生物学实验技术市公开课一等奖百校联赛特等奖课件.pptx

第一章 绪论第2页生物科学成为当今世界自然科学热点和重点，主要因为两方面原因：（1）二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中地位发生了革命性改变；（2）建立在试验室研究基础上生物技术发展为人类带来了巨大利益和财富。生物技术将是未来经济发展新动力第一次技术革命 工业革命解放人双手第二次技术革命 信息技术扩展人大脑第三次技术革命 生物技术改造生命本身第3页生物技术显著特点高技术（精细和密集复杂技术）高投入（尤其是前期科研投入高）高利润第4页1982年，国际合作与发展组织定义为：生物技术是应用自然科学及工程学原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将物料进行加工以提供产品为社会服务技术。美国政府技术顾问委员会(OAT)定义是：应用生物或来自生物体物质制造或改进一个商品技术，其还包含改良有主要经济价值植物与动物和利用微生物改良环境技术。该定义强调了生物技术商品属性。1、生物技术定义、主要内容和发展概况l生物技术定义第5页当代生物技术包含当代生物技术包含vv1 1、基因工程、基因工程vv2 2、细胞工程、细胞工程vv3 3、蛋白质工程、蛋白质工程vv4 4、发酵工程、发酵工程vv5 5、酶工程、酶工程vv6 6、生物化学工程、生物化学工程vv7 7、生物医学工程、生物医学工程vv8 8、.第6页基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质（酶）工程另外还有基因诊疗与基因治疗技术、克隆动物技术、生物芯片技术、生物材料技术、生物能源技术、利用生物降解环境中有毒有害化合物技术直接相关联学科：分子生物学、微生物学、生物化学、遗传学、细胞生物学、化学工程学、医药学等。对人类和社会生活各方面影响最大生物技术领域：农业生物技术、医药生物技术、环境生物技术、海洋生物技术l生物技术主要内容第7页“后基因组时代”将是“蛋白质组课时代”，即从对基因信息研究转向对蛋白质信息研究，包含研究蛋白质结构、功效与应用及蛋白质相互关系和作用。蛋白质工程就是在对蛋白质化学、晶体学、动力学等结构与功效认识基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终取得商业化产品。2、蛋白质工程、发酵工程和细胞工程介绍n 蛋白质工程第8页蛋白质工程主要步骤通常包含：蛋白质工程主要步骤通常包含：（1）从生物体中分离纯化目标蛋白；（2）测定其氨基酸序列；（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等伎俩，尽可能地了解蛋白质二维重组和三维晶体结构;n 蛋白质工程（4）设计各种处理条件，了解蛋白质结构改变，包含折叠与去折叠等对其活性与功效影响；（5）设计编码该蛋白基因改造方案，如点突变；（6）分离、纯化新蛋白，功效检测后投入实际使用。第9页当当代代发发酵酵工工程程主主要要指指利利用用微微生生物物、包包含含利利用用DNADNA重重组组技技术术改改造造微微生生物物在在全全自自动动发发酵酵罐罐或或生生物物反反应应器器中中生产某种商品技术。生产某种商品技术。当当代代发发酵酵工工程程是是生生物物代代谢谢、微微生生物物生生长长动动力力学学、大大型型发发酵酵罐罐或或生生物物反反应应器器研研制制、化化工工原原理理等等亲亲密密结结合合和和应应用结果。用结果。n 发酵工程第10页发酵工程普通发酵工程包含以下基本步骤：普通发酵工程包含以下基本步骤：（1）菌种选育；（2）细胞大规模培养即发酵过程；（3）生产活性诱导；（4）菌体及产物收获发酵工程产品范围非常广泛。发酵工程产品范围非常广泛。从食品、药品、精细化工产品到许多工业用原料、可降解塑料PHB等。第11页细胞工程细胞工程是指经过细胞水平上筛选或改造，取得有商业价值细胞株或细胞系，再经过规模培养，取得特殊商品技术与过程。细胞工程包含动物细胞工程和植物细胞工程，它们分别以动物细胞和植物细胞为主要生产对象，以细胞培养为主要过程和内容。第12页l动物细胞培养动物细胞培养n 细胞工程第13页l单细胞藻类培养单细胞藻类培养n 细胞工程一些单细胞低等植物如单细胞藻类大规模培养成为细胞工程主要组成部分取得蛋白质资源、营养食品、精细化工产品等等第14页l高等植物细胞培养高等植物细胞培养n 细胞工程高等植物细胞含有全能性。从高等植物幼胚、根、茎、叶、花和果实等不一样器官组织中分离单个细胞，经过特殊培养形成愈伤组织，并可深入诱导生成完整植株。第15页l细胞融合、细胞重组细胞融合、细胞重组n 细胞工程细胞融合是将不一样种类两种细胞经过特殊处理后放在一起，在一些促融因子作用下发生融合，形成杂种细胞。细胞重组是把不一样种类细胞部件重新组合装配，包含核移植、叶绿体移植、核糖体重建及线粒体装配等。第16页生物技术安全性和社会伦理问题基因一旦被改动，一方面可能引起生物体内一系列未知结构与功能变化；其次，转基因操作对生物体影响会经过遗传传递。n 转基因技术安全性问题MM外外源源基基因因引引入入后后，是是否否会会影影响响其其它它主主要要调调整整基基因因，甚甚至至会会激激活原癌基因？活原癌基因？MM转基因技术广泛应用是否会造成难以毁灭新病原物出现？转基因技术广泛应用是否会造成难以毁灭新病原物出现？MM是否会造成生态学灾难？是否会造成生态学灾难？MM人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代健康？人类摄食大量转基因食品是否会影响人类及其后代健康？第17页n 克隆人伦理问题M在克隆阶段，假如相关胚胎发育基因重新编排或开启不完全，对新生儿可能产生什么严重后果呢？M弟兄、姐妹、父母、儿女？M器官克隆和干细胞培养和分化器官，用于医学和临床治疗？n 个人基因信息隐私权问题人类基因信息利用伦理、法律和社会影响计划，称之为ELSI项目：（1）在应用和解释基因信息时隐私权和公正性；（2）基因信息由试验室研究向实际医疗应用转化；（3）人类基因组计划参加者相互协调和结果公布；（4）公众与专业教育第18页n 基因治疗应用问题M一个人有权决定另一个人基因结构或未来命运吗？M万一这种基因操作失败了或者造成了未来才能发觉不可挽回缺点和后果，谁承担责任呢？M是否能够经过基因治疗操作来增加运动员身高或短跑速度，这与运动员服用兴奋剂有什么本质区分？n 生物技术引发其它问题M生物技术费用高，在本身健康上贫富差距？M包括人类本身发展主要生物技术垄断？M生物武器？M第19页第二章 细胞培养第20页细胞培养所用玻璃及塑料品清洗与消毒细胞培养所用玻璃及塑料品清洗与消毒vv清洗清洗vv在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能影响培养细胞生长均能影响培养细胞生长n n微生物产品附带杂物微生物产品附带杂物n n上次细胞残留物上次细胞残留物n n非营养成份化学物质非营养成份化学物质vv需要清洗培养用具需要清洗培养用具n n玻璃器皿清洗玻璃器皿清洗n n胶塞清洗胶塞清洗n n塑料制品清洗塑料制品清洗第21页玻璃器皿清洗玻璃器皿清洗v包含浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤包含浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤包含浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤包含浸泡、刷洗、浸酸和冲洗四个步骤v清洗后玻璃器皿清洗后玻璃器皿清洗后玻璃器皿清洗后玻璃器皿n n洁净透明无油迹洁净透明无油迹洁净透明无油迹洁净透明无油迹n n不能残留任何物质不能残留任何物质不能残留任何物质不能残留任何物质第22页vv浸泡：首次使用和培养使用后玻璃器皿均需先用清水浸泡，浸泡：首次使用和培养使用后玻璃器皿均需先用清水浸泡，浸泡：首次使用和培养使用后玻璃器皿均需先用清水浸泡，浸泡：首次使用和培养使用后玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附着物软化或被溶掉以使附着物软化或被溶掉以使附着物软化或被溶掉以使附着物软化或被溶掉n n新首次使用玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量新首次使用玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量新首次使用玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量新首次使用玻璃器皿，在生产及运输过程中，玻璃表面带有大量干固灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害物质等干固灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害物质等干固灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害物质等干固灰尘，且玻璃表面常呈碱性及带有一些对细胞有害物质等n n先用自来水简单刷洗，然后晾干，再浸酸先用自来水简单刷洗，然后晾干，再浸酸先用自来水简单刷洗，然后晾干，再浸酸先用自来水简单刷洗，然后晾干，再浸酸n n再次使用玻璃器皿则常附有大量刚使用过蛋白质，干固后不易洗再次使用玻璃器皿则常附有大量刚使用过蛋白质，干固后不易洗再次使用玻璃器皿则常附有大量刚使用过蛋白质，干固后不易洗再次使用玻璃器皿则常附有大量刚使用过蛋白质，干固后不易洗掉掉掉掉n n用后马上浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面用后马上浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面用后马上浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面用后马上浸入水中，要求完全浸入，不能留有气泡或浮在液面上上上上第23页刷洗刷洗vv用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢杂质用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢杂质用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢杂质用毛刷沾洗涤剂刷洗，以除去器皿表面附着较牢杂质vv透明塑料制品刷洗要适度，过分会损害器皿表面光泽度透明塑料制品刷洗要适度，过分会损害器皿表面光泽度透明塑料制品刷洗要适度，过分会损害器皿表面光泽度透明塑料制品刷洗要适度，过分会损害器皿表面光泽度第24页浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中浸酸：玻璃器皿浸泡到清洁液中n n清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉清洁液对玻璃器皿无腐蚀作用，而其强氧化作用可除掉刷洗不掉微量杂质微量杂质n n浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面浸泡时器皿要充满清洁液，勿留气泡或器皿露出清洁液面n n浸泡时间：普通为过夜，不应少于浸泡时间：普通为过夜，不应少于6 6 小时小时vv清洁液清洁液 惯用三种：重铬酸钾（惯用三种：重铬酸钾（g g）浓硫酸（）浓硫酸（mlml）蒸馏水（）蒸馏水（mlml）n n强清洁液强清洁液 63631000100000 00 n n次强清洗液次强清洗液 1201202002001000 1000 n n弱清洁液弱清洁液 100100100100100100vv配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体配制时应注意安全，须穿戴耐酸手套和围裙，并要保护好面部及身体裸露部分裸露部分vv配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停用玻配制过程中可使重铬酸钾溶于水中，然后慢慢加浓硫酸。并不停用玻璃棒搅拌，使产生热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁璃棒搅拌，使产生热量挥发，配制溶液应选择塑料制品。配成后清洁液普通为棕红色液普通为棕红色第25页冲洗冲洗n n在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。在使用后，刷洗及浸泡后都必须用水充分冲洗。使之尽可能不留污染或清洁液残迹使之尽可能不留污染或清洁液残迹n n最好用洗涤装置最好用洗涤装置n n如用手工操作如用手工操作n n需流水冲洗二十次，每次水须灌满及倒洁净，需流水冲洗二十次，每次水须灌满及倒洁净，最好用蒸馏水清洗最好用蒸馏水清洗3-53-5次，三蒸水清洗次，三蒸水清洗3 3次，次，晾干或烘干备用晾干或烘干备用第26页胶塞清洗胶塞清洗v新购置瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来新购置瓶塞带有大量滑石粉及杂质，应先用自来水冲洗，再做常规处理水冲洗，再做常规处理v常规清洗方法常规清洗方法n n每次用后马上置入水中浸泡，用每次用后马上置入水中浸泡，用2%NaOH2%NaOH或洗或洗衣粉煮沸衣粉煮沸10-2010-20分钟（以除掉培养中蛋白质），分钟（以除掉培养中蛋白质），自来水冲洗，蒸馏水冲洗自来水冲洗，蒸馏水冲洗2-32-3次，晾干备用次，晾干备用第27页塑料制品清洗塑料制品清洗v塑料制品现多是采取无毒并已经特殊处理包装，塑料制品现多是采取无毒并已经特殊处理包装，打开包装即可用，多为一次性物品打开包装即可用，多为一次性物品v必要时用必要时用2%NaOH2%NaOH浸泡过夜，用自来水充分冲洗，浸泡过夜，用自来水充分冲洗，再用再用5%5%盐酸溶液浸泡盐酸溶液浸泡3030分钟，最终用自来水和蒸分钟，最终用自来水和蒸馏水冲洗洁净，晾干备用馏水冲洗洁净，晾干备用第28页消毒消毒vv细胞培养最大危险是发生培养物细菌、真菌和病毒等微生细胞培养最大危险是发生培养物细菌、真菌和病毒等微生物污染物污染vv常见原因：常见原因：n n操作间或周围空间不洁操作间或周围空间不洁n n培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底培养器皿和培养液消毒不合格或不彻底vv因为相关培养每个步骤失误均能造成培养失败，故细胞培因为相关培养每个步骤失误均能造成培养失败，故细胞培养每个步骤都应严格恪守操作常规，预防发生污染养每个步骤都应严格恪守操作常规，预防发生污染第29页消毒灭菌方法消毒灭菌方法vv物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法n n紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒培养紫外线：用于空气，操作台表面和不能使用其它法进行消毒培养器皿，器皿，30min30minn n湿热（高压蒸气灭菌法）：湿热（高压蒸气灭菌法）：121121，20min20minn n干烤：干烤：160,2160,2小时小时n n过滤：过滤：0.220.22 mmvv化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法n n70%70%酒精酒精n n主要用于操作者皮肤，操作台表面及无菌室内壁面处理主要用于操作者皮肤，操作台表面及无菌室内壁面处理n n11新洁尔灭新洁尔灭n n主要用于器械浸泡及皮肤和操作室壁面擦试消毒主要用于器械浸泡及皮肤和操作室壁面擦试消毒vv抗生素抗生素n n主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染主要用于培养用液灭菌或预防培养物污染第30页化学消毒法化学消毒法v70%70%酒精酒精酒精酒精n n主要用于操作者皮肤，操作台表面及无菌室内主要用于操作者皮肤，操作台表面及无菌室内主要用于操作者皮肤，操作台表面及无菌室内主要用于操作者皮肤，操作台表面及无菌室内壁面处理壁面处理壁面处理壁面处理v11新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭新洁尔灭n n主要用于器械浸泡及皮肤和操作室壁面擦试消主要用于器械浸泡及皮肤和操作室壁面擦试消主要用于器械浸泡及皮肤和操作室壁面擦试消主要用于器械浸泡及皮肤和操作室壁面擦试消毒毒毒毒第31页细胞培养惯用物品细胞培养惯用物品vv细胞培养基细胞培养基细胞培养基细胞培养基vv市场上可提供干粉培养基和液体培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基市场上可提供干粉培养基和液体培养基n n干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格廉价。缺点干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格廉价。缺点干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格廉价。缺点干粉培养基需使用者自己配制并灭菌，其优点是价格廉价。缺点是配制过程繁琐，质量不易控制是配制过程繁琐，质量不易控制是配制过程繁琐，质量不易控制是配制过程繁琐，质量不易控制n n液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不但质量得到确保，液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不但质量得到确保，液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不但质量得到确保，液体培养基是由专业厂家按标准规模化生产，不但质量得到确保，而且使用十分方便而且使用十分方便而且使用十分方便而且使用十分方便vv惯用培养基种类惯用培养基种类惯用培养基种类惯用培养基种类n nRPMI-1640RPMI-1640（标准型）、（标准型）、（标准型）、（标准型）、DMEM-DMEM-高糖（标准型）、高糖（标准型）、高糖（标准型）、高糖（标准型）、DMEM-DMEM-低糖低糖低糖低糖（标准型）（标准型）（标准型）（标准型）、McCoys 5AMcCoys 5A、M199M199、F10F10等等等等第32页血清血清vv热灭活：热灭活：热灭活：热灭活：5656,30,30 分钟加热已完全解冻血清分钟加热已完全解冻血清分钟加热已完全解冻血清分钟加热已完全解冻血清vv热灭活目标：灭活血清中补体成份。除非必须，普通不提热灭活目标：灭活血清中补体成份。除非必须，普通不提热灭活目标：灭活血清中补体成份。除非必须，普通不提热灭活目标：灭活血清中补体成份。除非必须，普通不提议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，议作热灭活处理，因为热处理会造成血清沉淀物显著增多，还会影响血清质量还会影响血清质量还会影响血清质量还会影响血清质量vv血清中沉淀物血清中沉淀物血清中沉淀物血清中沉淀物n n絮状物：血清中脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物：血清中脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物：血清中脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物：血清中脂蛋白变性及解冻后血清中纤维蛋白造成，这些絮状物不会影响血清本身质量。可用离心絮状物不会影响血清本身质量。可用离心絮状物不会影响血清本身质量。可用离心絮状物不会影响血清本身质量。可用离心3000rpm,5 3000rpm,5 分钟去除，分钟去除，分钟去除，分钟去除，也可不用处理也可不用处理也可不用处理也可不用处理n n显微镜下显微镜下显微镜下显微镜下“小黑点小黑点小黑点小黑点”：经过热处理过血清，沉淀物形成会显著增：经过热处理过血清，沉淀物形成会显著增：经过热处理过血清，沉淀物形成会显著增：经过热处理过血清，沉淀物形成会显著增多。有些沉淀物在显微镜下观察象多。有些沉淀物在显微镜下观察象多。有些沉淀物在显微镜下观察象多。有些沉淀物在显微镜下观察象“小黑点小黑点小黑点小黑点”，常误认为血清受，常误认为血清受，常误认为血清受，常误认为血清受污染。普通情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但假如怀疑血污染。普通情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但假如怀疑血污染。普通情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但假如怀疑血污染。普通情况下，此小黑点不会影响细胞生长，但假如怀疑血清质量，则应马上停顿使用，更换另一批号血清清质量，则应马上停顿使用，更换另一批号血清清质量，则应马上停顿使用，更换另一批号血清清质量，则应马上停顿使用，更换另一批号血清第33页平衡盐液体平衡盐液体vv组织细胞培养中惯用基本液体，能够维持渗透压、调整组织细胞培养中惯用基本液体，能够维持渗透压、调整组织细胞培养中惯用基本液体，能够维持渗透压、调整组织细胞培养中惯用基本液体，能够维持渗透压、调整pHpH值、供给细胞生存所需能量和无机离子成份值、供给细胞生存所需能量和无机离子成份值、供给细胞生存所需能量和无机离子成份值、供给细胞生存所需能量和无机离子成份vv用于洗涤组织、细胞等用于洗涤组织、细胞等用于洗涤组织、细胞等用于洗涤组织、细胞等第34页vvPBSPBS（Phosphate-Buffered SallinesPhosphate-Buffered Sallines）n nKCl 0.20gKCl 0.20gn nKH2PO4 0.20gKH2PO4 0.20gn nNaCl 8.00gNaCl 8.00gn nNa2HPO4Na2HPO47H2O 2.16g7H2O 2.16gvvDPBSDPBS（Dulbeccos Phosphate-Buffered SallinesDulbeccos Phosphate-Buffered Sallines）标）标）标）标准型准型准型准型n nCaCl2(anhyd.)(CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙)0.10g)0.10gn nKCl 0.20gKCl 0.20gn nKH2PO4 0.20gKH2PO4 0.20gn nMgCl2MgCl26H2O 0.10g6H2O 0.10gn nNaCl 8.00gNaCl 8.00gn nNa2HPO4Na2HPO47H2O 2.16g7H2O 2.16g第35页vvHanks Hanks 平衡盐溶液（平衡盐溶液（平衡盐溶液（平衡盐溶液（Hanks Balanced Salt SolutionsHanks Balanced Salt Solutions，HBSSHBSS）n nCaCl2(anhyd.)(CaCl2(anhyd.)(无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙无水氯化钙)0.14)0.14g gn nKCl 0.40KCl 0.40g gn nKH2PO4 0.06KH2PO4 0.06g gn nMgCl2MgCl26H2O 0.106H2O 0.10g gn nMgSO4MgSO47H2O 0.107H2O 0.10g gn nNaCl 8.00NaCl 8.00g gn nNa2CO3 0.35Na2CO3 0.35g gn nNa2HPO4 0.048Na2HPO4 0.048g gn nD-Glucose 1.00D-Glucose 1.00g gn nPhenol Red 0.01Phenol Red 0.01g g第36页vvD-Hanks D-Hanks 平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液平衡盐溶液(D-Hanks Balanced Salt(D-Hanks Balanced Salt Solutions,D-HBSS)Solutions,D-HBSS)n nKCl 0.40KCl 0.40g gn nKH2PO4 0.06KH2PO4 0.06g gn nNaCl 8.00NaCl 8.00g gn nNaCO3 0.35NaCO3 0.35g gn nNa2HPO4 0.048Na2HPO4 0.048g gn nD-Glucose 1.00D-Glucose 1.00g gn nPhenol Red 0.01Phenol Red 0.01g g第37页消化液消化液vv分离组织和分散细胞分离组织和分散细胞分离组织和分散细胞分离组织和分散细胞vv惯用有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠惯用有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠惯用有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠惯用有胰蛋白酶和二乙胺四乙酸二钠(EDTA)(EDTA)两种溶液两种溶液两种溶液两种溶液vv单独或混合使用单独或混合使用单独或混合使用单独或混合使用第38页胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液vv主要作用：使细胞间蛋白质水解，使细胞相互离散主要作用：使细胞间蛋白质水解，使细胞相互离散主要作用：使细胞间蛋白质水解，使细胞相互离散主要作用：使细胞间蛋白质水解，使细胞相互离散vv消化细胞时，加入一些血清或含血清培养液，能终止消化消化细胞时，加入一些血清或含血清培养液，能终止消化消化细胞时，加入一些血清或含血清培养液，能终止消化消化细胞时，加入一些血清或含血清培养液，能终止消化作用作用作用作用第39页vv胰蛋白酶溶液配制胰蛋白酶溶液配制n n称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许称取胰蛋白酶粉末置烧杯中，用少许D-HanksD-Hanks平衡盐溶平衡盐溶液调成糊状，再补足液调成糊状，再补足D-HanksD-Hanks平衡盐溶液，搅拌混匀，平衡盐溶液，搅拌混匀，置室温置室温4 4小时或冰箱过夜，不停搅拌振荡小时或冰箱过夜，不停搅拌振荡n n次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，次日，先用滤纸粗滤，再进行过滤除菌，分装入瓶中，低温冰箱保留备用，惯用浓度为低温冰箱保留备用，惯用浓度为0.25%0.25%（0.1%-0.5%0.1%-0.5%）n n胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调胰蛋白酶溶液偏酸，使用前可调用碳酸氢钠溶液调pHpH至至7.27.2左右左右n n保留条件：配制好胰蛋白酶溶液必须保留在保留条件：配制好胰蛋白酶溶液必须保留在-20-20冰箱冰箱中，以免分解失效中，以免分解失效第40页EDTAEDTA4Na 4Na 溶液溶液vv一个化学螯合剂，对细胞有一定离散作用，而且毒性小，一个化学螯合剂，对细胞有一定离散作用，而且毒性小，一个化学螯合剂，对细胞有一定离散作用，而且毒性小，一个化学螯合剂，对细胞有一定离散作用，而且毒性小，价格低廉，使用方便价格低廉，使用方便价格低廉，使用方便价格低廉，使用方便vv惯用工作液浓度为惯用工作液浓度为惯用工作液浓度为惯用工作液浓度为0.02%0.02%。通常与。通常与。通常与。通常与0.25%0.25%胰蛋白酶溶液按胰蛋白酶溶液按胰蛋白酶溶液按胰蛋白酶溶液按1 1：1 1 混合使用（混合液）混合使用（混合液）混合使用（混合液）混合使用（混合液）注意：使用注意：使用注意：使用注意：使用EDTA EDTA 处理细胞后，要用处理细胞后，要用处理细胞后，要用处理细胞后，要用Hanks Hanks 液冲洗洁净，因残留液冲洗洁净，因残留液冲洗洁净，因残留液冲洗洁净，因残留EDTA EDTA 会影响细胞生长会影响细胞生长会影响细胞生长会影响细胞生长vvEDTA EDTA 溶液配制：用溶液配制：用溶液配制：用溶液配制：用D-Hanks D-Hanks 平衡盐溶液溶解后，高压平衡盐溶液溶解后，高压平衡盐溶液溶解后，高压平衡盐溶液溶解后，高压蒸汽灭菌，分装成小瓶，蒸汽灭菌，分装成小瓶，蒸汽灭菌，分装成小瓶，蒸汽灭菌，分装成小瓶，4 4冰箱保留冰箱保留冰箱保留冰箱保留第41页pHpH调整液调整液vvNaHCO3NaHCO3溶液溶液n n惯用浓度为惯用浓度为7.5%7.5%。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，。配制时用三蒸水溶解后，过滤除菌或高压灭菌，分装，分装，4 4保留保留vvHEPESHEPES（分子量（分子量238.31238.31）溶液）溶液n n使用终浓度普通为使用终浓度普通为10-50mM10-50mMn n常配成常配成1M 1M 储存液：用储存液：用200ml 200ml 双蒸水溶解双蒸水溶解47.647.6克克HEPESHEPES，过滤除，过滤除菌或高压灭菌，分装小瓶，菌或高压灭菌，分装小瓶，4 4保留保留第42页酚红酚红vv大多数培养液中使用酚红作为大多数培养液中使用酚红作为pH pH 指示指示n n红色表示中性红色表示中性pHpH，黄色代表酸性，黄色代表酸性pHpH，紫色表示碱性，紫色表示碱性pHpHvv在一些特殊培养液中不含酚红在一些特殊培养液中不含酚红n n因为已经有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激因为已经有一些研究表明：酚红能模拟类固醇激素（尤其是雌激素）样作用素）样作用第43页抗生素溶液抗生素溶液v抗生素使用种类与浓度：工作浓度工作浓度 储存温度储存温度杀灭细菌杀灭细菌 penicillin100units/ml-20penicillin100units/ml-20G(+)G(+)streptomycin100ug/ml-20streptomycin100ug/ml-20G(+)G(+)、G(-)G(-)gentamicin50ug/ml-20gentamicin50ug/ml-20G(+)G(+)、G(-)G(-)、支、支原体原体amphotericinB2.5ug/ml-20amphotericinB2.5ug/ml-20真菌真菌nystatin50ug/ml-20nystatin50ug/ml-20 真菌真菌第44页器材和液体准备器材和液体准备vv细胞培养用玻璃器材细胞培养用玻璃器材细胞培养用玻璃器材细胞培养用玻璃器材n n培养瓶、吸管等在清洗洁净以后，装在铝盒和铁筒中，培养瓶、吸管等在清洗洁净以后，装在铝盒和铁筒中，培养瓶、吸管等在清洗洁净以后，装在铝盒和铁筒中，培养瓶、吸管等在清洗洁净以后，装在铝盒和铁筒中，160160，2 2小时干烤灭菌后备用小时干烤灭菌后备用小时干烤灭菌后备用小时干烤灭菌后备用vv手术器材、瓶塞、配制好手术器材、瓶塞、配制好手术器材、瓶塞、配制好手术器材、瓶塞、配制好PBSPBS液液液液n n1515磅，磅，磅，磅，121121，2020分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌分钟蒸气灭菌vvMEMMEM培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液培养液、小牛血清、消化液n n用用用用G6G6滤器负压抽滤后备用滤器负压抽滤后备用滤器负压抽滤后备用滤器负压抽滤后备用 第45页无菌操作中注意事项无菌操作中注意事项vv在无菌操作中，一定要保持工作区无菌清洁在无菌操作中，一定要保持工作区无菌清洁n n操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射操作前无菌室及无菌操作台以紫外灯照射30-6030-60分钟灭分钟灭菌，以菌，以70%ethanol70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转作台风扇运转1010分钟分钟n n操作时，小心取用无菌之试验物品，防止造成污染。操作时，小心取用无菌之试验物品，防止造成污染。勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打勿碰触吸管尖头部或容器瓶口，亦不要在打 开之容器开之容器正上方操作试验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住正上方操作试验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约瓶身，倾斜约4545角取用角取用 n n在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯周围进行在整个无菌操作过程中都应该在酒精灯周围进行第46页哺乳动物细胞冷冻保留哺乳动物细胞冷冻保留vv冷冻保留关键点冷冻保留关键点n n冷冻过程要迟缓。冷冻过程要迟缓。4304306060分钟分钟-2030-2030分钟分钟-801680161818小时（或过夜）小时（或过夜）液氮长久保留液氮长久保留n n冻存细胞必须处于对数生长久，活力大于冻存细胞必须处于对数生长久，活力大于9090，无微，无微生物污染。细胞浓度控制在：生物污染。细胞浓度控制在：1101107 75105107 7/ml/ml。vv惯用细胞冷冻保留液惯用细胞冷冻保留液n n1010DMSODMSO 完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（2020血清基础血清基础培养液）培养液）n n1010甘油甘油 完全细胞生长培养液（完全细胞生长培养液（2020血清基础培血清基础培养液）养液）第47页冷冻保留细胞解冻与复苏关键点冷冻保留细胞解冻与复苏关键点vv快速解冻快速解冻n n冻存细胞从液氮中取出后，马上放入冻存细胞从液氮中取出后，马上放入3737水浴中，轻水浴中，轻轻摇动冷冻管，使其在轻摇动冷冻管，使其在1 1分钟内全部融化（不要超出分钟内全部融化（不要超出3 3分钟）分钟）vv解冻后细胞可直接接种到含完全生长培养液细胞培养瓶中解冻后细胞可直接接种到含完全生长培养液细胞培养瓶中直接进行培养，直接进行培养，2424小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养小时后再用新鲜完全培养液替换旧培养液，以去除液，以去除DMSODMSOvv假如细胞对冷冻保护剂尤其敏感假如细胞对冷冻保护剂尤其敏感n n解冻后细胞应先经过离心去除冷冻保护剂，然后再接解冻后细胞应先经过离心去除冷冻保护剂，然后再接种到含完全生长培养液培养瓶中种到含完全生长培养液培养瓶中第48页解冻冷冻保留细胞离心方法解冻冷冻保留细胞离心方法vv从液氮中取出冻存细胞，马上放入从液氮中取出冻存细胞，马上放入3737水浴中快速解冻水浴中快速解冻vv将将1 12ml2ml冻存细胞液加入到冻存细胞液加入到25ml25ml新鲜完全细胞生长培养新鲜完全细胞生长培养液中，轻轻混匀液中，轻轻混匀vv用用80g80g离心离心2 23 3分钟，弃上清液分钟，弃上清液vv用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞用完全生长培养液轻轻悬浮细胞团，并计数细胞vv接种细胞到培养瓶中，起始密度为接种细胞到培养瓶中，起始密度为3105/ml3105/ml。第49页细胞原代和传代培养第50页原代细胞培养原理原代细胞培养原理v细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体细胞培养是模拟机体内生理条件，将细胞从机体中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和中取出，在人工条件下使其生存、生长、繁殖和传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程传代，进行细胞生命过程、细胞癌变、细胞工程等问题研究。等问题研究。v由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。由体内直接取出组织或细胞进行培养叫原代培养。原代培养细胞离体时间短，性状与体内相同，适原代培养细胞离体时间短，性状与体内相同，适合用于研究。合用于研究。v幼稚状态组织和细胞，如：动物胚胎、幼仔脏器幼稚状态组织和细胞，如：动物胚胎、幼仔脏器等更轻易进行原代培养等更轻易进行原代培养第51页原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）原代细胞培养操作（鼠胎组织细胞培养为例）vv取材：用取材：用颈椎脱位颈椎脱位法使孕鼠快速死亡。把整个孕鼠浸入盛有法使孕鼠快速死亡。把整个孕鼠浸入盛有7575乙醇乙醇烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒剪刀烧杯中数秒钟消毒，取出后放在大平皿中携入超净台。用消过毒剪刀在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒在躯干中部环行剪开皮肤，剖腹取出子宫置于无菌平皿中。用消过毒剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污剪刀剪开子宫，取出鼠胎，剪去头、爪，以平衡盐溶液洗去血污vv切割：用切割：用平衡盐溶液平衡盐溶液将取出组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔将取出组织块清洗三次，然后用眼科手术剪刀仔细将组织重复剪碎，直到成细将组织重复剪碎，直到成1mm1mm3 3左右小块，再用平衡盐溶液清洗，左右小块，再用平衡盐溶液清洗，洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去洗到组织块发白为止。静置数分钟，使组织块自然沉淀到管底，弃去上清上清vv消化、接种培养：加入消化、接种培养：加入0.250.25胰蛋白酶胰蛋白酶一一0.020.02EDTAEDTA混合消化液混合消化液（510510倍量），与组织块混匀。置倍量），与组织块混匀。置3737水浴，观察消化情况（每隔几水浴，观察消化情况（每隔几分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入分钟摇动一下试管），静止，吸去上清，加入5 510ml10ml完全生长培养完全生长培养液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培液，用吸管吹打混匀，移入二个培养瓶中，置于二氧化碳培养箱中培养养第52页原代细胞培养结果原代细胞培养结果vv细胞接种后普通几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后普通几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后普通几小时内就能贴壁，并开始生长细胞接种后普通几小时内就能贴壁，并开始生长vv如接种细胞密度适宜，如接种细胞密度适宜，如接种细胞密度适宜，如接种细胞密度适宜，5 5 5 5天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层天到一周即可形成单层第53页传代细胞培养原理传代细胞培养原理vv体外培养原代细胞或细胞株要在体外连续地培养就必须传体外培养原代细胞或细胞株要在体外连续地培养就必须传代，方便取得稳定细胞株或得到大量同种细胞，并维持细代，方便取得稳定细胞株或得到大量同种细胞，并维持细胞种延续胞种延续vv培养细胞形成单层汇合以后，因为密度过大生存空间不足培养细胞形成单层汇合以后，因为密度过大生存空间不足而引发营养枯竭，将培养细胞分散，从容器中取出，以而引发营养枯竭，将培养细胞分散，从容器中取出，以1:21:2或或l:3l:3以上比率转移到另外容器中进行培养，即为传代以上比率转移到另外容器中进行培养，即为传代培养培养vv细胞细胞“一代一代”指从细胞接种到分离再培养一段期间，与细指从细胞接种到分离再培养一段期间，与细胞世代或倍增不一样。在一代中，细胞培增胞世代或倍增不一样。在一代中，细胞培增3 36 6次次第54页传代细胞培养操作传代细胞培养操作vv将长成单层细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台将长成单层细胞从二氧化碳培养箱中取出，在超净工作台中倒掉瓶内培养液，加入少许消化液。中倒掉瓶内培养液，加入少许消化液。(以液面盖住细胞以液面盖住细胞为宜为宜)，静置，静置5 51010分钟分钟vv在倒置镜下观察被消化细胞，假如细胞变圆，相互之间不在倒置镜下观察被消化细胞，假如细胞变圆，相互之间不再连接成片，这时应马上在超净台中将消化液倒掉，加入再连接成片，这时应马上在超净台中将消化液倒掉，加入