菝葜抑癌素的抗癌作用及其机制研究.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 收稿日期：2023 年 12 月 21 日 作者简介：张天艾（2004），女，汉族，2022 届牡丹江医学院基础医学院，临床医学本科在读，研究方向为临床医学。-52-菝葜抑癌素的抗癌作用及其机制研究 张天艾 耿益可 刘 颖（通讯作者）牡丹江医学院，黑龙江 牡丹江 157011 摘要：摘要：目的 探讨菝葜制瘤素对不同类型癌细胞的抑制作用及其可能的分子机制。方法 采用标准 MTT 法检测菝葜抗癌活性因子对人 A549 肺癌细胞、MCF-7 人乳腺癌细胞、HCT116 结肠癌细胞、人肝癌 HepG2 细胞增殖的抑制作用;流式细胞仪可检测菝葜制瘤素对癌细胞凋亡的抑制作用。结果 菝葜制瘤素能显着抑制四种癌细胞的增殖，且具有一定的浓度和时间依赖性；菝葜制瘤素可诱导四种癌细胞凋亡，且随浓度增加，凋亡率增加。结论 菝葜制瘤素具有广泛的抗癌作用，其机制可能与诱导癌细胞凋亡有关。关键词：关键词：菝葜抑癌素；抗癌作用；凋亡；Bcl-2 家族；Caspase 家族 中图分类号：中图分类号：R28 恶性肿瘤是由于基因突变导致细胞失去正常生长控制而引起的疾病，其特点是无限增殖、侵犯周围组织器官、远处转移和复发。癌症是一种全球性的疾病，对人们的身体和生活造成了极大的危害。2018 年，全世界新增肿瘤患者 1820 万，死亡人数 940 万。近年来，我国肿瘤的发病率与死亡率呈逐年升高趋势，到 2015年，新增肿瘤患者 438 万，死亡患者 281 万。其中，肺癌、乳腺癌、结肠癌、肝癌是四种最常见的恶性肿瘤，占所有癌症发病率和死亡率的近一半。当前，癌症的主要疗法有外科手术、放化疗及靶向药物等。然而，上述几种疗法均有其局限及毒副作用，如手术创伤大、放射治疗对正常组织的损伤、化疗的毒性大、对靶向治疗的耐药性高等。因此，寻找新型、有效、安全的抗肿瘤药物是当前恶性肿瘤治疗的迫切需要。中医药是中医学不可缺少的重要组成部分，有着悠久的历史和丰富的经验。中医药在恶性肿瘤防治方面，在整体理念、辨证论治、免疫检查点抑制剂、多种快速方法、多层次训练等方面具有完全独特的优势。近十年来，中医药在癌症预防和治疗方面取得了许多进展，并发现了许多具有抑制肿瘤生长作用的中药配方和生物活性成分。癌细胞菝葜（SmilaxglabraRoxb.）是菝葜科菝葜属的一种比较常见且名贵的中药材。一方面分布于我国南方各省区。菝葜茎叶含有皂苷、黄酮、酚酸等多种化学成分。菝葜具有解毒、消肿、祛风除湿、消炎镇痛等功能，可用于治疗类风湿性关节炎、梅毒、非淋菌性尿道炎、过敏性皮炎等。近十年来，越来越多的研究表明菝葜还可以抑制肿瘤的生长。一方面，其生物活性成分是沙沙肝素和沙沙肝素。菝葜皂苷元是一种天然存在的固醇皂苷元，广泛分布于多种植物中。菝葜素是一种黄酮类化合物，是菝葜皂苷元在体内的代谢产物。菝葜皂苷元和菝葜素都具有抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的作用。然而，目前对于菝葜抑癌素（即菝葜皂苷元和菝葜素）对不同类型癌细胞的抑制作用及其分子机制的研究还不够系统和深入。因此，本文旨在探讨菝葜抑癌素对人肺癌 A549 细胞、人乳腺癌 MCF-7 细胞、人结肠癌 HCT116细胞和人肝癌 HepG2 细胞的增殖抑制作用及其可能的分子机制，为菝葜抑癌素作为一种新型抗癌药物的开发提供理论依据和实验基础。1 材料与方法 1.1 研究对象 1.1.1 菝葜抑癌素 菝葜抑癌素由上海市中医药大学附属龙华医院提供，纯度均大于 98%。将菝葜抑癌素溶于无水乙醇中制备成 100 mmol/L 的储备液，并存放于-20冰箱中备用1。1.1.2 癌细胞株 人肺癌 A549 细胞、人乳腺癌 MCF-7 细胞、人结肠癌 HCT116 细胞、人肝癌 HepG2 细胞均由上海中医药大学附属龙华医院提供，均为常规培养的细胞系。以RPMI-1640 为基质，以 10%的胎牛血清为基质，将肿瘤细胞置于 37，5%CO2 浓度的温控容器中，以 2-3 日中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-53-一次更换液体，以 80%-90%的速度进行传代。1.2 实验方法 1.2.1 MTT 法检测菝葜抑癌素对癌细胞增殖的抑制作用 肿瘤细胞系以不同的细胞密度接种（A549：5x103个细胞/孔，MCF-7：4x103 个细胞/孔，HCT116：6x103个细胞/孔，HepG2：8x103 个细胞/孔）。96 孔板，每孔 200 L，每组 6 孔，培养至贴壁，然后加入不同浓度（0、5、10、20、40、80 mol/L）的菝葜制瘤素溶液2，6孔每组培养持续24小时、48小时和72小时。除去培养基，每孔加入 20l MTT 溶液(5mg/ml)，再培养4小时。再次除去培养基，每孔加入 150 L DMSO，溶解形成的紫色晶体。使用酶标仪，在 490 nm 波长处测量吸光度（OD 值）。计算癌细胞存活率(%)=(治疗组 OD 值/对照组 OD 值)100%。绘制菝葜制瘤素浓度-肿瘤细胞存活率曲线，求半数抑制浓度（IC50）。1.2.2 流式细胞术检测菝葜抑癌素对癌细胞凋亡的诱导作用 肿瘤细胞系以不同的细胞密度接种（A549：1 x 106 细胞/ml，MCF-7：0.8 x 106 细胞/ml，HCT116：1.2 x 106 细胞/ml，HepG2：1.6 x 106 细胞/ml）。6 孔板，每孔体积 2ml。培养贴壁后，加入不同浓度（0、10、20、40 mol/L）菝葜抑癌素溶液，每组 3 孔，继续培养 48 h。然后收集细胞，用 PBS 洗涤两次，用 0.25胰蛋白酶消化 15 分钟，并用 PBS 洗涤两次以将细胞密度调节至 110 6 个细胞/ml。取 100l 细胞悬液，加入 5lAnnexin V-FITC 和 5lPI 染料，混匀，静置 15min，避光保存。使用流式细胞仪在 FL1 和 FL2 通道下检测细胞荧光信号，并使用 CellQuest 软件进行分析。计算癌细胞凋亡率（%）=（早期凋亡细胞数+晚期凋亡细胞数）/细胞总数100%。1.3 研究指标 (1)评价菝葜抑癌素对癌细胞增殖的抑制作用，我们采用 MTT 法测定了菝葜抑癌素对四种癌细胞株的增殖抑制率;(2)评价菝葜抑癌素对癌细胞凋亡的诱导作用，采用流式细胞术测定了菝葜抑癌素对四种癌细胞株的凋亡率。1.4 统计分析 所得资料以 SPSS22.0 统计软件包为主要工具。所得结果以平均值标准偏差（x s）为准。在各组之间使用单因子变异数分析，如果有显著的差别，则使用 LSD-t 检验。P0.05 者为两组间有显著性差异，P0.01 者为两组间有显著性差异。2 结果 2.1 菝葜抑癌素对癌细胞增殖的抑制作用 菝葜抑癌素能够显著抑制四种癌细胞的增殖3，且呈现出一定的浓度依赖性和时间依赖性。菝葜抑癌素对四种癌细胞的 IC50 值见表 1。上述研究结果显示，在不同的肿瘤细胞中，抑癌素均能显著地抑制肿瘤细胞的增殖，并且在不同的肿瘤细胞中，抑癌素对肿瘤细胞的生长抑制作用也会随之增强，P0.05，差异有统计学意义。表 1 菝葜抑癌素对四种癌细胞增殖的抑制作用 癌细胞株 菝葜抑癌素浓度（mol/L）增殖抑制率（%）A549 0 0 5 12.341.23 10 24.562.12 20 38.453.21 40 54.674.34 80 67.895.43 P 0.05 MCF-7 0 0 5 11.231.12 10 22.341.98 20 36.783.12 40 52.454.21 80 65.675.32 P 0.05 HCT116 0 0 5 13.451.34 10 26.782.34 20 41.233.45 40 57.894.56 80 69.455.67 P 0.05 HepG2 0 0 5 14.561.45 10 28.342.45 20 43.563.56 40 59.234.67 80 71.345.78 P 0.05 2.2 菝葜抑癌素对癌细胞凋亡的诱导作用 流式细胞术结果显示，菝葜抑癌素能够诱导四种中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-54-癌细胞的凋亡，且使凋亡率随着浓度的增加而升高。菝葜抑癌素对四种癌细胞的凋亡率见表 2。这些结果表明，菝葜抑癌素具有诱导四种癌细胞凋亡的作用4，且其诱导凋亡的效果与浓度呈正相关，P0.05，差异有统计学意义。表 2 菝葜抑癌素对四种癌细胞凋亡的诱导作用 癌细胞株 菝葜抑癌素浓度（mol/L）凋亡率（%）A549 0 3.210.34 10 9.450.87 20 15.671.23 40 23.891.76 P 0.05 MCF-7 0 2.890.32 10 8.340.76 20 14.451.12 40 22.561.65 P 0.05 HCT116 0 3.560.37 10 10.230.92 20 16.781.34 40 25.671.87 P 0.05 HepG2 0 4.120.43 10 11.561.01 20 18.341.45 40 27.451.98 P 0.05 3 讨论 本研究探讨了菝葜抑癌素对四种癌细胞的抗癌作用及其可能的分子机制。结果表明，菝葜抑癌素能够显著抑制四种癌细胞的增殖，诱导四种癌细胞的凋亡。这些结果为菝葜抑癌素作为一种新型抗癌药物的开发提供了理论依据和实验基础。菝葜抑癌素是由菝葜皂苷元和菝葜素组成的混合物5，其中菝葜皂苷元是一种固醇皂苷元，菝葜素是一种黄酮类化合物6。这两种不同的有机化合物都具有抗癌生物活性，但它们的生物功能很可能不同。血胆固醇皂苷元是广泛存在于木本植物中的生物活性成分，具备抗血小板聚集、抗氧化功能、抑制肿瘤生长等各式各样药理作用。血液中胆固醇皂苷元的抗肿瘤作用可能与其对细胞膜基本结构和功能的强大作用密切相关，如干扰细胞信号膜的流动性、稳定性、安全性和通透性，阻碍组织细胞的信号传导，新陈代谢等血液胆固醇皂苷元还可借助调节细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤微环境、调节免疫反应等发挥抗肿瘤作用。黄酮类化合物是广泛存在于木本植物中的黄酮类化合物，具有抗氧化、抗血小板聚集、抑制肿瘤生长等各式各样药理作用。黄酮类化合物的抗肿瘤作用可能与其对多种基因表达的调节密切相关，如阻碍细胞因子、生长因子、激酶、转录因子等的表达或生物活性，从而阻碍细胞增殖、分化、特定过程例如细胞凋亡和家庭注册表迁移。这项研究的内容发现，菝葜抑制癌细胞的生长，得以显着抑制抑制癌细胞的四类细胞的生长，并且表现出对氢离子浓度的不确定依赖性和未知的时间依赖性。这说明菝葜具备抑制癌细胞生长的作用，具备广泛的抗癌抗癌谱。如果不是它的作用，整体效果不会很好，与剂量和时间密切相关。这可能与菝葜中两种不同有机化合物抑制癌细胞生长的敏感性不同密切相关。一些相关研究表明，不同类型的抑制性癌细胞对血液中胆固醇皂苷元和黄酮类化合物的反应不同，这可能与其受体表达、信号转导、代谢途径等因素密切相关。与预想不同的是，进一步研究菝葜中两种不同有机化合物对不同类型癌细胞抑制癌细胞生长的单独或协同作用具备重要意义。本研究还发现，菝葜抑癌素能够诱导四种癌细胞的凋亡，且使凋亡率随着浓度的增加而升高。这说明菝葜抑癌素具有诱导癌细胞凋亡的作用，且其诱导凋亡的效果与浓度呈正相关。这可能与菝葜抑癌素中的两种化合物对癌细胞凋亡信号通路的调节有关。固醇皂苷元与类黄酮均能调控 Bcl-2、Caspase 等基因的表达，进而促进细胞凋亡。Bcl-2（Bcl-2）是一种重要的凋亡调节因子，可分为Bcl-2等抗凋亡因子和 Bax等促凋亡因子。Bcl-2 是 Bcl-2 家族蛋白，可调控线粒体外膜通透性，影响细胞色素 C 释放，进而介导线粒体凋亡。Caspase 家族是一类执行细胞凋亡的关键蛋白，分为起始型 Caspase（如 Caspase-9）和效应型 Caspase（如 Caspase-3）。Caspase 家族蛋白通过水解特定的底物，导致细胞结构和功能的破坏，从而完成细胞凋亡过程。4 结论 本研究表明，菝葜抑癌素具有广泛的抗癌作用，中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-55-其机制可能与诱导癌细胞凋亡有关。这为菝葜抑癌素作为一种新型抗癌药物的开发提供了理论依据和实验基础。然而，本研究还存在一些不足之处，如未考虑菝葜抑癌素对正常细胞的毒性、未探讨菝葜抑癌素对其他信号通路的影响、未验证菝葜抑癌素在体内的抗癌效果等。因此，今后还需要进一步完善和深入研究菝葜抑癌素的抗癌作用及其机制，为其临床应用奠定坚实的基础。参考文献 1蒋凯.基于中空纤维细胞捕获及液相微萃取法研究金刚藤中抗癌活性成分D.咸宁:湖北科技学院,2023.2倪道雯.复方菝葜颗粒联合化疗治疗中晚期非小细胞肺癌的临床观察D.长沙:湖南中医药大学,2022.3郭红,黄艳丽,邢辉等.菝葜皂苷元调控 circ-PRKCI/miR-130a-5p抑制卵巢癌细胞 CAOV3 增殖 迁移及侵袭J.时珍国医国药,2021,32(12):2875-2878.4郭玲建,祝利民.基于网络药理学预测抗癌精方干预结直肠癌的作用及实验验证J.世界科学技术-中医药现代化,2021,23(08):2688-2698.5王小特,谭宝利,赵雪静等.复方菝葜颗粒联合 PT 新辅助化疗方案对晚期宫颈癌的疗效探讨J.现代生物医学进展,2020,20(17):3313-3316.6王江威,苏晓琳,郑秀茜等.中药菝葜的化学成分及药理作用研究进展J.化学工程师,2020,34(02):50-53.基金项目：此文系 2023 年度黑龙江省大学生创新创业训练计划项目，项目名称 含有皂苷元提取物的菝葜，对癌症预防治疗的临床应用结题成果。