目的基因的克隆与基因文库的构建精美生物医学.pptx

基因文库基因文库基因文库基因文库请你找找看请你找找看请你找找看请你找找看nn什么是基因文库，由哪两部分组成呢？什么是基因文库，由哪两部分组成呢？nn构建基因文库由什么用呢？构建基因文库由什么用呢？nn构建一个基因文库都有哪些基本步骤，请概括！构建一个基因文库都有哪些基本步骤，请概括！一基因文库概述一基因文库概述 1 1、概念、概念基因文库基因文库(library)library)：一套包含某生物体：一套包含某生物体 所有基因的所有基因的DNADNA序列。序列。这些序列分别与这些序列分别与适当的载体适当的载体结合在一起。结合在一起。2 2、基本组成、基本组成、基本组成、基本组成包括：基因组文库、包括：基因组文库、包括：基因组文库、包括：基因组文库、cDNAcDNA文库文库文库文库cDNAcDNA：由：由：由：由mRNAmRNA逆转录的逆转录的逆转录的逆转录的DNADNA，因此，因此，因此，因此不不不不 含含含含非转录的基因组序列。非转录的基因组序列。非转录的基因组序列。非转录的基因组序列。单链单链单链单链cDNAcDNA可由可由可由可由DNADNA聚合酶转变成双链，应用于聚合酶转变成双链，应用于聚合酶转变成双链，应用于聚合酶转变成双链，应用于基因工程。基因工程。基因工程。基因工程。基因组文库基因组文库基因组文库基因组文库 Genomic DNA libraryGenomic DNA libraryGenomic DNA libraryGenomic DNA library使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的使用与切割载体相同的限制酶，将供体生物的基因组基因组基因组基因组DNADNADNADNA切割成许多片段切割成许多片段切割成许多片段切割成许多片段将所有片段连接到载体上，构成一个重组将所有片段连接到载体上，构成一个重组将所有片段连接到载体上，构成一个重组将所有片段连接到载体上，构成一个重组DNADNADNADNA群体群体群体群体这个群体包含这个群体包含这个群体包含这个群体包含全基因组全基因组全基因组全基因组的遗传信息的遗传信息的遗传信息的遗传信息cDNAcDNA文库（文库（cDNA librarycDNA library ）以以以以mRNAmRNAmRNAmRNA为模板，经反转录酶合成互补为模板，经反转录酶合成互补为模板，经反转录酶合成互补为模板，经反转录酶合成互补 DNA(complementary DNA DNA(complementary DNA DNA(complementary DNA DNA(complementary DNA，cDNA)cDNA)cDNA)cDNA)将双链将双链将双链将双链cDNAcDNAcDNAcDNA与适当载体连接与适当载体连接与适当载体连接与适当载体连接 转化到宿主细胞内进行扩增，建成转化到宿主细胞内进行扩增，建成转化到宿主细胞内进行扩增，建成转化到宿主细胞内进行扩增，建成cDNAcDNAcDNAcDNA文库文库文库文库 基因组文库与基因组文库与基因组文库与基因组文库与 cDNA cDNA cDNA cDNA文库的比较：文库的比较：文库的比较：文库的比较：基因组文库包含基因组的所有基因基因组文库包含基因组的所有基因 cDNA cDNA文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某文库只包括某一特定细胞类型、某一组织、或某一发育时期的表达序列一发育时期的表达序列 分离特定基因，分离特定基因，cDNAcDNA库比较方便库比较方便 研究调控序列，必须用到基因组文库研究调控序列，必须用到基因组文库3 3、构建目的、构建目的创建基因文库的创建基因文库的创建基因文库的创建基因文库的目的目的目的目的：从特定的材料中分离目：从特定的材料中分离目：从特定的材料中分离目：从特定的材料中分离目 的的的的DNADNADNADNA片段或基因。片段或基因。片段或基因。片段或基因。把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方把所有的基因集中在一个库中，采用一定的方法在库中筛选目的基因。法在库中筛选目的基因。法在库中筛选目的基因。法在库中筛选目的基因。同时也便于基因的长期保存。同时也便于基因的长期保存。同时也便于基因的长期保存。同时也便于基因的长期保存。4 4、基因文库的构建流程基因文库的构建流程基因文库的构建流程基因文库的构建流程（1 1）基因组文库的构建）基因组文库的构建）基因组文库的构建）基因组文库的构建提取某生物提取某生物全部全部DNA用适当用适当限制酶切割限制酶切割许许 多多DNA片段片段与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物基该生物基因组文库因组文库（每个受体菌含有一段不同的（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）片段）（2 2）cDNAcDNA文库的构建文库的构建文库的构建文库的构建mRNAmRNA反转录形成反转录形成反转录形成反转录形成mRNA逆转录酶逆转录酶杂交双链杂交双链核酸酶核酸酶H单链单链DNADNA聚合酶聚合酶双链双链DNA与载体连接与载体连接导入受体菌群导入受体菌群该生物该生物cDNA文库文库5 5、基因文库的质量标准、基因文库的质量标准 尽可能高的尽可能高的完备性完备性重组克隆的总数不宜过大重组克隆的总数不宜过大 以减轻筛选工作的压力以减轻筛选工作的压力载体的装载量最好大于基因的长度载体的装载量最好大于基因的长度 避免基因被分隔克隆避免基因被分隔克隆克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域 以利克隆排序以利克隆排序克隆片段易于从载体分子上完整卸下克隆片段易于从载体分子上完整卸下重组克隆能稳定保存、扩增、筛选重组克隆能稳定保存、扩增、筛选二、二、二、二、目的基因的克隆目的基因的克隆用限制酶切断成许用限制酶切断成许多片段多片段1 1、直接分离法、直接分离法“鸟枪法鸟枪法”载载入运入运入运入运载载体体体体导导入不同的受体入不同的受体入不同的受体入不同的受体细细胞胞胞胞大量复制和表达大量复制和表达大量复制和表达大量复制和表达找出含有目的基因的找出含有目的基因的找出含有目的基因的找出含有目的基因的细细胞胞胞胞限制限制限制限制酶酶将将将将DNADNADNADNA切成切成切成切成许许多片段多片段多片段多片段鸟枪法克隆目的基因的局限性鸟枪法克隆目的基因的局限性工作量较大，需要了解目的基因的背景知识工作量较大，需要了解目的基因的背景知识不能获得的最小长度的目的基因不能获得的最小长度的目的基因不能除去真核生物目的基因的内含子结构不能除去真核生物目的基因的内含子结构2 2、人工合成基因法：、人工合成基因法：1 1）逆转录法：）逆转录法：mRNAmRNA双链双链DNADNA(即目的基因即目的基因)逆转录酶逆转录酶单链单链DNADNA合成合成2 2）直接合成法：）直接合成法：蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNAmRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列构基因的核苷酸序列推测推测推测推测目的基因（双链）目的基因（双链）化学合成化学合成3、通过DNA合成仪直接合成目的基因DNA合成仪合成仪蛋白质的氨基蛋白质的氨基蛋白质的氨基蛋白质的氨基酸顺序酸顺序酸顺序酸顺序mRANmRAN核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列核苷酸序列基因基因基因基因DNADNA的核的核的核的核苷酸序列苷酸序列苷酸序列苷酸序列目的目的目的目的基因基因基因基因推推测测推推测测合合成成 当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。知时，可采用此种方法。知时，可采用此种方法。知时，可采用此种方法。4 4、利用、利用PCRPCR技术扩增目的基因技术扩增目的基因 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段5 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC CC C5 5/3 3/引物引物G GG G1.目的基因受热变性，解旋；目的基因受热变性，解旋；2.引物与单链互补结合；引物与单链互补结合；3.合成链在合成链在DNA聚合酶作用下进行延伸。聚合酶作用下进行延伸。5 5/3 3/A AG G引物引物(2)(2)利用利用PCRPCR技术技术扩增扩增原理：原理：_DNADNA复制复制条件：条件：_、_、_ _、_(_(做启动子做启动子)。已知基因的核苷酸序列已知基因的核苷酸序列四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸一对引物一对引物DNADNA聚合酶、解旋酶聚合酶、解旋酶方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）指数指数2 2n n结果：结果：使目的基因的片段在使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增短时间内成百万倍地扩增过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9690-96）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、退火、退火（复性复性25-6525-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物与物与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，从酶的作用下，从 引物的引物的55端端33端端延伸，合成与模板互补延伸，合成与模板互补 的的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链三、基因文库的构建三、基因文库的构建（一）（一）切割切割：基因组：基因组DNADNA的分解的分解 用于基因组用于基因组文库构建的文库构建的DNADNA片段的切割一般采用片段的切割一般采用超声波处理超声波处理和和限制性内切酶限制性内切酶部分酶切部分酶切两种方法。两种方法。超声波处理超声波处理后的后的DNADNA片段呈平头末端，需加装人工接头片段呈平头末端，需加装人工接头 部分酶切法部分酶切法一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶一般选用四对碱基识别序列的限制性内切酶，如：如：Sau3AISau3AI或或MboIMboI等，这样等，这样DNADNA酶解片段的大小可控酶解片段的大小可控 连接前，上述处理的连接前，上述处理的DNADNA片段必须根据载体的装载量进行分级片段必须根据载体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干的分离，以杜绝不相干的DNADNA片段随机连为一体！片段随机连为一体！载体和受体的选择载体和受体的选择nn出于压缩重组克隆的数量，用于出于压缩重组克隆的数量，用于出于压缩重组克隆的数量，用于出于压缩重组克隆的数量，用于基因组基因组基因组基因组文库文库文库文库构建的构建的构建的构建的载体载体载体载体通常选通常选通常选通常选装载量较大的装载量较大的装载量较大的装载量较大的l l l l-DNA-DNA或或或或考斯质粒考斯质粒考斯质粒考斯质粒；nn对于大型基因组（如动植物和对于大型基因组（如动植物和对于大型基因组（如动植物和对于大型基因组（如动植物和人类）需使用人类）需使用人类）需使用人类）需使用YACYAC载体载体载体载体nn由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的由于绝大多数真核生物的mRNAmRNA小于小于小于小于10 10 kbkb，因此用于因此用于因此用于因此用于cDNAcDNA文库文库文库文库构构构构建的载体通常选建的载体通常选建的载体通常选建的载体通常选质粒质粒质粒质粒 上述几种上述几种上述几种上述几种载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：载体的最大装载量如下：质粒质粒l l l l-DNA-DNA考斯质粒考斯质粒15 15 kbkb25 25 kbkb45 45 kbkbYACYAC400400 kbkbnn 用于基因文库构建的受体则根据载体使用于基因文库构建的受体则根据载体使用于基因文库构建的受体则根据载体使用于基因文库构建的受体则根据载体使用用用用大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌或或或或酵母菌酵母菌酵母菌酵母菌密集铺板（密集铺板（1-101-10万）万）杂杂交交挖挖取取铺铺板板铺铺板板目的重组克隆目的重组克隆二、二、筛选筛选：从基因文库中筛选目的基因：从基因文库中筛选目的基因从基因库中筛选特定的克隆从基因库中筛选特定的克隆从基因库中筛选特定的克隆从基因库中筛选特定的克隆 一一一一个个个个基基基基因因因因文文文文库库库库中中中中有有有有几几几几万万万万个个个个克克克克隆隆隆隆，目目目目的的的的基基基基因因因因到到到到底底底底在在在在哪哪哪哪个个个个克克克克隆上呢？隆上呢？隆上呢？隆上呢？根据待选基因相关信息根据待选基因相关信息根据待选基因相关信息根据待选基因相关信息 确定筛选方法和条件。确定筛选方法和条件。确定筛选方法和条件。确定筛选方法和条件。最最最最常常常常用用用用的的的的方方方方法法法法是是是是利利利利用用用用DNADNADNADNA探探探探针针针针，用用用用放放放放射射射射性性性性同同同同位位位位素素素素或或或或非非非非放放放放射性同位素标记探针，筛选基因文库射性同位素标记探针，筛选基因文库射性同位素标记探针，筛选基因文库射性同位素标记探针，筛选基因文库 DNADNA探针（探针（探针（探针（probeprobe）探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列探针是一段能够与待选目的基因互补的核酸序列 DNA DNA DNA DNA、cDNAcDNAcDNAcDNA、寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸寡聚核苷酸 单链、双链单链、双链单链、双链单链、双链 同位素标记、荧光标记、颜色标记同位素标记、荧光标记、颜色标记同位素标记、荧光标记、颜色标记同位素标记、荧光标记、颜色标记筛选文库筛选文库筛选文库筛选文库质粒基因库筛选质粒基因库筛选质粒基因库筛选质粒基因库筛选细菌混合液在培细菌混合液在培细菌混合液在培细菌混合液在培养在平板上养在平板上养在平板上养在平板上转移到尼龙膜上转移到尼龙膜上转移到尼龙膜上转移到尼龙膜上裂解细菌裂解细菌裂解细菌裂解细菌变性变性变性变性DNADNADNADNA标记探针标记探针标记探针标记探针杂交杂交杂交杂交漂洗漂洗漂洗漂洗放射自显影或荧放射自显影或荧放射自显影或荧放射自显影或荧光检测光检测光检测光检测挑取对应菌落、挑取对应菌落、挑取对应菌落、挑取对应菌落、培养培养培养培养抽提质粒抽提质粒抽提质粒抽提质粒 阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定阳性克隆的分析与鉴定 uu 从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步从基因库中筛选出的阳性克隆，还需进一步分析、鉴定，才能最后得到目的基因分析、鉴定，才能最后得到目的基因分析、鉴定，才能最后得到目的基因分析、鉴定，才能最后得到目的基因 uu 测序测序测序测序 自动测序仪自动测序仪自动测序仪自动测序仪uu 功能分析功能分析功能分析功能分析 预测软件预测软件预测软件预测软件磷酸二脂键磷酸二脂键磷酸二脂键磷酸二脂键测测序序电电泳泳图图谱谱基因测序及分析基因测序及分析序列测定的技术序列测定的技术 杂交测序法杂交测序法 质谱法质谱法 单分子测序法单分子测序法 原子探针显微镜测序法原子探针显微镜测序法DNA 芯片法芯片法 经典方法经典方法:Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法(Sanger,1977)Maxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法(Maxam&Gilbert,1977)新技术方法新技术方法:与与 PCR反应类似。反应类似。反应体系中包含：模板反应体系中包含：模板 DNA,Taq酶酶,dNTPs,ddNTPs和测序和测序引物；引物；反应过程：反应过程：变性复性延伸终止变性复性延伸终止Sanger双脱氧终止法双脱氧终止法Dideoxynucleotides（双脱氧核苷酸）（双脱氧核苷酸）ddNTPs 是反应终止剂是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，可以当作正常碱基参与复制，一旦链入一旦链入DNA中，其后就不能中，其后就不能再继续连接。再继续连接。反应体系中反应体系中dNTPs的浓度远高的浓度远高于于ddNTPs(一般一般1：34)。*少一个少一个OH脱氧核甘酸脱氧核甘酸与与双脱氧核甘酸双脱氧核甘酸结构比较结构比较Sanger第一步：加入复制终止剂第一步：加入复制终止剂荧光检测探头荧光检测探头电泳，看谁跑得快ddNTPs参与下的DNA复制SangerSanger法测序产物的平均链法测序产物的平均链长取决于长取决于ddNTPddNTP：dNTPdNTP的比的比例，比例高时，得到较短例，比例高时，得到较短的产物；的产物；“标记终止法标记终止法”测序产物测序产物的平均长度可通过标记反的平均长度可通过标记反应中应中dNTPdNTP浓度浓度(高浓度能得高浓度能得到长的产物到长的产物)或终止反应的或终止反应的ddNTP:dNTPddNTP:dNTP来调整。来调整。Sanger第二步：荧光检测