高三生物工程.pptx

现代生物科技专题现代生物科技专题现代生物科技专题现代生物科技专题1.2基因工程的基本操操 作作 程程 序序目的基因的获取基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞目的基因的表达和检测基因工程的基本操作程序1 1 1 1、从、从、从、从基因文库基因文库基因文库基因文库中获取中获取中获取中获取(基因序列未知基因序列未知基因序列未知基因序列未知)基因文库基因文库基因组文库：基因组文库：部分基因文库如：部分基因文库如：cDNAcDNA文库文库文库文库一.目的基因的获取包含一种生物的包含一种生物的全部基因全部基因包含一种生物的部分基因包含一种生物的部分基因2 2 2 2、利用、利用、利用、利用PCRPCRPCRPCR技术技术技术技术扩增目的基因扩增目的基因扩增目的基因扩增目的基因PCRPCR技术：聚合酶链式反应技术：聚合酶链式反应目的：扩增目的：扩增DNA5 5/3 3/G GG GT TC C3 3/5 5/G GA AC CC C5 5/3 3/引物引物G GG G高温高温变性变性低温低温复性复性中温中温延伸延伸5 5/3 3/A AG G引物引物5 5/3 3/5 5/3 3/90-9555-6570-75过程：过程：a a、DNADNA变性变性（90-9590-95）：双链）：双链DNADNA模板模板 在热作用下，在热作用下，_断裂，形成断裂，形成_b b、复性、复性（55-6555-65）：系统温度降低，引）：系统温度降低，引 物物与与DNADNA模板结合，形成局部模板结合，形成局部_。c c、延伸、延伸（70-7570-75）：在）：在TaqTaq酶的作用下，酶的作用下，合成与模板互补的合成与模板互补的_。氢键氢键单链单链DNADNA双链双链DNADNA链链PCR扩增仪扩增仪 概念：概念：PCRPCR全称为全称为_，是一项，是一项 在生物在生物_复制复制_的核酸合成技术的核酸合成技术 条件：条件：_、_、_ _、_._.等等原理：原理：_方式：以方式：以_方式扩增，即方式扩增，即_（n n为扩增循为扩增循 环的次数）环的次数）结果：结果：聚合酶链式反应聚合酶链式反应体外体外特定特定DNADNA片段片段DNADNA复制复制四种脱氧核苷酸四种脱氧核苷酸引物引物DNADNA聚合酶聚合酶指数指数2 2n n使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增要有一段已知核苷酸序列的目的基因要有一段已知核苷酸序列的目的基因P PC CR R技技术术二二 基因表达载体基因表达载体的构建基因表达载体基因表达载体的模式图的模式图的模式图的模式图抗生素抗生素抗生素抗生素抗性抗性抗性抗性基因基因基因基因基因表达除含有基因表达除含有基因表达除含有基因表达除含有目目目目的基因的基因的基因的基因外，还需要外，还需要外，还需要外，还需要哪些元件：哪些元件：哪些元件：哪些元件：启动子启动子启动子启动子终止子终止子终止子终止子标记基因标记基因标记基因标记基因1.基因表达载体的组成基因表达载体的组成细胞的基因结构细胞的基因结构编码区编码区编码区编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区非编码区与与RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点RNA聚合酶是一种聚合酶是一种蛋白蛋白质质，能，能识别并与调控序识别并与调控序列列中的中的结合位点结合结合位点结合，能能催化催化DNA转录为转录为RNA启动子终止子启动子：启动子：位于基因的首端的一段特殊的位于基因的首端的一段特殊的DNADNA片断，它是片断，它是RNARNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNAmRNA，最终获得蛋白质，最终获得蛋白质终止子：终止子：位于基因的尾端的一段特殊的位于基因的尾端的一段特殊的DNADNA片断，能终止片断，能终止DNADNA的转录的转录起始密码子？终止密码子？起始密码子？终止密码子？细胞的基因结构细胞的基因结构与与RNA聚合酶聚合酶结合位点结合位点RNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶A G G T C A C G T C GA G G T C A C G T C GT C C A G T G C A G CT C C A G T G C A G CA G G U C A C G U C GA G G U C A C G U C GRNARNA聚合酶聚合酶聚合酶聚合酶启动子终止子基因表达载体的组成：基因表达载体的组成：目的：使目的基因在受体细胞中稳定存目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。的基因能够表达和发挥作用。基因表达载体的构建基因表达载体的构建a a、目的基因、目的基因b b、启动子、启动子c c、终止子、终止子d d、标记基因、标记基因e、复制原点复制原点基因的运载体、目的基因、启动子、终止子和基因的运载体、目的基因、启动子、终止子和标记基因标记基因 等都是等都是DNA片断，如何将它们连接起来？片断，如何将它们连接起来？质粒质粒DNADNA分子分子一个一个切口切口两个两个黏性末端黏性末端两个两个切口切口获得目的基因获得目的基因DNA DNA 连接酶连接酶重组重组DNADNA分子（重组质粒）分子（重组质粒）同一种同一种 限制酶限制酶 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的基因重组的过程。上是不同来源的基因重组的过程。2 基因表达载体的构建过程基因表达载体的构建过程质粒中插入启动子、终止子和标记基因质粒中插入启动子、终止子和标记基因 等等 DNA片断，也是同样的重组方法片断，也是同样的重组方法三 将目的基因导入受体细胞 转化 目的基因进入受体细胞内，并且在目的基因进入受体细胞内，并且在 受体细胞内维持稳定和表达的过程。受体细胞内维持稳定和表达的过程。将目的基因导入受体细胞农杆菌转化法农杆菌转化法基因枪法基因枪法花粉管通道法花粉管通道法受体受体细胞细胞植物细胞植物细胞植物细胞植物细胞动物细胞动物细胞动物细胞动物细胞原核细胞原核细胞原核细胞原核细胞显微注射技术显微注射技术显微注射技术显微注射技术感受态法感受态法感受态法感受态法1 农杆菌转化法适用于适用于适用于适用于双子叶植物双子叶植物双子叶植物双子叶植物裸子植物裸子植物裸子植物裸子植物适用于适用于适用于适用于单子叶植物单子叶植物单子叶植物单子叶植物基因枪法基因枪法胚珠花药花丝柱头花柱子房壁子房雄蕊雌蕊花粉管通道法花粉管通道法适用于适用于适用于适用于被子植物被子植物被子植物被子植物 2 2将目的基因导入将目的基因导入动物细胞动物细胞方法：显微注射法方法：显微注射法程序：程序：目的基因表达载体提纯目的基因表达载体提纯 取卵（受精）取卵（受精）显微注射显微注射 受精卵受精卵 新性状动物新性状动物 3 3将目的基因导入将目的基因导入微生物细胞微生物细胞原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少方法：方法：用用Ca2+处理细胞处理细胞 感受态细胞感受态细胞 表表达载体与感受态细胞混合达载体与感受态细胞混合 感受态感受态细胞吸收细胞吸收DNA分子分子4 目的基因的表达和检测接种实验接种实验接种实验接种实验抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法抗原抗体杂交法DNA-RNADNA-RNA分子杂交法分子杂交法分子杂交法分子杂交法DNADNA分子杂交法分子杂交法分子杂交法分子杂交法受体是否具有受体是否具有受体是否具有受体是否具有转基因特征转基因特征转基因特征转基因特征个体个体个体个体水平水平水平水平目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否翻译目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否转录目的基因是否导入目的基因是否导入目的基因是否导入目的基因是否导入分子分子分子分子水平水平水平水平方法方法方法方法检测对象检测对象检测对象检测对象DNA分子杂交分子杂交 采用一定的技术手段，将两种生物的采用一定的技术手段，将两种生物的DNADNA分分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。列的部位，仍然是两条游离的单链。A-A-3232P PT-T-C-G-T-G3232P P-T-T-A-A-C-AX1C-C-A-G-T-T-A-X2-G-G-T-C-A-A-TY1A-A-T-T-C-G-T-Y1-T-T-A-A-G-C-A探针探针探针探针 待测待测待测待测DNAXDNAX 待测待测待测待测DNAYDNAY待测待测DNAY与探针与探针DNA相同相同检测目的基因是否导入受体细胞检测目的基因是否导入受体细胞目的目的目的目的DNADNA片段片段片段片段检测目的基因是否转录出了检测目的基因是否转录出了mRNAmRNA 用上述用上述探针探针和转基因生物的和转基因生物的mRNAmRNA杂交杂交,若出现若出现杂交带杂交带,表明目的基因转录出了表明目的基因转录出了mRNAmRNA目的基因蛋白质小鼠体内抗体目的基因受体细胞蛋白质抗原抗原杂交分子检测目的基因是否检测目的基因是否翻译成蛋白质翻译成蛋白质-抗原抗体杂交抗原抗体杂交个体个体生物学水平生物学水平抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等归纳:基因工程的基本操作程序1.1.获取目的基因获取目的基因u从基因文库从基因文库u利用利用PCRPCRu化学方法人工合成化学方法人工合成2.2.构建基因表达载体构建基因表达载体u目的基因、启动子、终止子、标记基因目的基因、启动子、终止子、标记基因3.3.将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞u农杆菌转化法、显微注射法、农杆菌转化法、显微注射法、感受态法感受态法感受态法感受态法4.4.目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定u检测：是否插入、转录、翻译检测：是否插入、转录、翻译u鉴定：鉴定：