苦参碱对人口腔鳞状细胞癌细胞抑制作用的体外研究.pdf

北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024，Vol.32，No.277口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔颌面部最常见的癌症，好发于舌、牙龈、颊、唇等颌面部，患者的 5 年生存率约50%1,2，术后复发、组织浸润、淋巴结转移等使得患者死亡率仍居高不下。苦参是我国传统中药材，具有清热利湿，抗菌消炎的功效，苦参碱是一种从苦参的根和茎中提取的生物碱。苦参已被证实具有抗肝纤维化、减轻心肌损伤、抗炎抗菌等多种药理作用3。且有研究表明苦参碱对肝癌、肺癌等多种肿瘤具有良好的抗肿瘤效果4,5。然而苦参碱对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响报道较少。本研究通过苦参碱处理口腔鳞状细胞癌 CAL27 细胞系，探讨苦参碱对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力等恶性生物学行为的影响，以期为临床治疗提供依据。材料和方法1.细胞株和细胞培养 人口腔鳞状细胞癌细胞株 CAL27 由北京口腔医学研究所提供。CAL27 细胞于含 10%胎牛血清、100 U/mL 青霉素、0.1 mg/mL 链霉素的 DMEM 高糖培养基，37，5%CO2孵箱内培养，培养至对数生长期进行实验。苦参碱对人口腔鳞状细胞癌细胞抑制作用的体外研究迟鹏 宿颖 吴堰霖 文金林 陈佳慧 张辛燕【摘要】目的 探讨苦参碱对口腔鳞癌细胞系 CAL27 生物学行为的影响。方法 体外培养 CAL27 细胞至对数生长期，采用不同浓度苦参碱处理细胞 24 h、48 h、72 h，四甲基偶氮唑盐法检测其对细胞增殖的影响并计算半数抑制浓度，划痕实验检测苦参碱对细胞迁移能力的影响，Transwell 实验检测苦参碱对细胞侵袭能力的影响，克隆形成实验检测苦参碱对细胞克隆形成能力的影响。结果 应用苦参碱可抑制 CAL27 细胞的增殖、迁移、侵袭和克隆形成能力。结论 苦参碱可以抑制人口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力，有望成为治疗口腔鳞状细胞癌的新型辅助药物。【关键词】苦参碱；口腔鳞癌；增殖；迁移；侵袭【中图号】R739.8【文献标识码】A【DOI】10.20049/j.bjkqyx.1006-673X.2024.02.001In vitro study on the inhibitory effect of Matrine on oral squamous cell carcinoma cells CHI Peng,SU Ying,WU Yan-lin,WEN Jin-lin,CHEN Jia-hui,ZHANG Xin-yan.Beijing Institute of Dental Research,Capital Medical University School of Stomatology,Beijing 100050,China【Abstract】Objective To investigate the effect of Matrine on biological behaviors of CAL27 oral squamous cell carcinoma cell line.Methods In this study,CAL27 cells were cultured in vitro and treated with different concentrations of Matrine for 24 h,48 h and 72 h.Cell proliferation was assessed using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT)assay and the half-maximal inhibitory concentration(IC50)was determined.Additionally,the impact of Matrine on cell migration capacity was evaluated through scratch assays,while its effect on cell invasion capability was detected using Transwell assays.Furthermore,the influence of Matrine on the colony-forming ability of the cells was analyzed through clonogenic formation assays.Results Matrine inhibited the proliferation,migration,invasion,and clonogenic formation ability of CAL27 cells in a concentration-dependent manner.Conclusions Matrine demonstrates the potential to inhibit the biological behaviors of proliferation,migration,invasion and clonogenic formation in human oral squamous cell carcinoma cells.It holds promise as a novel therapeutic agent for the treatment of oral squamous cell carcinoma.【Key words】Matrine;Oral squamous cell carcinoma;Proliferation;Migration;Invasion 基金项目：国家自然科学基金（81772868）；北京市自然科学基金（7202057）作者单位：100050 北京 首都医科大学口腔医学院口腔医学研究所通信作者：张辛燕，E-mail：，电话：[phone]基础研究北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024，Vol.32，No.2782.主要试剂苦参碱（成都曼思特生物有限公司）；DMEM高糖培养基，0.25%胰酶（Gibco）；胎牛血清（四季青）；双抗，磷酸盐缓冲液（PBS）（Hyclone，美国）；四甲基偶氮唑盐（MTT）（Sigma，美国）；二甲基亚砜（DMSO）（北京国药集团化学试剂有限公司）；Matrigel 胶，Transwell 小室（BD，美国）。3.实验方法MTT 法检测细胞增殖能力：将 CAL27 细胞培养至对数生长期后胰酶消化，重悬，将细胞悬液调整浓度至 3104/mL 后接种至 96 孔培养板，每孔加入200 L 细胞悬液，每组细胞设 6 个复孔，同时设置只加培养基的调零孔，边缘孔用 200 L 无菌 PBS 填充。CAL27 各组细胞接种 3 块 96 孔板，将 96 孔板置于 37，5%CO2恒温培养箱中过夜。第 2 天待细胞贴壁后分别加入终浓度为 0.125、0.25、0.5、1.0、2.0 mmol/L 的苦参碱溶液，置于 37，5%CO2的孵箱中分别孵育 24 h、48 h、72 h，于每孔加入20 L MTT 溶液（5 mg/mL），继续孵育 4 h 后终止培养，吸去孔内培养液，每孔加入 150 L 二甲基亚砜，置摇床上避光低速振荡 10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪波长 490 nm 处测量各孔的吸光度值（OD 值）。划痕实验：实验设置对照组、苦参碱 0.5 mmol/L组、苦参碱 1 mmol/L 组三组，每种细胞设 3 个复孔。用记号笔在 6 孔板背面用直尺划横线，每道约相隔 1 cm，横穿过孔。于 6 孔板中接种细胞密度为1106个/mL的CAL27细胞。置于37，5%CO2恒温培养箱中培养过夜。第 2 天用 1 mL 枪头沿着直尺，垂直于背面的横线在 6 孔板内划线。无菌PBS 洗涤细胞 3 次，随后将孔内培养基更换成无血清的培养基，同时按照分组加入苦参碱，使用显微镜拍照并用记号笔标记每次拍照时的光圈位置、标号。每个复孔取45个位置拍照。将细胞置于37，5%CO2培养箱中培养 24 h、48 h 后，分别使用显微镜在对应的位置拍照。使用 ImageJ 软件分析图像，统计数据。细胞相对迁移率=（初始划痕宽度-终末划痕宽度）/初始划痕宽度 100%。Transwell 实验：实验设置对照组、苦参碱0.5 mmol/L 组、苦参碱 1 mmol/L 组三组，每组设置 3 个复孔。取对数生长期的 CAL27 细胞接种于60 mmol/L 培养皿中，37，5%CO2恒温培养箱中培养过夜。第 2 天按分组加入苦参碱后继续孵育 48 h。胰酶消化细胞，离心后用含 2%BSA 的无血清培养基重悬，调整细胞浓度为 1106个/mL。将 Transwell 小室放入 24 孔板中（Transwell 侵袭实验将 Matrigel 胶与含 2%BSA 的无血清培养基按 1:6的浓度提前铺至 Transwell 小室底部，4 h 凝固后备用），于下室加入含 10%FBS的DMEM培养基900 L，取细胞悬液 300 L 加入 Transwell 上室中。37，5%CO2培养箱中培养 48 h 后终止培养。弃培养基，4%多聚甲醛固定 10 min，棉签擦去上室内的细胞及 Matrigel 胶，结晶紫染色 20 min，用 PBS 冲洗浸泡。每孔选 5 个不同的区域，在 400 倍显微镜下拍照并计数穿过的细胞数。克隆形成实验：实验设对照组、苦参碱0.5 mmol/L组、苦参碱 1 mmol/L 组三组，每组设置 3 个复孔。将对数生长期的 CAL27 细胞接种于 6 孔板，每孔700 个细胞，37，5%CO2恒温培养箱中培养过夜。按分组加入终浓度为 0.5 mmol/L、1 mmol/L 的苦参碱后于恒温培养箱中连续培养 14 天，每 3 天观察并换液。14 天后终止培养，4%多聚甲醛固定，结晶紫染色，计数细胞集落(细胞数 50 个为一个集落)，并计算克隆形成率。克隆形成率=(克隆形成数/接种细胞数)100%。4.统计分析应用 SPSS17.0 进行统计分析。采用 ANOVA检验，LSD 两两比较，以=0.05 作为检验水准。结 果1.苦参碱对 CAL27 细胞增殖活性的影响由图 1 可知，应用梯度浓度苦参碱处理 CAL27细胞，各组 MTT 实验的检测结果显示，与空白对照组相比，经 0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/L 处理注：*：与空白对照组相比，P0.01；*：与空白对照组相比，P0.001图 1 不同浓度苦参碱对 CAL27 细胞增殖活性的影响北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024，Vol.32，No.279后的细胞，细胞活力逐渐降低，结果具有统计学差异（P0.01），且存在浓度和时间依赖性。苦参碱作用于CAL27 细胞 24 h 和48 h 的 IC50值分别为 1.29 mmol/L 和 0.95 mmol/L，因 此选用 0.5 mmol/L 和 1 mmol/L 的苦参碱进行后续实验。2.苦参碱对 CAL27 细胞迁移能力的影响划痕实验的结果显示，对照组细胞 24 h 迁移率是（8.22.4）%，0.5 mmol/L组是（4.61.8）%，1 mmol/L组 是（3.32.0）%，0.5 mmol/L 组、1 mmol/L 组与对照组相比，差异具有统计学意义（P 0.05）。对照组细胞 48 h 迁移率是（15.54.5）%，0.5 mmol/L组是（7.73.1）%，1 mmol/L组是（3.92.0）%。0.5 mmol/L 组、1 mmol/L 组与对照组相比，差异具有统计学意义（P0.001），且 0.5 mmol/L 组与1 mmol/L 组之间存在统计学差异（P0.01）（图 2）。结果表明苦参碱能抑制 CAL27 细胞的迁移能力，且呈浓度和时间依赖性。3.苦参碱对 CAL27 细胞侵袭能力的影响Transwell 实验的结果显示（图 3），培养 48 h 后，对照组每个视野穿过的细胞数为（183.331.3）个，与 0.5 mmol/L 组（125.516.0）个 与 1 mmol/L 组（81.99.46）个相比，每个视野穿过的细胞数减少，差异具有统计学意义（P0.001），1 mmol/L 组穿过的细胞数最少，与 0.5 mmol/L 组之间存在统计学差异（P0.001）。苦参碱能抑制 CAL27 细胞的体外侵袭能力。4.苦参碱对 CAL27 细胞克隆形成能力的影响克隆形成实验的结果显示，对照组细胞的集 落 形 成 数 为（34.52.8）%，0.5 mmol/L 组 为（24.44.5）%，1 mmol/L 组为（15.62.1）%。与对照组相比，0.5 mmol/L 与 1 mmol/L 细胞的集落形成数减少，且细胞集落变小，差异具有统计学意义（P0.01），1 mmol/L 组细胞的克隆形成集落最少，与 0.5 mmol/L 组相比差异有统计学意义（P0.05）（图 4）。表明苦参碱能抑制 CAL27 细胞的克隆形成能力，且存在浓度依赖性。讨 论口腔癌发病率在全球恶性肿瘤中排 16 位，其中 90%为口腔鳞癌6。目前针对口腔鳞癌的治疗方法主要为手术切除和放化疗，尽管这些治疗提高了生存率，但术后复发和耐药性使口腔癌预后仍不太理想。因此，开发副作用少的辅助治疗手段以提高口腔癌的预后成为迫切需要。已有研究发现苦参碱对肝癌、肺癌、乳腺癌、注：*：0.5 mmol/L 组与 1 mmol/L 组相比，P 0.01；*：与空白对照组相比，P 0.001图 2 苦参碱对 CAL27 细胞不同时间迁移程度的影响注：*：与空白对照组相比，0.5 mmol/L 与 1 mmol/L 相比，P 0.001图 3 苦参碱对 CAL27 细胞侵袭能力的影响北京口腔医学 2024年第32卷第2期 Beijing Journal of Stomatology April 2024，Vol.32，No.280结肠癌均存在不同程度的抑制作用。本实验拟在探讨不同浓度的苦参碱对口腔鳞癌细胞生物学行为的影响。本研究中发现，应用不同浓度苦参碱处理CAL27 细胞系后，CAL27 细胞增殖能力受到不同程度的抑制，并且呈剂量和时间依赖性。有研究表明苦参碱在结直肠癌中可通过降低 P38 信号通路的活性来抑制结直肠癌细胞的增殖能力7。在人肺腺癌细胞中，苦参碱可通过 P549/P53/PCNA/EIF21E信号通路抑制人肺腺癌细胞 A4 的增殖8。此外，苦参碱可通过抑制 PI3K/AKT 通路，抑制肝细胞癌恶性转化，并诱导其向肝干细胞分化9。最近研究表明，Src 蛋白为苦参碱的直接靶蛋白，为癌细胞中苦参碱的重要靶标，苦参碱可通过阻断 Src 激酶结构域中 Tyr419 的自磷酸化，以非 ATP 竞争性方式抑制Src 激酶活性10，除增殖能力外，恶性肿瘤的转移和侵袭能力也是影响预后的重要因素。有研究表明，苦参碱能通过 NF-B 信号通路下调 MMP-2/9 来抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭11，此外应用苦参碱处理人胶质瘤细胞后，能够抑制 E-cadherin 表达并且增加 N-cadherin 表达，调控上皮-间充质转化12。本研究实验结果显示，经苦参碱处理后，CAL27 细胞系的迁移，侵袭，克隆形成能力均受到了不同程度的抑制，且呈现一定剂量依赖性。苦参碱作用于多种肿瘤细胞后对其生物学行为的影响结果和我们的实验结果相一致，然而该研究其具体的调控机制仍需进一步研究。本研究表明，苦参碱能够抑制口腔鳞癌细胞的增殖能力、迁移能力、侵袭能力和克隆形成能力，从而抑制肿瘤的进展，这可能为口腔癌的辅助治疗提供新的思路。参 考 文 献 1 Siegel RL,Miller KD,Wagle NS,et al.Cancer statistics,2023.CA Cancer J Clin,2023,73(1):17-48.2 吴堰霖,宿颖,尹盼盼,等.干扰素诱导人口腔鳞癌细胞建立体外PD-L1高表达细胞模型及其对细胞生物学行为的影响.北京口腔医学,2022,30(5):305-309.3 Lin Y,He F,Wu L,et al.Matrine exerts pharmacological effects through multiple signaling pathways:a comprehensive review.Drug Des Devel Ther,2022,16:533-569.4 Hu G,Cao C,Deng Z,et al.Effects of matrine in combination with cisplatin on liver cancer.Oncol Lett,2021,21(1):66.5 Dong C,Yang L,Zhao G.Circ-PGAM1 enhances matrine resistance of non-small cell lung cancer via the miR-326/CXCR5 axis.Cancer Biother Radiopharm,2022.6 Sung H,Ferlay J,Siegel RL,et al.Global cancer statistics 2020:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.CA Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.7 Ren H,Zhang S,Ma H,et al.Matrine reduces the proliferation and invasion of colorectal cancer cells via reducing the activity of p38 signaling pathway.Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2014,46(12):1049-1055.8 Lu Z,Xiao Y,Liu X,et al.Matrine reduces the proliferation of A549 cells via the p53/p21/PCNA/eIF4E signaling pathway.Mol Med Rep,2017,15(5):2415-2422.9 Liu Y,Qi Y,Bai Z H,et al.A novel matrine derivate inhibits differentiated human hepatoma cells and hepatic cancer stem-like cells by suppressing PI3K/AKT signaling pathways.Acta Pharmacol Sin,2017,38(1):120-132.10 Zhang X,Xu H,Bi X,et al.Src acts as the target of matrine to inhibit the proliferation of cancer cells by regulating phosphorylation signaling pathways.Cell Death Dis,2021,12(10):931.11 Huang H,Du T,Xu G,et al.Matrine suppresses invasion of castration-resistant prostate cancer cells by downregulating MMP-2/9 via NF-kappaB signaling pathway.Int J Oncol,2017,50(2):640-648.12 Wang Z,Wu Y,Wang Y,et al.Matrine inhibits the invasive properties of human glioma cells by regulating epithelial-to-mesenchymal transition.Mol Med Rep,2015,11(5):3682-3686.（2023 年 10 月 12 日收稿）注：*：0.5 mmol/L 组与 1 mmol/L 组相比，P0.05；*：与空白对照组相比，P0.01；*：与空白对照组相比，P0.001图 4 苦参碱对 CAL27 细胞克隆形成能力的影响