DB53∕T 1190-2023 制烟原料鉴别技术规程 DNA分子标记法(云南省).pdf

ICS 65.160CCS X 85B53云 南 省 地 方 标 准DB53/T 11902023制烟原料鉴别技术规程DNA分子标记法2023-07-10 发布2023 10 10 实施云南省市场监督管理局 发布DB 53/T 11902023目 次前言.HI引言.V1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.25仪器.26试剂J.27取样.27.1烟叶及片烟.27.2烟梗、再造烟叶、烟末和烟丝.38鉴另I J.38.1 基因组DNA提取.38.2 P CR 扩增.38.3 样品对照.48.4非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳.48.5 银染.59鉴别结果判定.510质量控制.511鉴别报告.5附录A（规范性）常用溶液配制.6附录B（规范性）DNA提取试剂配制.7附录C（规范性）非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制.8附录D（规范性）银染试剂配制.9附录E（资料性）烟草属特异性DNA分子标记引物.10附录F（资料性）制烟原料鉴别结果报告.11IDB 53/T 11902023前 己本文件按照GB/T 1.1-2020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定 起草。本文件由中国烟草总公司云南省公司提出。本文件由云南省烟草标准化技术委员会（YNTC12）归口。本文件起草单位：云南省烟草质量监督检测站，云南省烟草农业科学研究院，中国烟草总公司云南 省公司。本文件主要起草人：张轲、童治军、彭秋连、张晓伟、龙杰、陈丹、孙浩巍、王春琼、秦世春、肖 炳光、肖迪、蔡洁云、刘忠华、张冀武、李海燕、彭丽娟、梁诗涵、邢家磊、盖小雷、张鲁民、冯洪涛、李超、徐安传、章维敏、张海、刘芳、李敏、何彬、卓泳旭、段丽。IIIDB 53/T 11902023引 言本文件的发布机构提请注意，声明符合本文件时，本文件附录E的使用可能涉及专利一种鉴别烟 与非烟的烟草属特异性分子标记及其应用（专利号：ZL202110558610.3）o本文件的发布机构对于该专利的真实性、有效性和范围无任何立场。该专利持有人已向本文件的发布机构保证，他们同意在公平、合理、无歧视基础上，免费许可任何 组织或者个人在实施本文件时实施专利。该专利持有人的声明已在本文件的发布机构备案。相关信息可 以通过以下联系方式获得：专利持有人姓名：云南省烟草质量监督检测站，云南省烟草农业科学研究院。地址：昆明市高新区科医路41号，昆明市五华区圆通街33号。请注意除上述专利外，本文件的某些内容仍可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利 的责任。VDB 53/T 11902023制烟原料鉴别技术规程DNA分子标记法1范围本文件界定了应用DNA分子标记进行制烟原料鉴别的术语和定义、缩略语，规定了鉴别程序和方法。本文件适用于制烟原料鉴别。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本 文件。GB/T 18771.2-2015烟草术语第2部分：烟草制品与烟草加工GB/T 24310-2009烟草及烟草制品转基因检测方法GB/T 28660-2012马铃薯种薯真实性和纯度鉴定SSR分子标记DB 5301/T 26-2019马铃薯品种鉴定分子标记检测3术语和定义GB/T 18771.2-2015界定的以及下列术语和定义适用于本文件。3.1制烟原料 raw mater i a I for c i garette-mak i ng用于生产烟草制品的烟叶（含复烤烟叶）、烟梗、烟末、再造烟叶和烟丝（含毛烟丝、梗丝）。3.2再造烟叶 reconst ituted tobacco;tobacco sheet以烟梗、烟末、烟丝等为主要原料，经加工制成可作为烟草制品原料使用的薄片。来源:GB/T 18771.2-2015,3.163.3DNA 分子标记 DNA mo I ecu I ar marker能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。来源:DB 5301/T 26-2019,3.43.4聚合酶链式反应 poI ymerase cha in react ion,P CR在耐热DNA聚合酶作用下，于体外快速大量特异性扩增特定DNA序列的方法。来源:GB/T 28660-2012,3.23.5成件制烟原料 packaged raw mater i a I for c i garette-mak i ng外形尺寸、形状、包装形式等相对一致的制烟原料。3.6未成件制烟原料 unpackaged raw mater i a I for c i garette-mak i ng外形尺寸、形状、包装形式等明显不一致或无包装的制烟原料。1DB53/T 119020234缩略语以下缩略语适用于本文件。CTAB：十六烷基三甲基漠化镂（cetyltrimethylammonium bromide）dNTP s Mix：脱氧核糖核甘酸三磷酸混合液（deoxy-ribonucleoside triphosphate mix）bp：碱基对（base pair）EDTA：乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid）P VP：聚乙烯口比咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone）Taq DNA聚合酶：Taq DNA polymeraseTris碱：三羟甲基氨基甲烷（tris-baseTris-HCl：三羟甲基氨基甲烷盐酸盐TE缓冲液：Tris、EDTA混合溶液5仪器5.15.25.35.45.55.65.75.85.95.105.11P CR扩增仪（控温精度0.电泳系统（50 V-600 V,垂直电泳槽（试样格厚1 分析天平（感量0.0001 fi 磁力搅拌器（转速0 r/微量移液器（0.5吐地吐、电*L 恒温水浴锅（精度0.1 冰箱（-80,-20,pH计（精度0.02 pH或 超纯水器（电阻率18.2 水平摇床（转速30 rpm6试剂18.26.16.26.36.46.56.66.7CR反应体系用水应使用电阻率为ioTl）及配套枪头。除非特别说明，检测中仅使用分MQ cm以上的超纯水。常用溶液：按附录A配制。DNA提取试剂：按附录B配制。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂：按附录C配制O 银染试剂：按附录D配制。Taq DNA聚合酶和配套的P CR缓冲液。dNTP s Mix（2.5 mmol/L each）。液氮。7取样7.1烟叶及片烟2DB 53/T 119020237.1.1成件取样待检样品在100件以内按10%20%取样；超出100件的部分按5%10%取样，取样超过40件，只需任 选40件，必要时可酌情增加取样数量。7.1.2未成件取样对整体待检样品随机进行69处的取样，每处取样3 kg5 kgo7.2烟梗、再造烟叶、烟末和烟丝7.2.1成件取样待检样品在100件以内按10%20 选40件，必要时酌情增加取样数量7.2.2未成件取样未成件取样对整体待检样8鉴别8.1 基因组DNA提取8.1.1用CTAB法或试剂8.1.2基因组DNA纯度和8.2 P CR扩增8.2.1基因组DNA的准备根据7.1.2基因组DNA纯 于4冰箱中保存备用。8.2.2烟草属特异性DNA分子:8.2.2.1附录E给出了烟草属特8.2.2.2将合成的引物用1XTE缓2(A.4 备用。使用时取部分保存液，用1XTE2 存。处取样5 kgo液配置成10;超1001.按5%10%取样，取样超过40件，只需任 待检样品，取样总量为5 kg10 kg。用WTE缓冲液(A.4)稀释至50 ng/比,ol/uL的保存液，于-20冰箱中保存1/uL使用液，保存液放回-20冰箱中保8.2.3 P CR反应体系在冰盘中或4条件下按表1所列成分和用量，顺序依次加入P CR管，准备总体积为20.0 uL的P CR 反应体系。3DB53/T 11902023表1 P CR反应体系成分用量/L灭菌双蒸水（ddH20）11.1P CR缓冲液(10 mM Tris-Cl,pH 8.4,50 mM KC1,1.5 mM MgCl2)2.5dNTP s Mix(2.5 mmol/L each)2.0正向引物（10 mmol/L）1.0反向引物(10 mmol/L)1.0Taq DNA聚合酶(2.5 U/nL)0.4DNA模板(50 ng/uL)2.08.2.4 P CR反应程序采用下列循环程序进行扩增：a）预变性：95 5 min；b）循环设定：1）变性 94 30 s；2）退火 60 30 s；3）延伸 72 45 s；c）循环次数：35个循环；d）后延伸：72 5 min；e）终止反应：4 o8.3 样品对照8.3.1 阳性材料为烤烟。8.3.2 阴性材料为茶叶。8.4 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳8.4.1凝胶板装配将玻璃板清洗干净，自然晾干后与胶框组装好。用2%琼脂（C.6）封住长玻璃板下口，待琼脂完全 凝固后，将凝胶板小心装入垂直电泳槽两侧，拧紧电泳槽上的固定阀。8.4.2 凝胶制备取8%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液（C.2）75mL,摇匀后沿玻璃板边缘轻缓地将凝胶液注入玻璃板缝 隙中，及时清除可能出现的气泡，将梳子插入至适当位置，然后将电泳槽水平放置，室温下放置30 min 以上，以便凝胶完全凝固。8.4.3 电泳样品的准备取P CR产物10 UL,加入2 UL溟酚蓝上样缓冲液（C.4）,混匀后放于4冰箱备用，其余的P CR产 物放于-20冰箱中保存。8.4.4 电泳待凝胶完全凝固后，向电泳槽中加入足量的0.5XTB E缓冲液（C.5）,接通电源以400 V,300 mA 电泳30 min。4DB 53/T 119020238.5银染8.5.1固定从电泳槽中取出凝胶板，轻轻取下胶框，小心分离玻璃板，将凝胶取出放入装有适量固定液（D.2）的塑料方盒中，在水平摇床上轻摇动10 min20 min,至凝胶上示踪染料的色带退去为止。8.5.2染色倒掉固定液，用dd%。冲洗凝胶23次，每次1 min,取出凝胶，滤去水分，将凝胶转入硝酸银染色 液（D.3）中染色30 mine8.5.3显色染色结束后，将染色液倒入回收瓶中，倒入dd比O迅速漂洗23次，每次5 s6 s,倒入显色液（D.4）,水平摇床轻摇至凝胶上条带清晰为止，倒掉显色液，倒入dd O漂洗2次，每次5 min,即可观察结果。8.5.4拍照记录显色之后拍照记录电泳结果。9鉴别结果判定分析样品的P CR 扩增产物在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶中的电泳结果，若样品在DNA分子标记Ntsp027 或Ntspl51的P CR 扩增产物出现303 bp或300 bp特异性条带，且条带的亮度接近或达到阳性对照，判定样 品中含制烟原料；反之，若无条带出现，则判定样品中不含制烟原料。10质量控制阳性对照样品在8%非变性聚丙烯酰胺凝胶的特定位置出现特异性P CR扩增条带，阴性对照样品则无 P CR扩增条带出现，则结果有效。若上述对照出现异常，则结果无效，应重新进行鉴别。11鉴别报告制烟原料鉴别结果报告的样式参见附录F。5DB53/T 11902023A.1试剂A11A12A13A14A15乙二胺四乙酸钠。12 mol/L氢氧化钠。Tris 碱。11.6 mol/L 浓盐酸。氯化钠。A.2 EDTA 溶液(1000 mL,0.5A.2.1A.2.2A.2.3A.2.4准确称量186.1 g乙二胺 磁力搅拌，滴加12 mol 超纯水定容至1000 mL 121 灭菌 15 min,A.3 Tris-HCI 缓冲液(1000A.3.1 准确称量 121 g TrisA.3.2 加浓盐酸(11.6 mol/A.3.3 超纯水定容至1000 mLA.4 TE 缓冲液(100 mL,10100 mL Tris-HCl缓冲液（A.箱中保存。A.5高盐TE缓冲液（100 mL）A.5.1A.5.2A.5.3附录 A（规范性）常用溶液配制0 mL超纯水超纯水至 8.()A溶液.(0.5 mL,pH 8.0)(A.2),4 冰称5.844 g氯化钠(A.1.5),加加2 mL 0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液(p加200 uL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)(A.2)。A.5.4 超纯水定容至100 mL,4 冰箱中保存。6DB 53/T 11902023附录 B（规范性）DNA提取试剂配制B.1试剂B.1.1CTAB oB.12氯化钠。B.13B.14B.15B.16B.17P VP o0.5 mol/L Tris-HCl缓冲液0.5 mol/L EDTA(pH 8.0 三氯甲烷。异戊醇。B.22XCTAB提取缓冲液（B.2.1 称取2 g CTAB(B.1 搅拌使其溶化。B.2.2 加入20 mL 0.5 moB.2.3 加入4 mL 0.5 molB.2.4 超纯水定容至100B.3 10XCTAB 缓冲液(10B.3.1 称取10 g CTAB(B.B.3.2加入80 mL超纯水，B.3.3 超纯水定容至100 mL,B.4 CTAB沉淀缓冲液（100 mL）B.4.1B.4.2B.4.3.1.3）并加60 mL超纯水，磁力称取lg CTAB(B.1.1)加入80加入 10 mL 0.5 mol/L Tris-HCf?加入2 mL 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)(B.1.5)。B.4.4超纯水定容至100 mL,4 冰箱中保存。B.5三氯甲烷/异戊醇（24：1,体积分数）B.5.1量取96 mL三氯甲烷（B.1.6）和4 mL异戊醇（B.1.7）加入100 mL广口瓶中。B.5.2摇匀后，分装在3个广口瓶中。B.5.3 4 冰箱中保存。7DB53/T 11902023附录 C(规范性)非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂配制C.1试齐I JC.1.1丙烯酰胺。C.1.2甲叉双丙烯酰胺。C.1.3过硫酸镂。C.1.4 蔗糖(400型)。C.1.5 1%漠酚蓝。C.1.6 1%二甲苯青 FF。C.1.7 Tris 碱。C.1.8硼酸。C.1.9 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)oC.1.10琼脂粉。C.2 8.0%非变性聚丙烯酰胺凝胶溶液(1000 mL)C.2.1称取290 g丙烯酰胺(C.1.1)、10 g甲叉双丙烯酰胺(C.1.2)加入700 mL超纯水，磁力搅拌使其溶 解。C.2.2超纯水定容至1000 mL,棕色瓶室温保存。C.3 10%过硫酸铁溶液C.3.1称取10 g过硫酸镂(C.1.3)加入90 mL超纯水，磁力搅拌使其溶解。C.3.2超纯水定容至100 mL,4 冰箱中保存。C.4漠酚蓝上样缓冲液C.4.1 称取蔗糖(400型)(C.1.4)150 mgoC.4.2 加入 1%澳酚蓝(C.1.5)150 uL,G二甲苯青FF(C.1.6)150 uLoC.4.3超纯水定容至1000 uL,4 冰箱中保存。C.5 5XTB E缓冲液C.5.1 称取Tris碱(C.1.7)54 g、硼酸(C.1.8)27.5 g、0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)(C.1.9)20 mL。C.5.2超纯水定容至1000 mL,4 冰箱中保存。C.5.3 稀释5倍为1XTB E,稀释10倍为0.5XTB。C.6 2%琼脂C.6.1称取琼脂粉(C.1.10)2 g加入90 mL超纯水，磁力搅拌并加热使其溶解。C.6.2超纯水定容至100 mL,4 冰箱封口保存。8DB 53/T 11902023附录 D(规范性)银染试剂配制D.1试齐I JD.1.1无水乙醇。D.1.2冰醋酸。D.1.3硝酸银。D.1.4氢氧化钠。D.1.5甲醛。D.2固定液D.2.1 量取无水乙醇(D.1.1)50 mL、冰醋酸(D.1.2)2.5 mLoD.2.2超纯水定容至500 mL，临时配制。D.3硝酸银染色液D.3.1称取硝酸银(D.1.3)1 g加入400 mL超纯水，磁力搅拌使其溶解。D.3.2超纯水定容至500 mL，棕色瓶室温保存。D.4显色液D.4.1称取氢氧化钠(D.1.4)7.5 g加入300 mL超纯水，磁力搅拌使其溶解。D.4.2使用前5 min量取甲醛(D.1.5)5 mL,超纯水定容至500 mL。9表E.1为烟草属特异性DNA分子标记引物信息表。表E.引物名称引物序列（5-3）Ntsp027F:GTTGTTCGCTTCCCTGATGTR:AACCAAAGCAAGCGAAATGTNtspl51F:ATTTGGCTTTGGCTATGGAAR:CGGAGACAAGAGACCCAAGT60附录 E（资料性）烟草属特异性DNA分子标记引物DH5b醇c10Nitab4.5标记位点/基因：i：132：Ttab4.5 000526(I p-123-.0259CR/j1了I其他说明JFI斯J鉴别结论麻1批准：日期：n期:.制表:日期：11DB53/T 11902023