，过石墨化碳黑柱（预先用 5 mL 丙酮活化），5 mL 丙酮洗脱，合并滤液，氮吹浓缩至近干，2.5 mL 无水乙醇溶解定容，分别上 GC 和 GC-MS 仪器测定。1.3.5 样品分析 在相同的气相色谱和气相色谱质谱条件下，分别将标准溶液和样品溶液注入仪器中，以保留时间定性，以试样峰面积与标准比较定量。2 2 结果与分析结果与分析 2.1 前处理方式的选择 带有颜色的饮料如果直接用乙醚提取浓缩定容，定容液中颜色较深，进入色谱会污染仪器，对仪器的正常使用造成影响，因此考虑进一步净化。实验过程中分别选用了弗罗里硅柱，氨基活性柱和石墨化碳黑柱，经过实验发现，弗罗里硅柱无法去除色素，氨基活性柱虽然能除去色素但香兰素和乙基香兰素难以从柱子上洗脱下来，造成回收率低。石墨化碳黑柱既能除去色素又能获得香兰素和乙基香兰素的高回收率，最后被确定采用。2.2 仪器条件选择 仪器条件选择色谱柱时考虑了弱极性柱和中等极性柱两种类型，实验发现弱极性柱香兰素和乙基香兰素峰拖尾明显，中等极性柱峰型对称不拖尾，确定选用DB-1701柱如图1，气相色谱质谱法总离子扫描质谱图如图2，气相色谱法色谱图如图3，气相色谱法和气相色谱质谱法出峰顺序一致，其中峰1为香兰素，峰2为乙基香兰素。图 1 Rxi-5ms柱选择离子扫描图（a）和DB-1701柱选择离子扫描图（b）Fig.1 SIM chromatogram by using Rxi-5ms column（a）and DB-1701 column（b）图 2 香兰素（a）和乙基香兰素（b）总离子扫描质谱图 Fig.2 Total ion mass spectrum of vanillin（a）and ethyl vanillin（b）图3 香兰素和乙基香兰素气相色谱图 Fig.3 GC chromatogram of vanillin and ethyl vanillin 2.3 方法的线性范围与检出限 在优化的色谱条件下进行色谱分析，以峰面积对标准溶液浓度作图，建立标准曲线。同时以 10倍噪音计算定量方法检测限，如表 1 所示。表 1 回归方程及定量检出限 Table 1 Results of tests for regression equations and detect limits 测定方法 测定目标物 回归方程 线性范围（mg/L）相关系数 r 定量检出限（mg/kg）气相色谱法 气相色谱质谱法 香兰素 乙基香兰素 香兰素 乙基香兰素 Y=3.356e-004X+2.37 Y=2.76e-004X+1.41 Y=0.60X-6.09 e-002 Y=1.15X9.97 e-002 240 240 0.240 0.240 0.9991 0.9993 0.9993 0.9994 2 2 0.5 0.5 2.4 方法回收率与精密度 通过对个无颜色样品添加三个不同浓度的香兰素和乙基香兰素标准物质并进行多次平行处理及测定，以计算方法精密度及回收率（n=5），所得结果如表 2 所示。通过对个有颜色样品添加三个不同浓度的香兰素和乙基香兰素标准物质并进行多次平行处理及测定，以计算方法精密度及回收率（n=5），所得结果如表 3 所示。表 2 无颜色样品回收率及精密度实验（n=5）Table 2 Recoveries and precision of the colorless samples（n=5）测定组分 本底值（mg/kg）添加浓度（mg/kg）GC 法回收率(%)GC 法 RSD%GC-MS 法回收率(%)GC-MS 法 RSD（%）香兰素 乙基香兰素 0 0 2 10 20 2 10 20 103105 99104 98105 98105 99105 96105 5.9 1.7 2.4 2.1 1.5 2.3 103110 104107 96110 98110 96110 96109 5.6 3.2 2.5 3.5 2.7 2.4 表 3 有颜色样品回收率及精密度实验（n=5）Table 3 Recoveries and precision of the color samples（n=5）测定组分 本底值（mg/kg）添加浓度（mg/kg）GC 法回收率(%)GC 法 RSD（%）GC-MS 法回收率(%)GC-MS 法 RSD（%）香兰素 乙基香兰素 0 0 2.12 10.60 21.20 2.12 10.60 21.20 97105 80104 80105 90105 80105 80105 1.1 3.3 1.6 3.4 2.9 3.3 82110 8695 81102 83110 85101 8499 2.9 3.2 2.7 1.7 3.3 2.5 2.5 其它样品检测结果 本实验室人员应用所建的方法，对另外 7 个饮料样品进行了检测，得表 4 中检测结果。表 4 其他样品检测结果 Table 4 Results of tests for other samples 检测方法 组分名称 测定值（mg/kg）S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 气相色谱法 气相色谱质谱联用法 香兰素 乙基香兰素 香兰素 乙基香兰素 ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND ND 0.42 0.34 18.02 2.62 17.32 2.80 ND ND ND ND 4.43 ND 4.72 ND ND：未检出 3 3 结论结论 本实验中 GC 法和 GC-MS 法线性均良好，同一样品检测结果相近，GC-MS 法定量检出限比 GC法低 4 倍，更适于低浓度和假阳性样品，且本试验所建方法样品前处理简单，回收率和精密度好，适合饮料中香兰素和乙基香兰素的分析检测，同时对于开展其他液体类食品中香兰素和乙基香兰素检测具有参考价值。参考文献：参考文献：1 Goodner KL,Jella P,Rouseff RL.Determination of vanillin in orange,grapefruit,tangerine,lemon,and lime juices using GC-Olfactometry and GC-MS/MSJ.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2000,48(7):2882-2886.2 Ni YN,Zhang GW,Kokot S.Simultaneous spectrophotometric determination of maltol,ehyl maltol,vanillin and ethyl vanillin in foods by multivariate calibration and artificial neural networksJ.Food Chemistry,2005,89(3):465-473.3 Ohashi M,Omae H,Hashida M,et al.Determiantion of vanillin and related flavor compounds in cocoa drink by capillary electrophoresisJ.Journal of Chromatography A,2007,1138(1-2):262-267.4 邢晓平，崔钢.毛细管电泳安培检测法快速测定巧克力中的香兰素J,食品工业科技,2005,186-188.5 赵建芬，韦寿莲，陈金定.毛细管电泳法分离检测香兰素、香兰素醇、香兰素酸和阿魏酸J.食品科学,2012,33(24):289-292.6 Ma X Y.Determination of vanillin in infant formula using poly valine modified electrodeJ.International Journal of Electrochemical,2014,9(6):3181-3189.7 金海涛，马健瑜，王晓珣，等.高效液相色谱法同时测定香兰素和邻位香兰素J.分析测试学报,2011,30(2):222-224.8 刘祥萍，黄薇.高效液相色谱法同时测定食品中的甲基香兰素和乙基香兰素J.中华预防医学杂志,2006,40(4):296-297.9 Waliszewski KN,Pardio VT,Ovando SL.A simple and rapid HPLC technique for vanillin determination in alcohol 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