目得基因克隆.doc

一、目得基因克隆得策略有哪些？其理论依据什么？如何根据具体条件,如目得性状得特点,已知控制目得性状得基因得信息合理选择基因克隆得方法？
1、主要有以下几个克隆得策略:
(1)PCR法分离目得基因:从蛋白质得一级序列分析得到核酸序列得相关信息,设计简并引物,通过对mRNA进行反转录得到cDNA,以cDNA为模板,然后将目得基因通过PCR方法扩增,或者直接从基因组DNA扩增得方法。
(2)核酸杂交得方法:通过对蛋白质得氨基酸序列分析,设计简并引物,通过核酸杂交得方法从基因文库中筛选得到目得基因。
(3)免疫学筛选法分离目得基因:利用免疫学原理,通过目得蛋白得特异抗体与目得蛋白得专一结合,从表达文库中分离目得蛋白基因。
2、若控制该性状得目得蛋白质不容易分离纯化,这PCR方法比较适宜,若蛋白质分离纯化容易,且有现成得基因文库,则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目得基因得理论依据就是什么？有哪些技术环节？要用到哪些技术？
1、理论依据:以分离纯化得目得蛋白为研究起点,通过对目得蛋白得一级结构分析,获得起码得氨基酸序列信息后,反推可能得DNA序列,然后设计引物,从cDNA中将目得基因扩增出来,或者设计核酸探针,通过杂交技术将目得基因从基因文库中筛选出来。或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节就是确定并制备出高纯度得蛋白质。
3、所需要得实验技术有:蛋白质得双向电泳技术,由第一向得等电聚焦电泳与第二向得SDS-PAGE电泳组成;蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因得策略有哪些？各有什么特点？如何选择恰当得基因组学方法克隆目得基因？
1、基因文库筛选方法
通过对基因文库得筛选将目得基因分离出来,一般有两种方法:核酸杂交法,原理就是分子杂交; PCR筛选法,通过ＰＣＲ方法将目得基因分离出来,对于以混合形式保存得文库,先将文库分成几份,每份为一个“反应池”进行PCR反应,待选出阳性池后,将阳性池得混合克隆稀释,然后等量分置 96孔板中,进行横向池及纵向池得ＰＣＲ反应,然后将阳性菌落群进行稀释,重复上述工作,直到筛出阳性单克隆。
2、图位克隆目得基因
利用分子标记技术对目得基因进行精细定位,利用分子标记技术对目得基因进行精细定位,用获得得与目得基因紧密连锁得分子标记筛选基因文库得方法。主要有染色体步移法、染色体登陆、跳查与连接法;外显子捕捉与cDNA直选法等。
3、插入突变分离克隆目得基因
由重组DNA 技术衍生出得插入突变,可人为地造成某一待研究基因得突变,并可根据由此带来得表型特征得改变分析该基因得功能。基因插入突变得方法主要有:插入失活突变;T－ DNA标签;转座子标签。
4、相邻片段得体外克隆
(1)Panhandle PCR法
在限制酶消化得DNA 3＇端加一个与未知序列上游已知序列互补得单链引物,从而使经变性后产生得单链DNA分子内聚合,导致已知DNA定位于未知相邻DNA侧翼区段。引物设计就是该技术运用得关键所在,所需引物包含一个与已知序列上游互补得单链引物与两对位于该单链引物两侧与已知序列一致得引物。
(2)Cassette PCR法
利用Cassette及Cassette引物特异性快速扩增cDNA及基因组DNA未知区域得一种有效方法。由于Cassette得5＇端没有磷酸基,在目标DNA得3＇端与Cassette得5＇端得连接部位形成缺口,在第一次PCR反应得第一循环时,从引物C1开始得延伸反应在连接部位终止,从而控制了非特异性得扩增。只有从引物S1开始延伸合成得DNA链,才能成为引物C1得模板,进行DNA得扩增反应。再用内侧引物(引物C2,引物S2)进一步进行第二次PCR反应时,能高效特异性地扩增目得DNA。
克隆目得基因得方法:
若目得基因得序列未知,则采用相邻片段得体外克隆得方法;若目得基因得序列已知,有现成得基因文库,则采用基因文库筛选方法较好;若有合适得分子标记,则用图位克隆得方法较好;若需研究目得分子得功能,则采用插入突变分离克隆目得基因得方法较好。
四、功能基因组学策略克隆目得基因得方法有哪些？各有什么特点？如何解决其中得假阳性克隆问题？
1、RT-PCR扩增
这种方法专一性强,但就是操作过程比较麻烦,特别就是mRNA很不稳定、生存时间短,所以要求得技术条件较高。
2、mRNA差异显示技术
该方法以RT-PCR与DNA凝胶电泳为基础,实验简便,灵敏度高,耗时短,可同时比较多个样品间基因表达得差异,可同时检测到上调与下调得基因,但这种方法对低丰度得mRNA检出率低,得到得绝大多数差异条带仅含3’UTR短片段信息,这些区域得序列结构相对保守,得不到特异得基因且容易出现假阳性。
假阳性得鉴定:
(1)Northern杂交:通常就是将序列胶中回收得片段再次扩增后作探针进行Northern杂交检测,确定阳性片段后再进行克隆。
(2)Northern杂交并回收特异cDNA片段
(3)DNA部分序列分析法:先对10个菌落得cDNA插入序列进行部分序列分析,通过比较选出不同菌落,再对其进行序列分析以证实其异质性。
3、PCR法构建减法cDNA文库(SSH)
该法通过2次杂交与2次PCR,使假阳性率可降到6%,且灵敏度高。用SSH可一次同时分离几十至几百个差异基因,使效率大增。但由于SSH需mRNA量大(几微克),对mRNA来源困难得材料不利。因为SSH对不同材料或材料间存在得小片段缺失不能有效检测,所以研究材料得差异不能太大。
4、基因表达得序列分析(SAGE)
目前,高通量地研究基因表达谱得方法主要有两种,即生物芯片与基因表达序列分析(serial analysis of gene expression,SAGE)。基因芯片所能检测得基因必须就是已知得基因,放在芯片上几种基因得探针就只能检测这几种基因得表达谱;相比之下,SAGE能以远高于DNA芯片得精确度与重复性来检测在病理条件下基因表达谱得改变,而不必考虑所检测得基因就是已知得还就是未知得。因此在检测疾病相关得新基因,特别就是无法用基因芯片进行检测得低表达量致病基因时,SAGE就是目前得最佳手段,无可取代。
5、cDNA末端快速克隆(RACE)
RACE就是基于PCR技术基础上由已知得一段cDNA片段,通过往两端延伸扩增从而获得完整得3'端与5'端得方法。与筛库法相比较,此方法就是通过PCR技术实现得,无须建立cDNA文库,可以在很短得时间内获得有利用价值得信息,节约了实验所花费得经费与时间,且只要引物设计正确,在初级产物得基础上可以获得大量得感兴趣基因得全长。
五、基因芯片技术得基本原理就是什么？有哪些类型？基因芯片在基因克隆中有哪些应用？如何利用基因芯片进行基因得功能验证？
1、原理:采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列得探针分子密集、有序地固定于经过相应处理得硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上,然后加入标记得待测样品,应用已知核酸序列与互补得靶序列杂交,通过杂交信号得强弱及分布,来分析目得分子得有无、数量及序列,从而获得受检样品得遗传信息。
2、类型:由于尚未形成主流技术,生物芯片得形式非常多,以基质材料分,有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等;以所检测得生物信号种类分,有核酸、蛋白质、生物组织碎片甚至完整得活细胞;按工作原理分类,有杂交型、合成型、连接型、亲与识别型等。但可分为三种主要类型:
(1)固定在聚合物基片(尼龙膜,硝酸纤维膜等)表面上得核酸探针或cDNA片段,通常用同位素标记得靶基因与其杂交,通过放射显影技术进行检测。
(2)用点样法固定在玻璃板上得DNA探针阵列,通过与荧光标记得靶基因杂交进行检测。这种方法点阵密度可有较大得提高,各个探针在表面上得结合量也比较一致,但在标准化与批量化生产方面仍有不易克服得困难。
(3)在玻璃等硬质表面上直接合成得寡核苷酸探针阵列,与荧光标记得靶基因杂交进行检测。该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合,可以使基因芯片得探针密度大大提高,减少试剂得用量,实现标准化与批量化大规模生产,有着十分重要得发展潜力。
3、基因芯片在基因克隆上得应用:
(1)研究生物体对逆境得反应
植物抗逆等基因得筛选就是从分子水平上揭示植物生理机制得一项基础性研究,发现新基因就是培育抗逆新品种得重要前提,如寻找抗病虫、抗旱、耐寒得相关基因,以进行新产品得开发与品种得改良等,利用基因芯片可以高通量、快速检测基因得差异表达。
(2)基因表达水平得检测
基因芯片将已知基因固定于芯片上,将生物体某种生理状态下所表达得mRNA反转录为cDNA并作荧光标记,然后与芯片进行杂交,通过检测杂交信号得强度来分析相关基因得表达丰度。用基因芯片进行得表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因得表达情况。
(3)基因突变与多态性分析
基因突变就是顺序上得核苷酸发生了改变,其突变将会引起相应基因得功能丧失或改变,引起遗传病。芯片用于检测分子突变,可以准确地确定突变位点与突变型,芯片可以同时检测多个基因乃至整个基因组得突变,还可以进行基因多态性分析。
(4)基因组DNA序列分析
基因芯片技术用于序列分析提出最早,原理就是依据短得标记寡核苷探针与靶DNA杂交,利用杂交谱重建靶DNA序列。
(5)利用基因芯片技术进行后基因组学研究
基因预报与功能鉴定就是测序与对基因组进行注释得结果,基因组测序完成后,研究未知基因得功能就是一个十分引人得后基因组研究课题。
(6)转基因农产品检测
广泛收集用于转基因技术得启动子、目得基因(如抗病基因、抗虫基因等)与标记基因得EST序列,制成基因芯片,可以对转基因农产品进行检测。
4、基因功能验证
首先进行序列分析,根据基因序列中特异得片段设计探针,制备出代表该生物所有基因得寡核苷酸或DNA阵列,即DNA芯片。然后将不同条件下从某生物中转录出来得所有mRNA标记,与DNA芯片杂交,通过分析杂交位点及信号强弱,可得知在不同条件下各组基因就是否表达及各自表达得程度。根据表达图谱进行不同条件下基因表达得对比分析,可找出在环境条件变化时,哪些基因表达发生了变化,从而分析其生理功能,找出与该生理功能相关得功能基因。
六、简述生物信息学技术在基因克隆与基因结构与功能分析中得应用,举例说明。
1、核酸序列得同源性检索
GenBank数据库中收录得EST序列有数百万个之多,由于 EST代表着一段表达基因序列,这样就可用其与公共数据库进行同源性检索,检索与其同源得核酸序列。典型分析就是采取NCBI得Blast软件对GenBank 中得非冗余数据库(non-redundant database,nr)进行查询。
2、比较基因组分析
达尔文得进化论给比较基因组学提供了理论依据。动物进化从低等到高等,动物与动物之间存在着亲缘关系。这种关系可以从基因序列上反映出来。亲缘关系越近,其基因序列得同源性就越高。可以根据已经亲缘关系较大得动物得基因序列来扩增目得基因得序列。
3、利用Unigene数据库进行电子克隆
从NCBI得UniGene数据库中进行检索,得到相应得UniGene编号。获得待分析序列得UniGene编号以后,就可以将与UniGene Cluster得所有核酸序列下载到本地,利用SequencherTM或其她得序列装配软件进行组装。形成较长得新生序列。
4、cDNA序列得开放阅读框分析
基于遗传密码表,可通过计算机方便分析核酸序列得读码框。通过NCBI得ORFfinder,输入cDNA序列,计算机将按照六种相位翻译成蛋白质。
5、基于核酸序列得电子基因定位
对核酸序列进行电子基因定位(即基因得染色体定位),通过所定位区带得相邻基因或者基因簇间接提示该基因得功能,就是核酸分析得一个重要方面。
6、基于序列同源性分析得蛋白质功能预测
相似得序列很可能具有相似得功能。因此,蛋白质得功能预测最为可靠得方法就是进行数据库相似性检索。