BB外周血单核细胞对人类白血病U细胞的.docx

抑制生长和诱导分化作用廖慧芬台湾省国立嘉义大学分子与生物化学系摘要：多个世纪以来，在世界各地水稻一直是人们的主食。本文研究了水稻的生长-抑制和免疫增强效果。经过精米台粳9号（MT9）和糙米台粳9号（BT9）的水提液处理的外周血单核细胞条件培养基（MNC-CM）对人类白血病U937细胞有显著的抑制作用。并且，这些水提液处理过的MNC-CM诱导U937细胞分化成成熟的具有产过氧化物和吞噬活性的单核/巨噬细胞（monocytes/macrophages）。用MT9和BT9处理过的MNC-CM比一般的MNC-CM中的肿瘤坏死因子-（TNF-）和干扰素的数量多。但是，一般的MNC-CM或水稻提取液它们单独均不能抑制U937细胞的生长。MT9和BT9中可能的活性成分并非类植物血凝素（PHA-like）糖蛋白、热敏蛋白和脂多糖，而是有待于进一步确认。本研究的结果表明：MT9和BT9能在体外（in vitro）通过激活外周血单核细胞对人类白血病U937细胞进行生长抑制和分化诱导。因此，这两种水稻不但可以作为供能食物，也可以作为增强抗白血病免疫力的生物反应调节因子。关键词：水稻；白血病；分化；免疫增强1. 前言多个世纪以来，在许多国家水稻是主要的食物来源。现在，世界各地种植的水稻品种繁多，在亚洲，最广泛种植的水稻是籼稻和粳稻。据报道，从水稻种分离的或衍生的若干成分具有多种的药理学和生物学活性。例如，改良的阿拉伯木聚糖米糠（rice bran）能增强老龄小鼠C57BL/6和C3H的腹膜自然杀伤细胞（natural killer cells）的活性。米糠的脂蛋白组分能诱导人类子宫内膜癌细胞的凋亡。但是，天然的日常食品-大米对癌细胞的免疫活性至今仍尚未阐明。白血病是最常见的血液恶性肿瘤，尤其多见于儿童。目前，治疗白血病的方法包括：细胞毒性化学治疗、分化诱导剂治疗、干细胞移植和其它调查疗法（investigative therapy）。鉴于分化诱导剂疗法的毒性较低且比较安全，诱导白血病细胞分化的这种策略仍然是重要的。另一方面，激活外周血单核细胞（MNC）分泌细胞因子以诱导白血病细胞的分化可作为治疗白血病的一种自然的替代疗法。越来越多的证据表明：许多食物不但能够提供能量，而且具有免疫调节活性或发挥生物反应调节因子的作用。例如，我们之前的研究表明日常食用的蘑菇和茯苓对人类白血病细胞的生长具有抑制作用，并且通过刺激单核细胞分泌细胞因子诱导人类白血病细胞的分化。水稻是世界上半数以上人口的主食，对于稻米能否改变单核细胞对白血病细胞的生物反应仍然知之甚少。本文研究了各种日常食用的水稻的提取物的抗肿瘤活性（直接细胞毒性或间接免疫增强）。2.材料与方法2.1 制备稻米提取物所用的各种水稻，台湾产的或是进口自其它国家，均从当地批发商购得。这些水稻样品由台湾省行政院农业委员会的专家高级负责人Yuan进行分类和鉴定。水稻提取物的制备步骤为：的稻米和50mL的蒸馏水混合，100搅拌加热60min。所获得的悬液加无菌水重悬，定容至总体积50mL，终浓度为10mg/mL。表1中列出了所测定的8个水稻品种。表1 本研究所用的水稻品种品种学名Milled Taiwan 9(MT9) 精米台粳9Oryza sativa ssp. JaponicaBrown Taiwan 9(BT9)糙米台粳9Oryza sativa ssp. JaponicaWhite glutinous Taiwan 9白糯米台粳9Oryza sativa ssp. JaponicaBlack glutinous Taiwan 9黑糯米台粳9Oryza sativa ssp. JaponicaGerminated brown Taiwan 8发芽的糙米台粳8Oryza sativa ssp. JaponicaMilled Taiwan 10精米台粳10Oryza sativa ssp. IndicaKoshihikariOryza sativa ssp. JaponicaCanadian wild riceZizania aquatica2.2 单核细胞的分离和条件培养基的配制应用密度梯度离心法（乙聚蔗糖泛影葡胺，1.077 g/mL）从人类外周血液中分离出单核细胞（MNC），浓度为1.5106/mL。在RPMI 1640培养基（加10%FCS，青霉素/链霉素）。中培养。MNC-CM中含有不同浓度的稻米提取物（0，20，100，500g/mL），在37、CO2浓度为5%的加湿培养箱中培养24h。收集无细胞上清，过滤，-70储存备用。从添加提取物的MNC培养基和未添加提取物的MNC培养基中收集的MNC-CM分别记为extract MNC-CM和normal MNC-CM。为了排除水稻提取物中内毒素污染的可能，在一些生长抑制和分化检测的实验中，extract MNC-CM中加入了50g/mL的多粘菌素B。白血病细胞U937的培养和分化诱导本研究中所用的人类单核细胞株U937从美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC）获得。细胞在含有10%FCS的RPMI 1640培养基中培养并保持指数生长状态。为检测细胞的生长和分化，用35mm的皮氏培养皿以初始浓度为1105/mL进行培养，培养基中添加不同浓度的提取物（0，20，100，500g/mL），30%的extract MNC-CM或normal MNC-CM。2.4 细胞生长第5天时，用台盼蓝排除试验来计算活细胞的数目。贴壁的细胞用橡皮细胞刮刀轻轻从培养皿中刮下来并收集。2.5 细胞成熟度谱经过各种处理后的第5天，使用细胞离心图片器离心并收集到显微镜载玻片上，用Wright燃料进行染色，在放大倍数为1000的倒立式光学显微镜下观察。根据细胞的形态，将细胞分为以下三类：（1）未成熟细胞；（2）中间体细胞；（3）成熟单核细胞或巨噬细胞。2.6 过氧化物产物的检测应用氮蓝四唑（NBT）还原试验测定分化骨髓细胞质的过氧化物产物。收集培养5天的细胞，以1106细胞/mL的浓度在RPMI 1640培养基中悬浮，加入等体积的NBT测试母液（每mL的PBS中含有2mg的NBT和1M的佛波豆蔻醚乙酸盐），在37孵育30min。用0.5%的Safranin O.（番红O）复染制备细胞离心涂片器的读片。含甲臜细胞的百分比（每200个细胞）用显微镜测定。2.7 吞噬作用的检测吞噬活性按照我们先前使用的方法进行检测（Chen et al. 1997）。简要的说，在PBS中悬浮酵母细胞，浓度为1108细胞/mL，制成酵母细胞悬浮液母液。收集培养5天的U937细胞，在含FCS的RPMI 1640培养基中重悬（1106细胞/mL），在37下与酵母细胞悬浮液（4106细胞/mL）孵育30min。然后这细胞置在玻璃载玻片上并在倒立式光学显微镜观察，记录每200个细胞的含酵母细胞的比率。2.8 细胞因子的测定MNC-CN中分化诱导因子的测定采用肿瘤坏死因子和干扰素的检测试剂盒进行固相酶联免疫检测。2.9 血液单核细胞的凝集活性从外周血液中分离出的人类单核细胞在浓度为500g/ml的MT9或BT9水稻提取物中或浓度为10g/ml的PHA中处理24h。用放大倍数为400的倒立式光学显微镜观察单核细胞的凝集性。3 结果3.1 人类白血病U937细胞的生长抑制如图1A所示，U937细胞的生长受到由MT9和BT9的提取物处理配制的MNC-CM的抑制，该抑制是剂量依赖性的。最高的生长抑制达到34.83.1%，以MT9 500g/ml处理MNC-CM。阳性对照PHA（10g/ml）-MNC-CM的细胞生长抑制为73.85.1%。但是，normal MNC-CM或单独的提取物处理（最大为500g/ml）中没有观察到显著的生长抑制（图1B）。图1.U937细胞在30% rice-MNC-CM或单独的稻米提取物培养5天后的生长变化（A）用由不同浓度稻米提取物制备的MNC-CM处理。阳性对照PHA（10g/mL）-MNC-CM抑制细胞生长为73.85.1%。（B）用不同浓度稻米提取物处理。五次独立试验的数据以平均值标准误表示。*表示与normal MNC-CM相比。缩略词：BT9，粳稻糙米台粳9；MT9，粳稻精米台粳9；MNC-CM，单核细胞条件培养基；PHA，植物血凝素。3.2 分化的诱导如图2所示，MT9-和BT9-MNC-CM引起未成熟的胚细胞分化成成熟的单核细胞和巨噬细胞。不成熟的胚细胞的百分比显著的从98.51.9%（未处理对照）下降到53.64.5%（500g/mL的MT9-MNC-CM）和66.32.9%（500g/mL的BT9-MNC-CM）。相反，成熟的单核细胞/巨噬细胞的百分比从0%（未处理对照）增加到23.03.2%（MT9-MNC-CM）和17.64.0%（BT9-MNC-CM）。图2. U937细胞的形态变化（A）对照（B）30% MT9-MNC-CM处理5天（C）30% BT9-MNC-CM处理5天。MT9和BT9的浓度是500g/mL。长箭头所指为典型的不成熟胚细胞，短箭头所指为典型的成熟巨噬细胞。3.3 过氧化物产物的变化细胞质生成过氧化物是成熟单核细胞和巨噬细胞的显著特征，可以通过其还原NBT的能力来确定。未处理的U937细胞仅有极少的过氧化物产生。MT9-和BT9-MNC-CM处理引起产过氧化物细胞百分比的显著上升（达到38.33.5%）（图3）。这种作用是剂量依赖性的。但是单独的稻米提取物或normal MNC-CM都没有这种效果。图3. 应氮蓝四唑（NBT）还原试验测定经过30% rice-MNC-CM处理5天后的U937细胞的过氧化物产物。MT9和BT9的浓度是500g/mL。三次独立试验的数据以平均值标准误表示。*表示与normal MNC-CM相比。缩略词：BT9，粳稻糙米台粳9；MT9，粳稻精米台粳9；MNC-CM，单核细胞条件培养基。3.4 处理的U937细胞的噬菌活性吞噬外来颗粒是成熟的单核细胞/巨噬细胞的一个功能指标。图4表明未处理或normal MNC-CM处理的细胞无明显的噬菌作用，而MT9-和BT9-MNC-CM处理的U937细胞的噬菌活性显著增强。图4. 30% rice-MNC-CM处理5天后的U937细胞噬菌活性检测MT9和BT9的浓度是500g/mL。三次独立试验的数据以平均值标准误表示。*表示与normal MNC-CM相比。缩略词：BT9，粳稻糙米台粳9；MT9，粳稻精米台粳9；MNC-CM，单核细胞条件培养基。3.5 多粘菌素B对rice-MNC-CM活性的影响在配制rice-MNC-CM时，添加50g/mL的多粘菌素B并不影响上述的生长抑制和分化诱导效果。多粘菌素B是众所周知的脂多糖活性抑制剂，本实验结果表明rice-MNC-CM没有被脂多糖污染，并且在rice-MNC-CM中发挥活性作用的不是脂多糖。3.6 各种MNC-CM的细胞因子水平如表2所示，rice-MNC-CM的干扰素-和肿瘤坏死因子-的水平比normal MNC-CM高很多，但是比PHA-MNC-CM中的低。表2 MNC-CM中的TNF-和IFN-的含量组TNF-(ng/mL)IFN-(ng/mL)normal MNC-CMPHA-MNC-CMMT9-MNC-CMBT9-MNC-CM新鲜分离的单核细胞（MNC，1.5106细胞/mL）用PBS，PHA10g/mL，MT9 500g/mL，BT9 500g/mL培养24小时。收集上清，过滤，储存在-70，测定时取出。3.7 血液单核细胞的凝集性如图5所示：用10g/mL PHA处理24小时引起单核细胞的凝集，而用500g/mL水稻提取物MT9或BT9处理细胞则没有观察到此效应。图5. PHA引起血单核细胞MNC的凝集（）未处理对照，（）PHA 10g/mL处理24h，（）MT9 500g/mL处理24h，（）BT9 500g/mL处理24h。缩略词：BT9，粳稻糙米台粳9；MT9，粳稻精米台粳9；MNC-CM，单核细胞条件培养基；PHA，植物血凝素。4 讨论在本研究中，我们证实了M19和BT19稻米的水提物能温和地抑制人类的白血病U937细胞的生长，并且能诱导它们分化成为成熟的单核细胞或巨噬细胞。脂多糖（LPS）是一种存在于革兰氏阴性菌中的内毒素，对细胞有毒性作用而且经常污染天然产物的提取物，因而在实验过程中可能导致对提取物的免疫增强作用做出高估的判断。我们用多粘菌素B（LPS的阻断剂）来消除LPS的可能影响；并且证实了在rice-MNC-CM中发挥作用的不是LPS。天然产物作用于白血病细胞的方式有两种：直接抑制细胞增生、刺激免疫活性细胞分泌诱导分化因子。添加了水稻提取物的MNC-CM，而并非水稻提取物具有显著的抑制生长和增加成熟单细胞的作用。这表明MNC可能产生了某些调节因子，刺激U937细胞分化为成熟的有功能的细胞。因此，我们认为稻米诱导的抗肿瘤活性是由于刺激了免疫应答机制，而不是直接抑制白血病细胞U937的生长。我们的结果表明：稻米提取物对培养的MNC是安全的，因为即使在10mg/mL的高浓度下也没有观察到细胞毒性作用（数据没有列举）。但是，稻米的免疫增强作用是温和的，不如草药药性强。因而，稻米在白血病的治疗中可能无法作为主要的治疗手段。稻米对白血病细胞的免疫增强作用比较温和，而且对normal MNC没有毒性，意味着稻米适合用作白血病病人的临床辅助治疗。由于稻米作为一种被普遍接受的主食，MT9和BT9不但是良好的能量来源，而且是白血病的良好的生物反应调节因子。米糠及其相关衍生物具有免疫调节作用以后报道。改良的阿拉伯木聚糖米糠（MGN-3/Biobran）可以增加人类外周血淋巴细胞肿瘤坏死因子-和干扰素-的分泌，并且能增强巨噬细胞的吞噬活性。据我们了解，目前尚无正对日常食用大米的免疫调节火星的研究，尤其是其抗肿瘤方面的作用。研究日常食用大米的免疫调节作用非常重要，因为稻米（非米糠及其衍生物）是世界上过半人口所接受的食物。凝集素资源丰富且广泛存在于高等植物包括水稻中。PHA（植物血凝素）是一种有促进血细胞凝集活性的凝集素，可溶于水，对T淋巴细胞有强烈的促有丝分裂作用。如图5所示，用10mg/mL的PHA处理24h而没有添加稻米提取物，导致了MNC的凝集。这说明了稻米提取物对MNC的活化作用可能不是由具有凝集活性的类PHA的凝集素作用而介导的。在制备稻米提取物时，我们模拟烹饪过程在沸水中加热大米。因此，稻米提取物的活性成分不太可能是蛋白质，虽然不能完全排除稻米提取物中存在热稳定蛋白的可能。碳水化合物例如多糖可能是稻米提取物的活性成分。在我们的预实验中，我们通过加入75%体积的乙醇来沉淀热的水溶提取物，发现沉淀物能激活MNC（数据没有列举）。综上，稻米提取物的活性成分不是类PHA的糖蛋白、热敏蛋白和多糖，而有待于进一步确认。稻米提取物中碳水化合物的特性还没有阐明。之前研究灵芝、猪苓和冬虫夏草中的多糖表明它们的免疫调节活性成分是-(1,3)- and -(1,6)-D-葡聚糖。但是从米糠和黑豆中分离的-(1,6)葡聚糖已被证实是一种抗肿瘤免疫刺激因子。在稻米提取物中，活性物质（多糖或其它物质）的结构类型仍待进一步研究。而且，口服时，糖类和蛋白质在肠胃中会被迅速消化，这种消化是否有利于它们被结合到肠胃上皮细胞，从而激发粘膜免疫或进入血液循环激活周围MNC，还有待进一步阐明。稻米提取物的可能应用就是作为接受癌症治疗的病人的一种辅助治疗手段。水稻提取物可像食物一样口服，因而病人接受水稻提取物的程度远非目前的辅助药物所能比拟。总之，粳稻MT9和BT9抑制人类白血病U937细胞的生长且诱导其分化。我们目前正在应用肿瘤移植模型进行体内实验，来观察这两种稻米提取物在肿瘤生长和宿主免疫应答方面的作用。小结：1。表1中列出了8个品种的稻米用以实验，但作者研究发现只有前面的两种MT9和BT9（粳稻糙米台粳9和粳稻精米台粳9）有效果，所以后面都只是做MT9和BT9。2。本研究中所用的细胞株和药剂均为进口，是因为投的刊物是国外的。若投国内刊物则所用的细胞株和药剂无需进口，国内即可，细胞株可以从北京协和医院购买，细胞培养的药品国内试剂公司也可以，很便宜。3。我们实验室可以做这方面的研究，采用国产的药品和细胞株，本研究的费用最多1万人民币即可，难点在于需要积累培养细胞的经验，我们实验室水稻组织培养也是花了几年的时间才建立起来的。老板打算做农产品活性成分对癌细胞的作用等方面的研究，我这里可以向其他同学请教细胞培养方面的方法和经验，然后做成文档，发给许明刘峰和志伟同学。