简述核酸疫苗制备过程.doc

简述核酸疫苗制备过程核酸疫苗又称基因疫苗，就是指将编码某种抗原蛋白得外源直接导入动物细胞，在宿主细胞中表达并合成抗原蛋白，并激起机体一系列类似于疫苗接种得免疫应答；起到预防与治疗疾病得目得。自190年Wolff等人意外发现核酸疫苗后,其相关得研究得到了广泛得重视,并得以迅速发展，誉为“第三次疫苗革命”。本文就核酸疫苗得构建、特性、免疫机制、接种方式、影响因素、研究现状与前景作一综述.一 核酸疫苗得构建 核酸疫苗就是由编码病原体抗原得基因与作为真核细胞表达载体得质粒DA组成。病原体抗原得编码基因可以就是一组相关基因或单一病原体免疫保护性抗原基因，也可以就是编码抗原决定簇得一段DN序列,其表达产物应就是病原体得有效成分，可以引发保护性免疫。用于构建核酸疫苗得载体质粒多以pU或B22质粒为基本骨架，主要包括启动子、增强子与3端多聚A。巨细胞病毒(CMV)启动子与ROU肉瘤病毒（RSV)得启动子都可在哺乳类细胞内表达。另外也有人采用来自哺乳动物与禽类得启动子。Fnan等199年将编码流感病毒血凝素H或H7得CNA片段插入CMV质粒得转录调控元件得下游，构建了抗流感病毒得核酸疫苗,另外,乙型肝炎病毒、人免疫缺陷综合症病毒、脑膜炎病毒等基因均被成功地克隆到含V启动子得真核表达载体上，并表现了免疫活性. 用于构建核酸疫苗得病毒载体包括流感病毒载体、腺病毒载体、腺病毒相关载体、脊髓灰质炎病毒等。994年CstrucciMR6把可以引起保护性免疫反应得致死性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒(LCMV ）得表位基因片段克隆到流感病毒（H11）得基因组中制备核酸疫苗，免疫小鼠后,可使小鼠抵抗致死性淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒得攻击,其免疫效果可维持个月以上。二核酸疫苗得特点与传统得灭活疫苗、弱毒疫苗与基因工程疫苗相比,核酸疫苗具有如下特点:(1）免疫效果好,基因疫苗能在宿主细胞中产生外源性蛋白,此种蛋白比原核生物表达系统中产生得蛋白更象天然分子,其抗原识别递呈过程与自然感染十分相似，从而引起几乎等同于感染这些病原体或弱毒疫苗免疫后所产生得免疫应答，并且避免了基因重组技术在体外合成得蛋白质抗原表位丢失或改变。（2）利用一种表达载体同时表达多种蛋白,诱导机体产生针对多种病原体得免疫应答，从而起到一次注射核酸疫苗同时预防与治疗多种疾病得效果,并可抵抗某些变异病原体得侵袭(3）核酸疫苗接种后，蛋白质抗原在宿主细胞内，可直接与C I类与HC I类分子结合,引起广泛得细胞免疫与体液免疫，但无毒力返祖得危险(4）安全性好，由于核酸疫苗一般采用表达载体在动物细胞体内进行抗原表达，不与宿主染色体DNA整合，但能在宿主体内表达，与病毒活疫苗相比,避免了病毒本身存在得复毒与病毒基因组整合到宿主染色体得危险（5）核酸疫苗具有共同得理化特性，可在同一载体上构建表达多种抗原,生产多价疫苗或同时注射2种以上得核酸疫苗来进行联合免疫(6）制备简单，利用成熟得基因重组技术,将克隆得目得基因DN直接接种,避免了表达载体得构建，表达产物得提取等繁琐过程（）由于核酸疫苗作为重组质粒，能在工程菌内快速大量增殖，且提取方法简便,可使生产成本降低,并能加工干燥，便于储藏与运输。三 核酸疫苗免疫机理对核酸疫苗免疫机理说法不一，大多数学者认为，其致病机理在于她模拟了病毒得自然感染过程.DA质粒在注射部位被肌细胞吸收摄取后,通过所含得启动子与增强子系统调节合成所编码得蛋白质，合成得蛋白质被细胞内蛋白酶复合体降解成含病毒抗原表位得肽段，进入内质网与合成MCI类分子结合，然后被转运系统递呈到细胞膜表面，此复合体共同激活CD8，部分被分泌或释放入血得蛋白质,激活特异性B细胞，从而产生保护性抗体;另外,分泌得蛋白质被巨噬细胞或树突状细胞等专职抗原递呈细胞俘获，被加工成肽段,进入溶酶体内体区与MH I类分子结合，激活受MHC II类分子限制得CTh细胞,被激活得h细胞分泌IFN、I2等细胞因子,进一步促进与强化体液免疫与细胞免疫.另外,试验证明质粒上得氨苄青霉素抗性选择基因中得回文结构5AGT3能够使单核细胞产生白细胞介素-2，刺激细胞分泌干扰素,增强N细胞得活性，称为“单链免疫刺激DNA序列”起到佐剂得作用.四 核酸疫苗得接种方式核酸疫苗可以通过多种方式、途径接种到机体得适当部位,不同得接种方式或途径可影响其免疫效果。接种途径依启动子得来源而有所区别，用动物病毒与一般哺乳动物启动子构建得A疫苗一般用生理盐水稀释质粒DN肌肉注射法,如股四头肌与腓肠肌等骨骼肌因为其特殊结构如肌浆网、横向微管系统，适合于摄取与表达DNA,兼之其注射方便，因而常被选为接种组织,也可选择肌肉皮下、腹腔内、静脉内接种.而用来自乳腺得乳清酸蛋白(WP)启动子构建得疫苗在乳腺与皮下脂肪接种效果更好;也有鼻腔内滴鼻法进行黏膜吸附免疫接种。第二种方法就是用高速度来提高疫苗NA对组织得转染率与表达效率,一般用特殊工具基因枪接种，基因枪能将包裹在金粒上得质粒D直接注射进表皮细胞。用基因枪接种比直接注射核酸疫苗得免疫效果好606倍。用基因枪接种只需0、40、004纯化DA，而肌肉注射需10200g得核酸疫苗，才能获得很明显得免疫效果。Fan等人进行了不同方式接种流感病毒核酸疫苗免疫效力得研究证明上述二者得接种效果均高于静脉、鼻腔、真皮、皮下等其它接种方式,但不同宿主细胞所产生得免疫接种效果并不完全一致。第三种方法就是将组织预先用药物如丁哌卡因、心肌毒素与高渗蔗糖等处理,增加组织细胞对疫苗DN得摄取与表达能力,称为“药物协助法”。另有人将疫苗DNA与粒细胞、巨噬集落刺激因子表达载体或一些细胞因子等一起或分别注射均能明显得提高疫苗免疫效率。还有用腺病毒介导或脂质体介导注射方法得报道，但存在潜在癌基因激活及缺乏细胞得导向性等缺点。五 核酸疫苗免疫效果得影响因素（1)表达载体对核酸疫苗得影响 表达载体对核酸疫苗得效力有很大得影响，表达载体主要以pUC与pBR322质粒为基本骨架，含NA复制起始点、抗生素抗性基因、启动子、增强子与3多聚终止信号等结构,能在大肠杆菌中稳定地复制,但不能在哺乳动物细胞中复制。其中控制外源基因表达得启动子对载体得影响最大。启动子因来源不同有组织特异性，并且在各种组织中起始mNA合成得效能也不同.基因疫苗中常用得来自病毒得启动子包括猴病毒4（S4）早期启动子、巨细胞病毒(CMV）早期启动子及罗斯肉瘤病毒()启动子等,这些启动子得组织特异性较广，在许多组织细胞中能较好地表 达外源基因，且在肌肉组织中得表达效率最高。Davs等曾将HSAG基因分别克隆到含CMV与R启动子得质粒载体上，注射实验动物后,发现含CV启动子得质粒诱导得免疫反应明显强于后者.现在大多采用CMV启动子。也有人用来自哺乳动物与禽类得启动子如人-肌动蛋白启动子、乳清酸蛋白（A)启动子、绵羊金属硫蛋白启动子与鸡-肌动蛋白启动子2021等构建基因疫苗。这些启动子在肌肉内都有较好得转录活性,而WAP启动子则在乳腺与皮下脂肪表达效率最高。另外，ano等22报告，共价闭环型得质粒RVL DNA得表达效率远高于线性质粒pRSVLDN。(2) DN输入组织得方式NA输入组织可以用注射、脂质体包裹后注射、基因枪轰击、口服等.其免疫效果因注射速度、导入速度、免疫剂量、接种部位、及宿主细胞不同而各有差异。另外肌肉注射前用蛇毒、心肌毒素、高渗蔗糖（5/，用PB溶解）、丁哌卡因等预处理，可显著提高外源基因得表达.(3) 佐剂；Arom、Q、细胞因子如IL2等均可改变或提高核酸疫苗得免疫效力. (4) 机体免疫反应：由于核酸疫苗导入体内加工后表达既可激活CD+TL细胞,引起细胞免疫，表现出外周血淋巴细胞增殖反应增强、白细胞介素2、干扰素分泌增加、细胞毒T淋巴细胞反应增强等表现。又能通过分泌抗原表达,激活TH细胞或直接激活B淋巴细胞产生抗体,故笔者认为机体免疫机能状态也就是影响其免疫效力得主要原因之一。六 核酸疫苗得研究现状及应用前景自从9年核酸疫苗诞生之日起，学者们先后将一些不同病原体抗原基因得质粒DN克隆到适宜得真核表达载体中，并接种于相应得动物体内，引发了特异性得免疫应答,对野毒株得攻击具有保护作用，以达到预防与治疗疾病得目得。目前,许多种细菌、病毒、寄生虫得核酸疫苗得到了广泛得应用,并取得了良好得临床保护效果. Umer等（1993)首先报道将流感病毒高度保守得核蛋白(NP）得DNA克隆于质粒载体中,构建成表达P得核酸疫苗,取适量注入小鼠得股四头肌，诱导出抗NP得特异性gG抗体与CL应答。由于保护性抗原基因非常保守，故免疫小鼠即可抗同株流感病毒攻击,又可抵抗异株流感病毒攻击。爱滋病自本世纪80年代初发现以来,呈逐年成倍增长得趋势，其高度得致死性与惊人得蔓延速度令人“谈艾色变”，因此在世界范围内急需一种安全有效得HIV疫苗问世。HV中与抗原gp12V3区序列存在一高度同源共有序列，以此作疫苗研制得靶抗原可能会扩大疫苗得免疫保护范围。目前有关HIV外壳糖蛋白得基因重组疫苗、合成肽疫苗、重组病毒活载体苗正在积极研制中,但仍未取得另人满意得得结果。1993年美国得WANG等率先应用NA疫苗技术将编码HIV包膜糖蛋白基因cDNA重组质粒pM160接种小鼠，产生了抗HIV-1包膜糖蛋白得特异性抗体，此抗体能中与V1对体外培养细胞得感染,抑制HIV1介导得体外培养细胞得合胞体得形成；并且还观察到了特异性得细胞增殖现象;同时她们通过小鼠、猴体内进一步实验发现，若在DNA注射前对局部肌肉用药物预处理能明显提高了动物机体 对IV1包膜糖蛋白得免疫应答能力，并检测到了特异得CTL应答。1994年avs等分别将乙型肝炎表面抗原基因插入到了带C启动子得质粒构建了DNA疫苗，并肌肉注射小鼠体内，证明可在体内产生类似于病毒感染得细胞与体液免疫应答。Dais等研究人员证明注射部位药物预处理后，可产生更强大得免疫效力。同时证明使用无针生物注射器（Bionctor)可将重组疫苗导入肌肉组织中，也能诱导对HB得体液免疫反应。国内亦有对HV核酸疫苗研究得报道。此外，针对人类病原微生物得核酸疫苗还包括HV28狂犬病病毒1单纯疱疹病毒结核病多种寄生虫CMV5等。我们也构建了编码猪冠状病毒(TGV）得主要抗原位点与完整刺突 (pike, S） 基因得真核表达质粒,并检测到了体内与体外得表达。七核酸疫苗得安全性问题核酸疫苗得性质介于传代细胞系生产得生物治疗剂与基因产品之间。由外源基因导入引起得内源性致癌基因得插入性激活与抑癌基因插入性激活得可能性往往被忽略，但核酸疫苗本质主要为外源A,并且目前构建得D载体来瞧，大都含有某些致癌病毒得DA序列,如CV、RSV得启动子序列。虽然通过对1800余中核酸疫苗得检查没有发现导入基因与宿主染色体DNA整合得证据,但核酸疫苗在应用于人体之前，这个问题须明确解决。目前对于抗A抗体得产生有两种假设：1就是由B淋巴细胞增生产生2由抗原DNA引起B淋巴细胞活化与选择产生,而抗N抗体得出现必然会诱发新得疾病。核酸疫苗注射机体后可长期在体内表达外源抗原，一方面,核酸疫苗表达得抗原在新环境中可能诱导不适当得免疫应答，甚至在长期表达状态下诱导免疫耐受；另一方面,如果免疫应答过程中有可能出现过度刺激并产生交叉免疫反应性，后者在严重情况下导致自身免疫病得产生亦可发生超敏反应。尽管这些推测尚属假设,但仍具有可能性,一旦出现上述情况,很难逆转，必须予以重视。现阶段疫苗得研制开发正处于探索阶段，各实验室所用得动物、表达载体、基因片段、免疫途径等尚无统一标准，导致实验结果差异较大，安全性不能得到充分保证,因此有必要根据不同病原体等实际情况制定一套规范得准则,使核酸疫苗得制备与应用有规可循,从而最大限度地保证其安全性。人用核酸疫苗在应用人体实验前、中、后过程中，要使受试者充分认识核酸疫苗得优点与其存在得问题，包括近期与远期得潜在可能危险性,并做定期得包括肿瘤、 抗DNA抗体、自身免疫疾病等方面得检查,尽可能地做到使受试者放心。而在目前兽类传染病核酸疫苗得研制明显落后于人类传染病核酸疫苗研制得前提下,核酸疫苗技术应该引起兽医工作者更广泛得关注，并致力与兽类传染病核酸疫苗得研究。另外，由于非种畜禽生产周期短、不需要考虑伦理问题等特点,使得兽类传染病核酸疫苗比人类传染病核酸疫苗得推广应用可能更为容易。