TILs治疗HCC的研究进展.pdf

中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生 收稿日期：2023 年 12 月 21 日 作者简介：韩颢（1984），女，汉族，天津人，硕士研究生，中级职称（助理研究员），研究方向为细胞治疗、免疫细胞。-174-TILs 治疗 HCC 的研究进展 韩 颢1 王欣言1 魏 卿2（通讯作者）1.优赛生命科学发展有限公司，天津 300455 2.博雅干细胞科技有限公司天津分公司，天津 300453 摘要：摘要：肿瘤浸润淋巴细胞（tumor infiltrating lymphocyte,TILs）来自于肿瘤组织内部及其周围，是在肿瘤组织中可能起到关键作用的一类淋巴细胞，它们可以在癌症治疗过程中，起到重要作用。近年来，研究人员通过体外扩增 TILs，排除了与抗体相关的免疫细胞缺陷，使其在人类癌症治疗中得到广泛应用。获得的细胞具有强于CIK（cytokine-induced killer cells）细胞 50-100 倍的杀瘤效力。但在原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma,HCC）的研究中，TILs 的应用相对较少，因此，本文将对 TILs 的研究发展、TILs 的体外制备方法及HCC 研究中涉及到的 TILs 研究和相关结果进行简要概述。通过对这些方面的了解，可以为后续研究提供更多的参考和指导。同时，了解这些对于克服由于癌症的发展和复发造成的治疗难题也是非常必要的。关键词：关键词：原发性肝癌；肿瘤浸润淋巴细胞；过继免疫疗法；抗肿瘤；体外培养 中图分类号：中图分类号：R735 根据世界卫生组织国际癌症研究机构的报告，原发性肝癌（PLC）对人们的生命和健康构成严重威胁，2020 年全球预计新增病例 90.6 万例，死亡 83 万人。在中国，肝癌在死亡率中排名第二，在发病率中排名第五1。PLC 的病理类型主要有三种，包括肝细胞癌（HCC）、肝内胆管癌（CC）和混合型 HCC/CC。其中 HCC占 85%-90%。对于 HCC，目前可用的治疗选择包括肝移植、肿瘤切除、射频消融、分子靶向药物和细胞免疫治疗。然而，HCC 的生存率较低，复发率较高，因为患者初诊时往往已是中期或晚期 HCC，或有微转移肿瘤。终末期 HCC 患者的 1 年中位生存率仅为 11%,而手术切除后的 1 年复发率为 70%，表明这些 HCC 治疗选择是有限的。因此，仍然需要针对 HCC 的新疗法。近几年，随着生物医药领域的迅猛发展，免疫疗法逐渐成为继手术、放疗、化疗后的第四类肿瘤治疗手段。免疫疗法利用我们自身的免疫系统来对抗肿瘤细胞，已经成为肿瘤治疗的热门研究领域。目前，免疫疗法在多种肿瘤类型中显示出了令人鼓舞的治疗效果，包括肺癌、黑色素瘤和淋巴瘤等。这一领域的不断进步为肝细胞癌（HCC）的治疗带来了新的希望。特别是，HCC 患者自身肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）的免疫治疗备受关注。研究表明，HCC 患者体内的 TILs 具有抗肿瘤活性，因此，利用 TILs 进行免疫治疗已成为一种备受期待的治疗策略。具体而言，HCC 浸润淋巴细胞的专属性和抗肿瘤活性表明，该种治疗方法可能在 HCC患者种具有潜在的疗效和应用前景。因此，免疫疗法作为一种新型的治疗手段，为 HCC 患者带来了更为多元化和个体化的治疗选择，为 HCC 的治疗开辟了新的道路。免疫疗法主要包括免疫检查点抑制剂、免疫疫苗和过继免疫治疗疗法等2。根据细胞类型的不同，过继免 疫 疗 法 又 分 为TILs（Tumor-infifiltrating lymphocytes）、CIK（cytokine-induced killer cell）、DC-CIK（Dendritic cytokine-induced killer cell）、NK（nature killer cell）、CAR-T（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Immunotherapy）、CART-AFP（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Alpha Fetoprotein）、CART-CEA（Chimeric Antigen Receptor T-Cell Carcinoembryonic Antigen）等，同当今热门的 CAR-T 相比（见表 1），TILs 具有天然的肿瘤趋向性和肿瘤浸润能力，且副作用更小，无潜在免疫原性，在实体肿瘤中的应用更具有优势。此外，TILs 治疗还不需要外源基因修饰，因此可以避免许多与基因治疗相关的问题。相比之下，CAR-T 治疗使用修饰过的外周血单个核细胞（PBMCs）活外周血干细胞（HSCs）进行治疗，需要经过全基因组筛选或转移受体设计，而这种方法容易导致免疫原性和细胞毒性，并且很难穿透实体肿瘤。目前 CAR-T 治疗的数据仍然有限，临床安中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-175-全性也需要更多的验证和进一步研究。本文就 TILs 疗法治疗 HCC 的研究进展及 TILs 的制备方式作简单综述，为后续该方向研究提供参考。表 1 TILs 同 CAR-T 技术的比较 TILs CAR-T 细胞来源 肿瘤组织 血液 基因修饰 无 有 作用抗原 多靶点 主要靶向一类抗原 治疗肿瘤类型 黑色素瘤、肺癌等实体肿瘤 白血病、淋巴瘤等血液肿瘤 不良反应 暂无免疫原性副反应相关报道 潜在免疫原性：细胞因子风暴 应用类型 自体 自体 1 TILs 的发展简介 肿瘤组织浸润性淋巴细胞（Tumor-infifiltrating lymphocytes，TILs）来自肿瘤内部或肿瘤组织附近，对肿瘤细胞具有特异性识别能力，TILs 以前被认为是肿瘤免疫反应的宿主，在1922 年首次被提到。1986 年 Rosenberg3等人在荷瘤小鼠的肿瘤组织内发现并分离出了 TILs，他们将分离出的细胞用IL-2扩增培养后，再回输到荷瘤小鼠体内，发现肿瘤组织有明显消退，从而证明 TILs 细胞具有抗肿瘤的作用。经过广泛研究，人们发现 TIL 由多种淋巴细胞亚群组成，包括先天性免疫细胞和适应性免疫细胞，如肥大细胞、巨噬细胞、NK 细胞、T 淋巴细胞等。其中 T 淋巴细胞是 HCC 中 TIL 的主要细胞4。此外，Foxp3+、CD3+、CD4+和 CD8+T 淋巴细胞是广泛讨论的 TIL 亚组。到 2021 年 5 月，在 ClinicalTrials上登记备案的 TILs 相关临床试验共 117 例（见图 1），多集中在黑色素瘤上。而治疗肝癌的研究相对较少，仅有 4 例。图 1 截止到 2021 年 5 月 ClinicalTrials 上登记备案的TILs 相关临床试验数量 2 治疗 HCC 的 TILs 制备方法 2.1 肿瘤组织来源的 TILs 一项关于 HCC 过继免疫治疗的期临床研究中，Shan-shan Jiang5等人手术切除肿瘤组织，将组织切成 2-3mm3 小块，使用胶原酶消化，37，气浴恒温震荡 1.5-2 小时。获得的单个细胞悬液使用 100um 细胞滤网过滤，将其添加至淋巴细胞分离液中，密度梯度离心，离心后小心吸取淋巴细胞层，PBS 清洗两次，得到 TILs 细胞，按照 1106个细胞/ml，接种在 12 孔板上，补加 X-VIVO 15 培养基、10%人 AB 血清和 IL-2（2000IU/ml）放入 37、5%CO2培养箱进行培养。培养 10-14 天可将细胞进行冻存或进一步大规模激活扩增。当细胞数量达到 3-6107时，加入 CD3 单抗、4000IU/ml IL-2和辐照后的PBMC 细胞继续培养至治疗水平。参与该研究的 15 名患者（患者特征见表 2）的TILs 细胞在体外培养中成功扩增，并且回输后患者病情均有不同程度缓解，在后续随访的 14 个月内，12名患者已无疾病症状。表 2 一期临床试验中肝癌患者的特征 序号 年龄 性别 ECOG 肝炎病毒感染 肝硬化 既往治疗 01 66 男 1 HBV 否 手术 02 37 男 0 HBV 否 手术 03 33 男 0 HBV 是 手术 04 51 男 0 HBV 是 手术 05 59 男 1 HBV 是 手术 06 54 男 0 HBV 是 手术 07 56 男 0 HBV 是 手术 08 56 男 1 HBV 否 手术 09 52 男 0 HBV 否 手术 10 31 男 0 HBV 是 手术 11 40 男 0 HBV 是 手术 12 57 男 0 HBV 否 手术 13 41 女 0 HBV 否 手术 14 35 男 0 HBV 是 手术 15 33 男 0 HBV 是 手术 在另一项 TILs 治疗 HCC 的动物实验中，研究人员Wen-Chao Wang6等人将手术获得的肿瘤组织和正常肝脏组织使用 PBS 和 1640 培养基分别清洗后放入无菌器皿中，将两种组织分别切割成 1mm3 的小块用混合酶（DNA 酶、胶原酶、透明质酸酶）进行消化后过滤，采用淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集白膜层，台盼蓝染色后计数计活率，将细胞转入 24 孔板中，加入 1640 培养基、10%FBS、6000IU/ml IL-2 进行培养。将扩增后的 TILs 回输到荷瘤小鼠体内，经过 30 天的治疗，肿瘤组织来源的 TILs 细胞使小鼠体内的肿瘤组织明显减小（图 2）。中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-176-注：control：未治疗组；TILs：输注 HCC 患者非瘤肝脏组织来源 TILs 治疗组；TILs:输注 HCC 患者肿瘤组织来源TILs 治疗组。图 2 30 天治疗后荷瘤小鼠体内肿瘤大小 2.2 胸腹水来源的 TILs 一项关于肿瘤患者（原发肿瘤类型见表 3）自体 TILs 治疗恶性胸腔积液的研究中，林菁7等人取肝素抗凝无菌胸水 1000 r/min 离心 10 min,取沉淀的细胞成分以约每毫升(1 5)107 个细胞的浓度悬浮于 Hank s 液,铺垫于淋巴细胞液(Ficoll)上以 1800 r/min 离心 30 min,收集界面上的淋巴细胞。Hank s 液洗涤 2 次后,用 RPMI 1640 完全培养液调整细胞浓度为 1106/ml,其中 IL-2 1000 U/ml,10%人 AB 血清,置 37,5%CO2培养箱中培养 2 周左右。根据扩增及代谢情况按需换液。收集 TILs 细胞。体外扩增收获的 TILs 细胞配合 40 万 IU 的 IL-2 经胸腔回输至患者体内，回输前胸穿尽可能将胸腔积液抽干净，反复回输 2-3 次直至胸腔积液完全消失或明显减少。经过治疗，107 例患者中,TILs/lL-2 治疗后有73例完全缓解(70.2%),23 例部分缓解(22.1%),7 例无效(6.7%),总有效率(CR+PR)92.3%。表 3 107 例恶性胸腔积液患者的原发肿瘤类型（n）原发肿瘤 病例数 双侧胸腔积液 单侧胸腔积液 肺癌 74 9 65 乳腺癌 2 2 0 肝癌 4 0 4 卵巢癌 9 3 6 胃癌 2 0 2 大肠癌 3 1 2 鼻咽癌 2 2 0 宫颈癌 8 2 6 其他 3 0 3 合计 107 19 88 一项关于晚期肝癌腹水病人的 TILs 治疗中，研究者对 5 例肝癌腹水患者腹腔注射 IL-2 和 TNF 每周 2次，共 6 次，完成后第 2 天抽吸腹水，常规分离淋巴细胞进行培养，7 天后静脉回输，4 周后评价疗效，发现腹水完全缓解 1 例，部分缓解 2 例，微小缓解 1 例；肝内病灶部分缓解 2 例，微小缓解 1 例；肝门淋巴结肿大部分缓解 3 例，该实验证明 TILs 对晚期肝癌的原发病灶和转移灶均有治疗作用8。3 TILs 治疗的效果及预后 从以上研究中可以看出，TILs 对 HCC 的肿瘤杀伤性是无可厚非的，这种免疫治疗策略在某些患者中取得了令人鼓舞的治疗效果。然而，仍然有一部分患者的治疗效果并不理想。Zemin Zhang9团队通过单细胞测序技术对肝癌肿瘤微环境中 T 淋巴细胞的转录组及TCR 序列进行综合分析，对 T 细胞亚群进行分类，研究不同亚群之间的关系,从而揭示肝癌患者的 TILs 细胞它的独特性质。研究认为，肿瘤在免疫系统中出现逃逸的主要原因包括杀伤性 T 细胞的功能紊乱和大量抑制性 T 细胞的存在，此外，该研究还在耗竭的 CD8+T细胞亚群中发现了 Foxp3+Treg 细胞的存在，提出耗竭T 细胞会进一步发展成 Treg 的可能。在 TILs 细胞中，主要发挥抗肿瘤作用的细胞包括T 细胞、B 细胞和自然杀伤（NK）细胞，在 TILs 细胞上有很多特异性抗原，例如 T 细胞表面抗原 CD3、CD4、CD8、FOXP3、CD16、CD20、CD56、CD57、CD68、CD169。CD3、CD4、CD8、FOXP3，单核细胞表面抗原 CD16，B细胞表面抗原 CD20，NK 细胞表面抗原 CD56、CD57，巨噬细胞表面抗原 CD68 和 CD169。随着免疫检验技术的飞速发展，研究者们发现，一些特定表型的免疫细胞能够调动机体免疫系统对肿瘤进行杀伤，但是在特定环境下他们却能够促进肿瘤的发生发展。Wei Ding10等人运用 Meta 分析法对已登记的 46 个回顾性研究中7905 例HCC患者数据进行统计学分析，他们发现，CD8+、FOXP3+、CD3+、颗粒酶 B+淋巴细胞对提高生存率至关重要（P0.05），肿瘤内部 FOXP3+TILs 的多少是患者预后的重要指标(pooled HR=1.894;95%CI=1.6592.164;P.001)，肿 瘤 内 部(低 HR=0.676;95%CI=0.5400.845;P=.001)或边缘(低 HR=0.621;95%CI=0.5160.748;P.001)CD8+TILs 细胞浓度较高的话患者往往预后较好。研究者认为，一些特殊亚群的TILs 可作为 HCC 预后的生物标志物，也可作为治疗 HCC的靶点来进行研究。Adriaan A.van Beek11等人通过体外试验比较HCC患者肿瘤组织、无肿瘤的肝脏组织和外周血中GITR的表达，研究了 GITR 和 PD1 联合靶向对体内 TILs 反中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-177-应的影响，他们发现 CD4+FoxP3+TILs 细胞高表达 GITR，在 CD4+FoxP3+高表达的肿瘤组织内部，CD8+T 细胞较少。阻断 GITR 蛋白能够促进 TILs 细胞的增殖，增强 HCC中 TILs 的杀瘤活性，使用 GITRL 和抗 GITR 抗体可增强体外培养的 TILs 细胞效应细胞因子（IFN-）和颗粒酶 B 的产生，阻断 PD1 联合阻断 GITR 能进一步增强部分患者 TILs 的肿瘤特异性。4 总结 本文介绍了几种常规的 TILs 制备方式，从患者胸腹水或肿瘤组织中获得细胞，使用淋巴细胞分离液密度梯度离心获得种子细胞，两步法进行培养，先用高浓度 IL-2 扩增细胞数量，再用 CD3 单抗、CD28 单抗或辐照的人外周血PBMC等对细胞进行刺激以提高效应细胞的比例，得到满足治疗的细胞数量后回输到荷瘤小鼠体内或患者体内。培养周期通常为 20-25 天，也有研究培养到 36 天12。在培养基的选择上，多以选择免疫细胞培养基加入人血清为主，动物实验中 10%FBS 是首选。给药方式上分为静脉滴注和局部注射，一疗程2-6 次。在体外实验中，荷瘤小鼠经 TILs 治疗后肿瘤组织尺寸明显缩小，在临床实验中，实验数据和后期病例随访良性反馈均证明该治疗方法的有效性。表 4 截至到 2021 年 5 月 ClinicalTrials 上各靶点临床试验项目数量 研究靶点 临床试验项目数量 全球 中国 CD19 288 186 CD20 42 32 CD22 62 48 CD30 17 7 CD33 9 7 CD123 23 18 CD138 6 5 BCMA 87 51 Her-2 14 9 EGFR 21 11 MESO 13 7 CEA 9 3 GPC3 17 12 Muc-1 16 12 EphA-2 1 1 AFP 1 1 5 讨论与展望 早期的 TILs 治疗中，为了确保细胞在体内的存活周期，患者需要使用一定量的 IL-2，然而，由于 IL-2的使用与较多的副作用相关，包括发热、低血压和肺水肿等，目前已经较少使用这种做法。随着对 TILs 治疗册罗的深入研究和临床实践，人们正在寻求更安全、更有效的方法来增强 TILs 的存活和抗肿瘤活性，例如通过该昂的体外扩增方法或联合其他免疫调节药物，以提高治疗效果并减少不良反应的风险。近年来，有报道指出，TILs 治疗中较长的培养周期可能会使细胞老化，导致细胞在体内的活性时间变短13，因此，如何缩短 TILs 的培养周期，延长细胞在体内的活性时间，使 TILs 治疗领域需要解决的重要问题。为此，一些研究正在利用先进的技术和方法改进TILs 的生产过程，如优化细胞培养条件、增加细胞存活周期、改进 T 细胞重组受体（TCR）工程等14。这些努力旨在提高 TILs 细胞治疗的效率和安全性，进一步开发 TILs 治疗在临床实践中的应用价值。尽管这些努力在 TILs 治疗领域已取得了一些初步的成功，但仍需要更多研究证明其长期的疗效和安全性。TILs 是以 T细胞为主的一群异质性细胞，除 T 细胞外还有 B 细胞、NK 细胞等其他免疫细胞。随着单细胞测序技术的发展，人们对肿瘤内TILs的细胞组成及功能的了解逐渐深入，运用该技术找出 TILs 中的效应细胞，结合现有技术如TILs 与 PD-1/PD-L1、GITR 等免疫检查点抑制剂的联合应用能否进一步发挥 TILs 的肿瘤杀伤能力，有待研究者们继续研究。近几年，生物免疫治疗的热点主要集中在 CAR-T 疗法上。国内外学者、各大医药公司进行大量研究，该技术已成为过继免疫治疗中最为成熟的技术之一。截至到 2021 年 5 月，在 ClinicalTrials上登记备案的 CAR-T 相关研究就有 706 例，其中有 389例来自中国（各靶点临床试验项目数量见表 4）。研究靶点多集中在 CD19、CD22 等淋巴瘤、淋巴细胞白血病此类非实体肿瘤上。而 TILs 在实体肿瘤治疗上有着独特的优势，如果能将 CAR 技术同 TILs 细胞疗法相结合，或许能给抗实体肿瘤的研究提供一条新的思路15。参考文献 1Sung H,Ferlay J,Siegel RL,Laversanne M,Soerjomataram I,Jemal A,et al.Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 CountriesJ.CA:中文科技期刊数据库（全文版）医药卫生-178-Cancer J Clin,2021,71(3):209-249.2Haibei Xin,Dandan Liang,et al.The CD68+macrophages to CD8+T-cell ratio is 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