淀粉酶的分离纯化-上-——浸提盐析透析浓缩.pptx

一、实验目的一、实验目的 1、掌握蛋白质分离纯化的一般程序。、掌握蛋白质分离纯化的一般程序。2、掌握盐析、透析、浓缩的基本原理与操作。、掌握盐析、透析、浓缩的基本原理与操作。第1页/共12页二、实验原理二、实验原理 蛋白质作为溶液稳定存在的两大因素：蛋白质作为溶液稳定存在的两大因素：蛋白质作为溶液稳定存在的两大因素：蛋白质作为溶液稳定存在的两大因素：1.1.蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出；的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出；的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出；的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出；2.2.蛋白质颗粒表面可带相同电荷颗粒之间相互排蛋白质颗粒表面可带相同电荷颗粒之间相互排蛋白质颗粒表面可带相同电荷颗粒之间相互排蛋白质颗粒表面可带相同电荷颗粒之间相互排斥不易聚集沉淀，也可以起稳定颗粒的作用。斥不易聚集沉淀，也可以起稳定颗粒的作用。斥不易聚集沉淀，也可以起稳定颗粒的作用。斥不易聚集沉淀，也可以起稳定颗粒的作用。若去除蛋白质颗粒这两个稳定因素，蛋白质极易若去除蛋白质颗粒这两个稳定因素，蛋白质极易若去除蛋白质颗粒这两个稳定因素，蛋白质极易若去除蛋白质颗粒这两个稳定因素，蛋白质极易从溶液中沉淀。从溶液中沉淀。从溶液中沉淀。从溶液中沉淀。第2页/共12页 盐析是一种与蛋白质的沉淀的性质相关的分离方法：它用盐析是一种与蛋白质的沉淀的性质相关的分离方法：它用盐析是一种与蛋白质的沉淀的性质相关的分离方法：它用盐析是一种与蛋白质的沉淀的性质相关的分离方法：它用硫酸铵、硫酸钠等中性盐来破坏蛋白质在溶液中稳定存在的硫酸铵、硫酸钠等中性盐来破坏蛋白质在溶液中稳定存在的硫酸铵、硫酸钠等中性盐来破坏蛋白质在溶液中稳定存在的硫酸铵、硫酸钠等中性盐来破坏蛋白质在溶液中稳定存在的两大因素，故能使蛋白质发生沉淀。两大因素，故能使蛋白质发生沉淀。两大因素，故能使蛋白质发生沉淀。两大因素，故能使蛋白质发生沉淀。不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，故盐析所不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，故盐析所不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，故盐析所不同蛋白质分子颗粒大小不同，亲水程度不同，故盐析所需要的盐浓度不同，从而将蛋白质分离。需要的盐浓度不同，从而将蛋白质分离。需要的盐浓度不同，从而将蛋白质分离。需要的盐浓度不同，从而将蛋白质分离。如用硫酸铵分离清蛋白和球蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液如用硫酸铵分离清蛋白和球蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液如用硫酸铵分离清蛋白和球蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液如用硫酸铵分离清蛋白和球蛋白，在半饱和的硫酸铵溶液中，球蛋白即可从混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在饱中，球蛋白即可从混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在饱中，球蛋白即可从混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在饱中，球蛋白即可从混合溶液中沉淀析出除掉，而清蛋白在饱和硫酸铵中才会沉淀。和硫酸铵中才会沉淀。和硫酸铵中才会沉淀。和硫酸铵中才会沉淀。盐析的优点是不会使蛋白质发生变性。盐析的优点是不会使蛋白质发生变性。盐析的优点是不会使蛋白质发生变性。盐析的优点是不会使蛋白质发生变性。第3页/共12页三、仪器与试剂三、仪器与试剂1、缓冲液：、缓冲液：0.05M磷酸氢钠缓冲液（磷酸氢钠缓冲液（PH7.0），含），含5mmol/l 2-巯基乙醇，巯基乙醇，1mmol/lEDTA,0.5mmol/l，PMSF。2、仪器：、仪器：离心机，量筒，研钵，离心机，量筒，研钵，第4页/共12页四、实验内容四、实验内容第5页/共12页（一）浸提（一）浸提 采用缓冲液从固态粗酶粉中浸提粗酶液。采用缓冲液从固态粗酶粉中浸提粗酶液。称取粗酶粉称取粗酶粉2.5g，加入，加入20ml缓冲液，研磨缓冲液，研磨5-10min，3500rpm离心分离离心分离10min，收集上清液。，收集上清液。为提高收率，沉渣可加入适量缓冲液再浸提为提高收率，沉渣可加入适量缓冲液再浸提12次，离次，离心，合并上清液，即为粗酶液，测定体积。心，合并上清液，即为粗酶液，测定体积。测定粗酶液的酶活力，计算测定粗酶液的酶活力，计算总酶活总酶活1(酶活力酶活力体积体积)第6页/共12页（二）分级盐析（二）分级盐析 根据粗酶液体积，计算出达到相应饱和度需要加入的硫根据粗酶液体积，计算出达到相应饱和度需要加入的硫酸铵的量。慢慢的向粗酶液中加入硫酸铵至酸铵的量。慢慢的向粗酶液中加入硫酸铵至30%饱和度，静饱和度，静置置20min后，在后，在12000rpm的转速下离心的转速下离心20min，分别收集，分别收集上清液与上清液与沉淀沉淀A。测量上清液体积，再慢慢向上清液中加入硫酸铵至测量上清液体积，再慢慢向上清液中加入硫酸铵至70%饱和度，静置饱和度，静置20min后，在后，在12000rpm的转速下离心的转速下离心20min，分别收集上清液与，分别收集上清液与沉淀沉淀B。按同样的方法再次调节硫酸铵饱和度按同样的方法再次调节硫酸铵饱和度100%，静置，静置20min后，在后，在12000rpm的转速下离心的转速下离心20min，分别收集上清液与，分别收集上清液与沉淀沉淀C。第7页/共12页 收集每一饱和度下沉淀出的蛋白质收集每一饱和度下沉淀出的蛋白质（沉淀（沉淀A,B,C），），分别用分别用5ml的缓冲液溶解的缓冲液溶解.测定组分测定组分A,B,C的酶活力和蛋白质浓度，以确定淀粉的酶活力和蛋白质浓度，以确定淀粉酶主要存在于哪一级的沉淀中，并计算组分酶主要存在于哪一级的沉淀中，并计算组分B的收率。的收率。如果需要，可将采用更细的分级。如果需要，可将采用更细的分级。组分组分组分组分B B的收率的收率的收率的收率=（B B的酶活力的酶活力的酶活力的酶活力BB的体积）的体积）的体积）的体积）/总酶活总酶活总酶活总酶活1 1 100%100%第8页/共12页（三）透析（三）透析1、透析袋的预处理：、透析袋的预处理：透析袋的处理主要是除去污染物，特别是重金属和蛋白透析袋的处理主要是除去污染物，特别是重金属和蛋白酶等对蛋白质有毒害作用的物质。可在酶等对蛋白质有毒害作用的物质。可在0.1mol/l的的EDTA溶溶液中煮液中煮30min，再换用蒸馏水煮，再换用蒸馏水煮7次，每次次，每次20分钟。分钟。第9页/共12页2、透析：、透析：将所收集的具有酶活力的组分（将所收集的具有酶活力的组分（组分组分B），放入透析袋），放入透析袋，置于清水中，电磁搅拌，透析，置于清水中，电磁搅拌，透析24h，中间换水，中间换水3-4次。为次。为了防止酶失活，整个透析系统应低温放置。了防止酶失活，整个透析系统应低温放置。铵离子是否除尽采用铵离子是否除尽采用纳氏试剂纳氏试剂检测。检测。第10页/共12页（四）浓缩（四）浓缩 透析后，透析袋中液体浓度低，体积较大，可用蔗糖透析后，透析袋中液体浓度低，体积较大，可用蔗糖或或PEG6000包埋浓缩至包埋浓缩至1-1.5ml。取出。取出0.5ml测定酶活力，测定酶活力，其余的置于冰箱中备下次实验使用。其余的置于冰箱中备下次实验使用。计算酶活力的收率。计算酶活力的收率。第11页/共12页附录附录:调整硫酸铵溶液饱和度计算表（调整硫酸铵溶液饱和度计算表（25）第12页/共12页