几种真菌的分离与鉴定.doc

常见真菌得分离与鉴定病原真菌得一般特性真菌(Fni)就是微生物中得一个大类,就是一群数目庞大得细胞生物,估计全世界已有记载得真菌有10万种以上、它们得子实体小者用显微镜才能见到,大者可达数十厘米,它们共同特征就是具有真正得细胞核,产生孢子与不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料,仅少数类群为单细胞,其她都有分支或不分支得丝状体,能进行有性或无性繁殖,具有纤维素(或其她葡聚糖)或几丁质得微纤维或两者兼有得细胞壁得有机体。对人类与动物致病得真菌大约100余种,属于病原真菌。一、基本性状(一)形态结构真菌分单细胞真菌与多细胞真菌两大类,前者属于酵母菌(yat)一般呈球形或卵圆形,后者称为霉菌(old)或丝状真菌,呈丝状分枝,菌丝交织象绒球状,另有一些真菌可因寄生环境及培养条件(养料、温度、氧气等)得不同可交替出现两种形态,即在室温中呈霉菌型,在3或体内呈单细胞得酵母型,这类真菌有双相性,所以称之为双态真菌或二相真菌、真菌得细胞结构与一般植物细胞相似,有定型得细胞核及完善得细胞器,但胞壁与细菌胞壁不同,不含粘肽而就是由角质及葡聚糖组成,也含有脂多糖蛋白质,其中酵母菌及类酵母菌皆以出芽增殖,不生长真菌丝,革兰氏染色呈阳性,丝状真菌分菌丝及孢子两部分,形态多种多样,分述如下。1.菌丝(Hypa) 真菌在合适得环境中,由孢子生出嫩芽,称为芽管。芽管逐渐延长呈丝状,称菌丝。菌丝继续生长并生长分枝,增殖得菌丝交织组成菌丝体。其中一部分菌丝深入被寄生得物体或培养基中吸取养料,称为营养菌丝体、另一部分菌丝向空间生长,称为气生菌丝体。气生菌丝体能产生孢子者称为生殖菌丝体。菌丝中各个细胞间有明显分隔者,称为有隔菌丝。主要见于病原性真菌。很多非病原真菌得菌丝无明显分隔,称为无隔菌丝。有些菌丝可呈各种特殊形式,如球拍状、破梳状、螺旋状、结节状、关节状、鹿角状、假菌丝、2.孢子 生成孢子就是真菌扩大繁殖得一种方式。真菌孢子得抵抗力、形态及作用等均与细菌芽胞不同,分为无性孢子及有性孢子两大类。不经过两性细胞得结合而形成得孢子叫无性孢子,这一繁殖过程称为无性繁殖。常见得无性孢子有5种:关节孢子、厚壁孢子、孢子囊孢子、芽孢与分生孢子、病原真菌属于不完全菌纲,很少产生有性孢子,大多数就是无性孢子。(1)厚壁孢子:当真菌在不利环境中,由菌丝内胞浆缩浓与胞壁增厚而成,呈圆形。当环境好转时可生成芽管成长为菌丝。(2)关节孢子:菌丝断裂形成长方形两端略钝圆得孢子叫关节孢子。如白地霉与粗球孢子菌。(3)孢子囊孢子:为鞭毛菌与接合菌得无性生殖形式。孢子囊中所含得孢子来源于分枝菌丝或胞囊梗顶端膨大形成孢子囊,囊内原生质浓缩集聚,割裂而成,一般数目较多,孢子囊形态多样,因种而异、(4)芽生孢子:由菌细胞出芽生成,见于念珠菌及隐球菌,前者(类酵母菌)出芽后孢子伸长呈丝状,但不见与母细胞分离,称为假菌丝,在假菌丝上得收缩点也可出芽成芽生孢子。(5)分生孢子:就是子囊菌与半知菌得无性孢子,也就是半知菌分类得主要依据,单细胞得分生孢子称小分生孢子,有蒂或无蒂,侧生或游离,分散或成群,圆形、梨形、卵圆形或其它形状,表面粗糙或光滑,或有或无各种纹饰。多细胞得分生孢子称大分生孢子,有纺锤形、棒形、球棍形、镰刀形及其它形状,两端尖或圆或一端圆,厚壁或薄壁,壁光滑或粗糙,有色或无色,分隔有多有少。(二)培养特性及繁殖方式.培养特性大多数真菌对营养要求不高,只需要水、盐,简单得氮源及碳水化合物就可生长,一般常用沙堡氏琼脂基(主要成分葡萄糖4%、蛋白胨1、琼脂)培养都能生长、但需要弱酸性(p 6)、较低孵育温度(28),充分温度与氧气供应才能生长良好。侵害内脏得某些真菌在37含血得培养基中生长良好、真菌生长都比较缓慢,大多需孵育数天后才成明显菌落,菌落有下列三种类型:()酵母型菌落:外观湿润稠软致密,类似一般细菌菌落,镜检只见有圆形或椭圆形生芽细胞(例如隐球菌得菌落)。(2)类酵母型菌落:外观性状似酵母型菌落,镜检除见有出芽得细胞外,尚可见到假菌丝(例如念珠菌得菌落)。(3)丝状型菌落:由多数分枝得菌丝体向上生长组成疏松得绒球状,表面有很多孢子,显示各种色泽,菌落可呈棉絮状绒球状 粉末状或石膏样,其正面与背面可显示各种不同色素,常作为鉴定菌种得参考。镜检可见有纵横交织得菌丝及各种孢子(例如各种癣菌得菌落)。2.繁殖方式 有多样性,包括出芽增殖,菌丝增长,菌丝分枝与断裂,产生无性孢子及有性孢子进行繁殖,因此它繁殖力很强,但生长速度较慢。(三)变异性与抵抗力真菌很容易发生变异,在人工培养基中多次移种或孵育过久,就可出现形态结构、菌落性状、色素以及各种生理性状(包括毒力)得改变,用不同得培养基与温度培养真菌,其性状也有改变,真菌对干燥阳光紫外线及一般化学消毒剂耐受性却较强。但对热得抵抗力却不强、60以上1小时即可杀死孢子及其菌丝,在3石炭酸、2。5碘酊、0。升汞及1%甲醛中可被灭活。用甲醛气体熏蒸被真菌污染得衣物用具,可杀灭真菌菌丝及其孢子。但真菌对一般抗菌素及磺胺药均不敏感。只对二性霉素、酮康唑、制霉菌素等非常敏感,治疗真菌感染常用此药。(四)致病性与免疫性、致病性 病原真菌得致病机制还就是一个未完全解决得问题;根据其侵害部位,主要分为下列两类:(1)浅部真菌病:主要由癣菌引起,大多为外源感染,常易侵害皮肤、指(趾)甲及须发等含角质得组织,引起癣症。(2)深部真菌病:可由各种真菌引起,包括类酵母菌、二相真菌及丝状菌、侵害粘膜、皮下组织、内脏及脑膜等处,有时扩散全身,主要就是内源性感染,也可由外源传染;前者就是因机体抵抗力降低,如患重病,长期使用免疫抑制剂,广谱抗菌素或放射治疗,患恶性病,严重烧伤等时,造成体内菌群失调,以致常居在体内得某些真菌(如白念珠菌),甚至平时不致病得环境中得真菌(如曲霉、毛霉)等也会乘机侵害,一些传染性较强得内脏真菌病就是内外源感染。2、免疫性 浅部真菌病一般在血中不产生特异性抗体,病后无免疫保护力,只就是儿童头癣等青春期后头皮皮脂增多时可以自愈,以后不再感染,其她部位癣症治愈后仍可再感染。深部真菌病虽可产生抗体,但无明显免疫保护作用。临床常见得病原性真菌一、 浅部真菌()皮肤癣菌皮肤癣菌又称皮肤丝状真菌,有下列三属(见表),都只侵犯体表角化组织(皮肤,毛发及指甲与趾甲)、不侵害深部组织,或内脏,皆属外源性传染,由接触患癣病人、动物(狗、猫、鼠、牛、马等)或染菌物体而感染。1.毛癣菌属红色毛癣菌(1)直接镜检:皮屑及甲屑,分枝分隔得菌丝有时可断裂或关节孢子状,毛发:发外型感染表现为发外孢子排列成串。少数为发内型感染孢子在发内排列成链状;毛发穿孔试验阴性。(2)培养特征:在葡萄糖蛋白胨琼脂,25,生长比较快,菌落形态有多种表现,镜检也不完全一样,常见有下列四种:I型:羊毛状:白色羊毛状菌丝充满斜面,典型得卷成筒状,边缘贴牢管壁,呈鲜红色,背面开始在中心有一红色小点,以后形成深红色环,最后成片为葡萄酒色,色素边缘划界非常明显。少数型菌株表现无红色色素,正面白色,背面呈淡黄色类似石膏I型,亦有正面白色而背面呈灰黑色。II型:绒毛状:粉红色绒毛状菌丝生长,占斜面/5,菌丝稀疏,透过菌丝可见粉红色得基底,背面颜色同I型相同、I型:粉未状:菌落表面稍有凸起,呈粉末状,粉红色,约占斜面得/22/3,背面同I型。IV型:沟纹状:菌落生长相对较慢,比以上三种类型为小,占斜面得1,菌落中央凸起,从中央向四周有排列比较整齐得放射状沟纹,边缘整齐,表面菌丝甚少。开始微带黄色,以后变粉红,背面同I型。(3)菌种鉴定:菌落特征及色素;大小分生孢子得形态;玉米粉吐温琼脂上产生红色色素;毛发穿孔试验阴性;尿素酶试验阴性。*须癣毛癣菌(1)直接镜检:皮屑内见分枝分隔得菌丝,甲屑内为关节状菌丝。毛发感染为发外型,发内有时有菌丝。(2)培养特性:在沙氏上生长较快,菌落形态可分为两大类:毛型与粉型;下列、I型为毛型,III、IV、V型属粉型、自炎症明显得皮损中所分离出得菌株多属粉型。毛型菌落外观均似红毛,应注意鉴别。具体分型羊毛状(I型),又称趾间毛癣菌,菌落生长快,白色羊毛状、气生菌丝较多且长,排列紧密,充满斜面,好象红毛,正面雪白,背面淡黄色。镜检见较细分枝,分隔得菌丝,胞浆浓。有少量球形或长形小分生孢子,无螺旋菌丝与大分生孢子、间或可见球拍菌丝及结节菌丝。绒毛型(II型),生长快,菌落雪白。表面有紧密得细短气生菌丝,中央可有乳头状突起,边缘如刀切,背面棕黄色或棕红色。镜检见较细得分枝、分隔得菌丝,小分生孢子多,有时成葡萄串状,无螺旋菌丝或大分生孢子;乳皮状(III型),开始为乳白色菌丝,不久一部分菌落变为粉末样,色微黄,光滑,似牛乳表面得一层薄膜,可一块块地挑取,中央有少许褶叠,边缘不整齐,背面淡黄或棕黄色。镜检见粗细不一,分枝分隔得菌丝与大量螺旋菌丝,间或可见破梳状菌丝,结节菌丝及球拍菌丝,大分生孢子少,棒状,两端圆,与分生孢子梗得连接处较窄,薄壁光滑,小分生孢子多,球形或长形,有时成葡萄串状排列。粉末状(IV型),菌落粉末状,表面平坦、光滑。间或有少数白色气生菌丝,中央有乳头状凸起,边缘锯齿状。菌落生长快,充满斜面,色黄或奶油色,外观像石小、背面棕黄或棕红色、颗粒状(V型):生长快,菌落粉样,表面不平,呈颗粒状、有不规则得褶叠或沟纹,边缘不整齐。下面色黄带红或棕黄。背面棕红色。IV、V镜检均见大量棒状大分生孢子及无数圆形得小分生孢子,少数长型。游离或葡萄状成串,有螺旋菌丝与球拍菌丝、(3)菌种鉴定:菌落形态;菌丝较细,就是皮肤癣菌中最细得一种;螺旋菌丝多见;大分生孢子得形态与球形小分生孢子;尿素酶阳性;毛发穿孔阳性。紫色毛癣菌()直接镜检:皮屑、甲屑内可见分枝分隔得菌丝或成串得孢子,病发取黑点部位得断发,毛发损害为发内型大孢子,呈关节型排列,充满整个发内,故毛发出皮即断。(2)培养特性:在沙氏琼脂培养基室温培养菌落生长慢,开始为圆形、白色、潮湿发亮得菌落,类似酵母;以后中央褶叠或突起,产生紫色色素,并逐渐扩大,或中央紫色,边缘淡红色,最外围有一圈白色得环。培养基颜色不变,边缘无放射状菌丝,整齐如刀切,下沉不明显,背面无色至深紫色,少数菌株无颜色,呈无色紫色毛癣菌,镜检见粗细不一得菌丝,分隔较密,胞浆淡,有很多不规则得突起与肿胀,但无鹿角菌丝。厚壁孢子多,多为间生,偶见小分生孢子2个大生分生孢子。 (3)菌种鉴定:菌落形态,紫色色素;VtB能促进菌落生长,形成大分生孢子;发内型感染。2。小孢子菌属羊毛状小孢子菌(1)直接镜检:皮屑内见分枝、分隔得菌丝,病发为发外型感染。(2)培养特性:在沙氏琼脂培养基上室温生长快、开始为黄色绒毛样生长,2周后菌丝较多,呈羊毛状,可充满大部分斜面。中央趋向粉未化、正面桔黄,背面红棕色,平皿中培养得菌落表面中央可有少数同心园,无放射状沟纹。生长约4-5周后开始变异,菌丝增多,大分生孢子减少或消失。镜检见大量纺锤形,厚壁得大分生孢子、一端稍弯曲,末端有帽样肥大,有615个分隔。小分生孢子较少,长形,无柄侧生、可有球拍状菌丝,破梳状菌丝,结节菌丝及大量厚壁孢子等。 (3)菌种鉴定:菌落形态及色素,在PDA培养基上能产生黄色色素;特征性得厚壁、顶端膨大微弯曲,如戴帽得大分生孢子;发外孢子型感染。石膏样小孢子菌()直接镜检:皮屑内见菌丝或成串得孢子,病发为发外型感染,孢子较大,排列成串。(2)培养特性:在沙氏琼脂培养基上室温生长快,开始为白色菌丝,后成棕黄色粉未状菌落,凝结成片,菌落中心有隆起,外围有少数极短得沟纹,边缘不整齐,背面红棕色、镜检:见多数较小,纺锤形,4个得大分生孢子,壁厚m,两端园,壁有刺,菌丝较少,小分生孢子棒状无柄,有时可见球拍状菌丝,螺旋,破梳状菌丝及结节菌丝。(3)菌种鉴定:菌落形态;大分生孢子得形态;毛发穿孔试验阳性、3.表皮癣菌属絮状表皮癣菌(1)直接镜检:皮屑及甲屑内见分枝分隔得菌丝。(2)培养特性:在沙氏培养基室温生长快。菌落开始蜡状,高出斜面,表面有不规则得褶叠,上覆粉未样菌丝,黄绿色、较大得菌落中央有褶叠,外围可见放射状沟纹,最外围有不整齐得平滑圈。菌落下沉明显,培养基常为之开裂。背面黄至棕色。镜检:见典型得杵状大分生孢子,24个分隔。游离端圆形,薄壁光滑,基部平截、常24个成群,无小分生孢子,老龄菌落厚壁孢子多,菌丝较细,分枝,分隔,间或可见球拍,结节与螺旋菌丝。()菌种鉴定:菌落特征;典型杵状大分生孢子;无小分生孢子。二、深部真菌(一)白念珠菌:(Candid albian).标本来源 痰、大便、口腔或阴道分泌物、尿、脑脊液、胸水、脓液、皮屑及痂皮等。.直接镜检氢氧化钾涂片,可见卵圆形、圆形芽孢,薄壁,直径约24m芽孢,椭圆形芽孢得芽管延长形成假菌丝,有时在菌丝旁附着芽孢,S染色为红色、3、培养及镜检(1)葡萄糖蛋白胨琼脂:30划线培养一天即有光滑小菌落生长,菌落为奶油色,闪光或呈蜡状,柔软光滑,老得菌落渐变硬,表面有皱褶或有毛发状突起。镜检,在菌丝交接处有群集得卵圆形孢子或在菌丝旁侧有少许芽孢,。06.3.1.5。(2)玉米培养基:菌落外观同上,镜检:菌丝很少分枝,有少量芽生孢子,在菌丝得顶端或侧缘有厚壁孢子,直径17。(3)快速鉴定与鉴定程序:将标本直接接种在科玛嘉上,2小时出现翠绿色菌落,将初代分离得酵母样菌接种在含1吐温80米粉中,25室温中2448小时,镜检可见顶端产生圆形厚壁孢子或接种于0.ml,正常人血清或羊血清中,置37温箱中,经12小时镜检有芽生孢子及芽管形成,可初步鉴定为白念珠菌。AI酵母快速鉴定:同化试验结果:葡萄糖+,麦芽糖,乳糖-,半乳糖+。(二)热带念珠菌(Cida Tropialis)1.标本来源:同白念珠菌、2.直接镜检:同白念珠菌、3.培养及镜检:(1)葡萄糖蛋白胨琼脂,在25中培养,菌落平滑有光泽,白色,时间较久表面有皱纹,粘稠,甚至有毛样外观,镜检可见卵圆形细胞或球形细胞(约912)。()玉米琼脂:产生丰富得假菌丝及发育良好芽生孢子,但无厚壁孢子生长。(3)快速鉴定:科玛嘉培养基上,24小时出现蓝灰色。同化试验、(三)克柔氏念珠菌(CanddaKrui)标本来源:同白念珠菌。直接镜检:同白念珠菌。培养及镜检:葡萄糖蛋白胨琼脂:菌落扁平,平滑、干燥,有时表面有皱折,通常就是乳白色到淡黄,镜检所见:大多数孢子就是较大得柱状,2、55。5m。51。5m,亦有少数短卵圆形孢子。假菌丝丰富,芽生孢子在菌丝上轮生。玉米琼脂:对称分枝得菌丝,芽生孢子较少,无厚壁孢子、葡萄糖蛋白胨液培养基:在培养基表面生长,与试管壁粘连、快速鉴定:科玛嘉培养基上4小时出现淡粉红色菌落。同化试验。(四)近平滑念珠菌(andida prpsilis)标本来源:同白念珠菌。直接镜检:同白念珠菌。培养及镜检:葡萄糖蛋白胨琼脂:乳酪样菌落,通常表面光滑,亦有菌落表面粗糙及皱折。镜检所见:卵圆形芽生孢子.55。048m,假菌丝形成丰富。玉米琼脂:交叉分枝菌丝,侧生芽生孢子较多,无厚壁孢子。葡萄糖蛋白胨液基:无表面生长,在管底生长、快速鉴定: 科玛嘉培养上24小时出现粉色光滑菌落。同化试验:AP。(五)光滑念珠菌(Candidaglaa)标本来源:痰、尿、血、皮肤、阴道、伤口、腹水、胸水、胆汁等。直接镜检:卵圆形芽生孢子,直径27m或更大,单芽,位于孢子得细端,无荚膜,无子囊或菌丝。培养及镜检:葡萄糖蛋白胨琼:白色或奶油色乳酪样菌落,日久变棕灰色,表面平滑,稍有光泽,本菌只在酸性条件下生长,Hg;6、5即不生长,镜检:同直接涂片、快速鉴定: 科玛嘉培养基上24小时出现紫色菌落、 同化:AP试验。(六)胶红酵母(Rhodoou muclinosa)标本来源:痰、尿、血、大便、皮肤、CF、咽喉、体液等、直接镜检:圆形或卵圆形,3m直径,有荚膜得芽生孢子,单芽生,孢子内有少数颗粒,无菌丝,不着色。培养及镜检:葡萄糖蛋白胨琼脂:2或7时,生长迅速,菌落10天内可达22。5cm直径,为乳酪样生长,边缘整齐,表面光滑,但无光泽,桔红,日久颜色逐渐消退,呈淡黄色或桔黄色,培养基不变色,镜检同涂片所见,有时可见假菌丝,无子囊、快速鉴定: 菌落产生红色色素; 使尿素琼脂由黄变红。(七)新生隐球菌(Cryptoocus neformans)标本来源:脑脊液、痰、脓、尿、粪、血、活体组织及尸体解剖材料等、直接镜检:墨汁染色,可见圆形厚壁孢子,菌体直径约40m,外围有一透光得厚荚膜,厚度约57m,荚膜内得菌体可出芽或不出芽,孢内有一较大得反光颗粒(脂质颗粒,不就是孢核)与许多小颗粒,可与白细胞或淋巴细胞相鉴别。培养及镜检:在葡萄蛋白胨琼脂,2或37培养时,2天即生长出乳白色细菌粘液性菌落,呈不规则圆形,表面有蜡样光泽,以后菌落增厚,颜色由乳白、奶油转桔黄色。非致病性隐球菌37不生长、镜检类似直接镜检,可见圆形孢子,直径2。8m,多数有芽,孢子外围有荚膜,但荚膜开始甚狭,日久渐增厚,无真菌丝及子囊孢子,但可有芽管、快速鉴定:7生长;尿素酶变红;咖啡酸变棕色;同化试验,不发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖等。三、其它实验室常见得丝状真菌(一)曲霉属:标本来源:皮屑,甲屑,耵聍,痰,粪,尿,脓液,活检与尸检组织标本、直接镜检:涂片见分枝,分隔得菌丝及足细胞,与外界相通腔道内标本中有时可见分生孢子头,为曲霉得特征结构、培养:初代用沙氏培养基,次代用察氏DA培养基,接种后室温培养2周。少数能产生闭囊壳得曲霉需培养3周或更长时间。菌种鉴定:(1)菌落,菌落生长速度,表面质地,颜色,形态与气味等,其中颜色得特征较稳定,就是曲霉分类得主要依据之一;(2)分生孢子头:分生孢子头得形态,颜色与大小。分生孢子头由顶囊、瓶梗、梗基与分生孢子链组成,就是曲霉得特征性结构、(3)分生孢子梗或分生孢子柄,注意它得长短,颜色,表面粗糙或光滑,就是否有隔等、(4)分生孢子梗上得顶囊,注意顶囊得大小,形态,颜色,梗占据顶囊表面积得大小等。()瓶梗及梗基:统称小梗,注意单层还就是双层,有些既有单层又有双层,甚至同一顶囊上也两者兼有。(6)分生孢子:形态,大小,颜色,表面就是否光滑及有无纹饰。()具有性生殖得曲霉能产生闭囊壳。()部分曲霉能产生壳细胞,足细胞。(9)有些能产生菌核。致病得曲霉有烟曲霉,黄曲霉,黑曲霉,土曲霉,构巢曲霉,棒曲霉,杂色曲霉,米曲霉等等、(二)青霉属:标本来源:皮屑,甲屑,耵聍,痰,粪,尿,脓液,活检与尸检组织标本。直接镜检:可见分枝、分隔得菌丝,无顶囊,偶可发现帚状枝。培养:初代培养用沙氏培养基,次代培养用察氏或麦芽汁培养基。菌种鉴定:(1)菌落特征:菌落形态包括生长速度、菌丝高度、颜色、渗出物、气味与质地。质地包括绒状絮状束状、(2)菌丝得粗细、颜色、埋伏型,部分埋伏型或部分气生型。()分生孢子梗分枝或不分枝,就是自气生菌丝亦成从埋伏菌丝上长出。单根或成束,壁光滑或粗糙。(4)帚状枝:为青霉属得特征性结构,指分生孢子梗分枝处毛瓶梗得整个扫帚状结构。不包括分生孢子。帚状枝得形状有4种:单轮青霉组;对称双轮青霉组;不对称组;对称多轮组。(5)瓶梗:帚状枝得最后一级分枝即产孢细胞,大致分3种类型: 柱形;披针形;瓶形。(6)副枝:支持梗基得细胞称副枝,可有一个或一个以上。(7)分生孢子:大小、颜色、形状、表面就是否光滑或粗糙、(8)菌核:闭囊壳。致病青霉有:产黄青霉、桔青霉、淡紫青霉、灰绿青霉、马尔尼菲青霉等。小结真菌特征就是具有真正得细胞核,产生孢子与不含叶绿素,以寄生或腐生等方式吸取养料;不同病原菌可通过培养、镜检、菌种鉴定上各有不同特征,可以进行分离与鉴定。