圆二色谱原理和应用省公共课一等奖全国赛课获奖课件.pptx

圆二色谱圆二色谱Circular Dichroism (CD)原理与应用第1页光性质：波粒二象性诞生光性质：波粒二象性诞生 人类对光研究起源很早，但对光本质认识经历了一个较漫长过程。光终究是波还是粒子？光波动说与微粒说之争从十七世纪初开始，其间牛顿、惠更斯、托马斯杨、菲涅耳、爱因斯坦、波尔等多位著名科学家努力揭开了遮盖在“光本质”外面那层扑朔迷离面纱，至二十世纪初以光波粒 二象性告终，前后共三百多年时间。第2页粒子性：光是某种粒子即光量子，含有粒子性质 如 反射，散射等现象。波动性：即光含有波动性，有衍射、干涉等性质墨子和他学生做了世界上最早“小孔成像”试验，并对试验结果作出了光沿直线传输科学解释，并用此原了解释了物体和投影关系。爱因斯坦提出了光量子论，解释了光电现象，揭示了微观客体波粒二重性 第3页光源发射光量子从演示中能够看出：光源发射单个光量子运动轨迹是一个轨迹为余弦 函数简谐振动 轨迹方程为 xAcos（t）第4页而真实光源向外发射是连续光量子 如图所表示:图中不一样颜色小球代表不一样光量子 全部光量子在一个平面上我们称之为平面偏振光 它轨迹方程为xAcos（t）公式中 A为振幅与光强度平方成正比 为初始相位 t为时间第5页我们平时看到光为自然光含有我们平时看到光为自然光含有:1.方向随机性方向随机性 自然光源向外发射方向性是随机光量子 2.不连续性不连续性 会产生无数初始相位不一样光量子 糖葫芦z 传输方向传输方向 360度旋转轨迹度旋转轨迹这两个性质决定自然光含有如图所表示性质,既自然光能够看作圆柱形向前传输光第6页两束光合成两束光合成:物理力学力矢量合成:F1F3F2物体受到两个力F1,F2等同于物体受到这两个力矢量合成F3光合成也遵照矢量合成光合成也遵照矢量合成:其合成为电场矢量合成与光强度平方成正比第7页xytt1t0 t1 t2 t3 t4t0t2t3t4合成平面偏振光图相互垂直片面偏振光2-1=0取 t0,t1,t2,t3,t4时间 截面第8页2-1=pi/2 AX=AY pi=3.141592圆偏振光x=AXcos(Wt+1)y=AYcos(Wt+2)xy假如AX=AY合成轨迹为圆假如AX=AY合成轨迹为椭圆垂直传输方向第9页下面我们研究以下两束圆偏振光合成下面我们研究以下两束圆偏振光合成:两束旋转方向相反圆偏振光假如振幅相同（振幅与光强度平方成正比）矢量合成为平面偏振光。假如振幅不等则依据公式合成为下列图右图所表示椭圆偏振光！第10页圆二色性圆二色性e1e2e3e4e5e6e7e8晶轴垂直晶轴电气石晶体当自然光入射到电气石晶片时,晶片强烈地吸收振动平面与晶轴垂直光波,而只允许振动平面平行与晶轴光波经过,所以经过晶片光就变为含有一定平面偏振光.各向异性物质对不一样方向光吸收不一样如图所表示：第11页平面不对称分子含有各向异性 如氨基酸核酸、手性分子 也对偏振光有调整活性第12页当两束圆偏振光照射到含有这类分子溶液时:sample solution溶液对左旋和右旋圆偏振光吸收不一样这会造成EL不等于ER依据我们前面对振幅不一样两束圆偏正光叠加现象能够判断透过样品溶液光变为一束椭圆偏振光第13页当溶液中样品结构不一样,或成份不一样我们能够得到不一样椭圆反过来我们能够经过检测两束旋转方向相反圆偏振光透过样品所产生椭圆不一样来判断样品所含成份,和结构信息。第14页泰勒一阶展开式in proper units(CD spectroscopists use decimol)Per residue2)为了方便比较我们用来描述椭圆信息度圆二机器测量值光谱学家普通采取摩尔椭圆率 和 Deltaepslon大家形成统 一单位易于比较第15页tan(i0)n2/n1 时i0 被称为布鲁斯特角 此时反射光为平面偏振光，利用该原理可制造起偏器。n1折射率n2折射率i0平面偏振光折射：折射：双折射：双折射：o-raye-ray当一束光经过各向异性晶体或其它状态介质时产生相互垂直两束偏振光 o,e当光离开晶体时2-1=2*pi*l/(n0-ne)*入 四分之一波片四分之一波片 假如l=入/4/(n0-ne)则2-1=pi/2 此时假如入射光与光轴夹角为45度 时o,e振幅相同则o,e合成为圆偏振光.45deg45deg光轴光轴偏振光产生:第16页圆二色谱仪器刨面图M为镜子,p为起偏器 ls代表等和水晶第17页CD特点测量非常小CD测量为2.32*(AL-AR)弧度以样品有圆二信号一定要有紫外吸收但有紫外吸收不一定由远而信号第18页CD谱在蛋白质研究中应用谱在蛋白质研究中应用第19页The peptide bond is inherently asymmetric&is always optically active蛋白质分子固有不对称性决定了蛋白质光学活性蛋白质结构不一样表现出其对圆二色性特征差异所以我们能够经过圆二信号来测量蛋白质结构信息第20页图为一些蛋白(或肽)标准园二谱图第21页我们以肌红蛋白为例 193nm208nm223nm我们从图中看到了193,208,223特征峰与上一图中全螺旋蛋白特征峰基本相同我们能够从这个信息断定我们样品结构主要为螺旋结构第22页当我们得到一个图谱能够经过下表来和前面提到标准图谱来判断我们样品结构信息第23页对于螺旋性较高蛋白能够经过下式初步估算螺旋含量:不过准确性较差不推荐第24页 chymotrypsin(all)lysozyme(+)triosephosphate isomerase(/)myoglobin(all)但普通蛋白结构信息是较复杂并非标准螺旋或折叠之类结构 对于这些蛋白结构分析我们要选择适当软件和算法进行分析第25页CD谱分析算法很多不过最主要都是基于最小二乘法谱分析算法很多不过最主要都是基于最小二乘法:v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.180nm260nmHelixa+v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.sheetb+v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.c=测量样品谱v1v2v3v4v5v6v7v8v9v10v11v13v14v15v16.Random coila/(a+b+c)=螺旋含量b/(a+b+c)=折叠含量c/(a+b+c)=无规卷曲含量经过最最小二乘法求解出最优a,b,c值第26页Recommended MethodsFor determination of globular protein conformation in solution:SELCON,CDNN and K2D.For determination of polypeptide conformation:LINCOMB with a suitable polypeptide set of references.For determining the effects of mutation s,ligands and perturbants on protein structure:LINCOMB.For evaluating the number of folding states giving rise to a set of spectra:The CCA algorithm and SVD.第27页The Protein Circular Dichroism DataBank(PCDDB)http:/pcddb.cryst.bbk.ac.uk/On Line Circular Dichroism Analysis http:/public-1.cryst.bbk.ac.uk/cdweb/html/Cca分析 http:/www2.chem.elte.hu/cgi-bin/ccaform061122-5lyxPGDxoLsM6-00园二二级结构分析相关文件http:/lamar.colostate.edu/sreeram/PDF/index.html下载软件分析:http:/www2.umdnj.edu/cdrwjweb/#InstructionsCdpro分析:定时更新:SELCON3,CDSSTR,and CONTIN CLUSTERhttp:/lamar.colostate.edu/sreeram/CDPro/第28页第29页第30页第31页从CD谱分析准确性对全、/和变性蛋白质准确度90-100%对+准确度为85%对全准确度为75%第32页Applications of CD in structural biologyDetermination of secondary structure of proteins that cannot be crystallised Investigation of the effect of e.g.drug binding on protein secondary structure Dynamic processes,e.g.protein folding Studies of the effects of environment on protein structure Secondary structure and super-secondary structure of membrane proteins Study of ligand-induced conformational changes Carbohydrate conformation Investigations of protein-protein and protein-nucleic acid interactions Fold recognition 第33页CD试验关键点第34页仪器操作及参数仪器操作及参数:第35页Nitrogen flushingFlushing the optics with dry nitrogen is a must:Xe lamp has a quartz envelope,so if operated in air itll develop a lot of ozone,harmful for the mirrorsbelow 195nm oxygen will absorb radiation氮气流量15-20 for 180nm 20 for 95%所用试剂尽可能用光谱纯 要确定蛋白分子量和浓度 预防气泡干扰 超声波除气泡 预防粒子散射 使用0.02um滤膜对过滤样品第51页Protein Concentration:0.2 mg/mlCell Path Length:5 mmVolume 200 ml Stabilizers(Metal ions,etc.):minimumBuffer Concentration:5 mM or as low as possible while maintaining protein stability scan speed 100nm/min responce 4sec band width 2第52页