高效液相色谱法同时测定跌打活血散中羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量.pdf

Pharmacy Information 药物药物资讯资讯,2024,13(2),134-139 Published Online March 2024 in Hans.https:/www.hanspub.org/journal/pi https:/doi.org/10.12677/pi.2024.132017 文章引用文章引用:赵文法,冯家龙.高效液相色谱法同时测定跌打活血散中羟基红花黄色素 A 和阿魏酸的含量J.药物资讯,2024,13(2):134-139.DOI:10.12677/pi.2024.132017 高效液相色谱法同时测定跌打活血散中高效液相色谱法同时测定跌打活血散中 羟基红花黄色素羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量和阿魏酸的含量 赵文法赵文法，冯家龙冯家龙 聊城市检验检测中心药品检验科，山东 聊城 收稿日期：2024年2月20日；录用日期：2024年3月21日；发布日期：2024年3月28日 摘摘 要要 目的：建立跌打活血散中红花和当归的主要成分羟基红花黄色素目的：建立跌打活血散中红花和当归的主要成分羟基红花黄色素A和阿魏酸的含量测定方法。方法：以和阿魏酸的含量测定方法。方法：以Agilent ZORBAXSB-C8柱柱(5 m,250 mm 4.6 mm)为色谱柱，乙腈为色谱柱，乙腈-0.1%磷酸磷酸-四氢呋喃四氢呋喃(18:80:2)为流为流动相，检测波长为动相，检测波长为340 nm，流速为，流速为1.0 ml/min，柱温为，柱温为30。结果：羟基红花黄色素。结果：羟基红花黄色素A在在40.2201.0 g/mL浓度范围内线形关系良好，浓度范围内线形关系良好，r=0.9995(RSD=1.6%,n=5)，平均回收率为，平均回收率为96.2%(RSD=1.3%,n=6)；阿魏酸在；阿魏酸在1.015.05 g/mL浓度范围内线形关系良好，浓度范围内线形关系良好，r=0.9997(RSD=1.1%,n=5)，平均回收，平均回收率为率为98.6%(RSD=1.5%,n=6)。结论：本方法简便、准确，结果稳定，可用于跌打活血散中红花和当。结论：本方法简便、准确，结果稳定，可用于跌打活血散中红花和当归的主要成分羟基红花黄色素归的主要成分羟基红花黄色素A和阿魏酸的测定。和阿魏酸的测定。关键词关键词 跌打活血散跌打活血散，羟基红花黄色素羟基红花黄色素A，阿魏酸阿魏酸，含量测定含量测定，高效液相色谱高效液相色谱 Simultaneous Determination of Hydroxysafflor Yellow A and Ferulic Acid in Diedahuoxue Powder by HPLC Wenfa Zhao,Jialong Feng Drug Inspection Department of Liaocheng Inspection and Testing Center,Liaocheng Shandong Received:Feb.20th,2024;accepted:Mar.21st,2024;published:Mar.28th,2024 Abstract Object:To establish a method for the determination of Hydroxysafflor yellow A and ferulic acid in diedahuoxue powder.Methods:Agilent ZORBAX SB-C8 column(5 m,250 mm 4.6 mm)was used as the chromatographic column,acetonitrile-0.1%phosphoric acid-tetrahydrofuran(18:80:2)as 赵文法，冯家龙 DOI:10.12677/pi.2024.132017 135 药物资讯 the mobile phase,the detection wavelength was 340 nm,the flow rate was 1.0 ml/min,and the column temperature was 30C.Results:The linear range of Hydroxysafflor yellow A was 40.2201.0 g/ml,r=0.9995(RSD=1.6%,n=5),the average recovery was 96.2%(RSD=1.3%,n=6);the li-near range of Ferulic Acid was 1.015.05 g/ml,r=0.9997(RSD=1.1%,n=5),the average recov-ery was 98.6%(RSD=1.5%,n=6).Conclusion:The method is simple,accurate and stable.It can be used for the determination of Hydroxysafflor yellow A and Ferulic Acid in diedahuoxue Powder.Keywords Diedahuoxue Powder,Hydroxysafflor Yellow A,Ferulic Acid,Determination,HPLC Copyright 2024 by author(s)and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License(CC BY 4.0).http:/creativecommons.org/licenses/by/4.0/1.引言引言 跌打活血散现行质量标准收载于中国药典2020 年版一部1，处方由红花，当归，血竭，三七，烫骨碎补，续断，乳香(炒)，没药(炒)，儿茶，大黄，冰片，土鳖虫等组成。方中红花、乳香、没药活血祛瘀止痛；血竭、三七、骨碎补、儿茶、土鳖虫活血疗伤；当归、续断养血活血，疗伤续折；大黄、冰片破瘀消积止痛。诸药合用，共奏舒筋活血，散瘀止痛之功效。临床上主要用于治疗跌打损伤，瘀血疼痛，闪腰岔气。现行质量标准仅规定了没药、乳香、血竭、红花、续断、大黄、土鳖虫的显微鉴别，大黄、当归、儿茶的薄层色谱鉴别及制剂通则检查，不利于该产品的质量控制，制剂处方中主成分当归，其有效成分均为阿魏酸，红花的有效成分为羟基红花黄色素 A。本研究在参考大量文献资料的基础上2-12，采用高效液相色谱法同时测定跌打活血散中的羟基红花黄色素 A 和阿魏酸，同时控制成品中当归和红花的含量，可用于控制跌打活血散的质量，为其质量标准的提高提供依据。2.仪器与试药仪器与试药 2.1.仪器仪器 Agilent1200 高效液相色谱仪(配 DAD 检测器)；Agilent ZORBAX SB-C8 色谱柱(5 m,250 mm 4.6 mm)；BT125D 电子分析天平(北京赛多利斯天平有限公司)；KQ100 型超声波药品处理机(昆山市超声仪器有限公司)。2.2.试药试药 羟基红花黄色素 A 对照品(批号：111638-201810，中国食品药品检定研究院)，阿魏酸对照品(批号：110773-201614，中国食品药品检定研究院)，色谱乙腈(天津大茂化学试剂)，其他试剂均为分析纯，样品为市售，阴性样品为自制。3.方法与结果方法与结果 3.1.色谱条件与系统适用性试验色谱条件与系统适用性试验 1)色谱条件以 Agilent ZORBAX SB-C8 柱(5 m,250 mm 4.6 mm)为色谱柱，乙腈-0.1%磷酸-四氢呋喃(18:80:2)为流动相，波长为 340 nm，流速为 1.0 ml/min，柱温为 30，进样量为 10 l。2)系统适用性试验理论板数按羟基红花黄色素 A 峰计算应不低于 3000，羟基红花黄色素 A 和阿魏Open AccessOpen Access赵文法，冯家龙 DOI:10.12677/pi.2024.132017 136 药物资讯 酸与相邻峰的分离度均大于 1.5。3.2.溶液的制备方法溶液的制备方法 3.2.1.供试品溶液的制备供试品溶液的制备 取本品适量约 1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25 ml，密塞，称定重量，超声提取 25 分钟，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。精密称取羟基红花黄色素 A 对照品适量，精密称定，加 50%甲醇稀释成 10 g/ml 的溶液，即得。3.2.2.对照品溶对照品溶液的制备液的制备 精密称取羟基红花黄色素 A 对照品和阿魏酸对照品，加 50%甲醇制成每 l ml 含羟基红花黄色素 A 80 g 和阿魏酸 2 g 的混合溶液，摇匀，即得。3.2.3.阴性样品溶液的制备阴性样品溶液的制备 按质量标准【处方】和【制法】项下的规定制备不加红花和当归的阴性样品适量，取约 1.0 g，照“3.2.1.”项下方法操作，即得。3.3.专属性试验专属性试验 分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性样品溶液各 10 l，注入液相色谱仪，按“3.1.”项下色谱条件测定。结果表明，阴性样品中在与羟基红花黄色素 A 对照品和阿魏酸对照品保留时间相应的位置无色谱峰，说明处方中其他组分对测定无干扰，方法专属性好，选择性高。3.4.线性关系的考察线性关系的考察 取羟基红花黄色素 A 对照品和阿魏酸对照品，精密称定，加 50%甲醇制成含羟基红花黄色素 A 为40.2、60.3、80.4、120.6、201.0 g/ml 和阿魏酸为 1.01、1.515、2.02、3.03、5.05 g/ml 的标准系列混合溶液，按“3.1.”项下色谱条件，分别取各浓度对照品溶液 10 l 注入液相色谱仪测定，以浓度(C)为横坐标，峰面积(A)为纵坐标，绘制标准曲线，结果表明，羟基红花黄色素 A 在 40.2201.0 g/mL 浓度范围内线形关系良好，阿魏酸在 1.015.05 g/mL 浓度范围内线形关系良好，见表 12。Table 1.Results of linear relationship examination for hydroxysafflower yellow pigment A 表表 1.羟基红花黄色素 A 线性关系考察结果 1 2 3 4 5 响应因子RSD%浓度(mg/mL)40.2 60.3 80.4 120.6 201 峰面积 A 1905.641 2896.161 3787.983 5689.829 9581.247 响应因子 f=C/A 1000 21.095 20.821 21.225 21.196 20.978 0.6%标准曲线方程 A=47.584C 8.3191 r=0.9998 Table 2.Results of linear relationship examination of ferulic acid 表表 2.阿魏酸线性关系考察结果 1 2 3 4 5 响应因子RSD%浓度(g/mL)1.01 1.515 2.02 3.03 5.05 峰面积 A 203.928 304.526 410.248 612.43 1025.032 响应因子 f=C/A 1000 0.495 0.497 0.492 0.495 0.493 0.2%标准曲线方程 A=203.29C 2.0804 r=0.9999 赵文法，冯家龙 DOI:10.12677/pi.2024.132017 137 药物资讯 3.5.精密度试验精密度试验 按“3.2.1.”项下制备样品溶液，取同一供试品溶液，按“3.1.”项下色谱条件测定进样 10 l，连续进样 5 次，以峰面积计算，羟基红花黄色素 A 峰面积的 RSD 为 1.2%，阿魏酸峰面积的 RSD 为 0.9%，结果表明精密度良好，符合分析要求。3.6.重复性试验重复性试验 取同一批号的供试品，按“3.2.1.”项下制备样品溶液，平行制备 6 份，按“2.1.”项色谱条件测定，以峰面积计算含量，羟基红花黄色素 A 峰面积的 RSD 为 1.8%，阿魏酸峰面积的 RSD 为 1.2%，结果表明本方法重复性符合要求。3.7.稳定性试验稳定性试验 取“3.6.”项下其中一份供试品溶液，按“3.1.”项下色谱条件下，分别在 0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h 测定 1 次。测定供试品中羟基红花黄色素 A 和阿魏酸的含量，以观察供试品溶液在检测过程中待测成分的稳定性。试验结果表明供试品溶液在 24 小时内稳定性良好，能够满足测定需要。3.8.加样回加样回收试验收试验 取已知含量的供试品(批号：20200201)适量，加入适量混合对照品溶液，制成低、中、高三个不同浓度的供试品溶液各 3 份，分别测定其含量，计算羟基红花黄色素 A 平均回收率为 95.9%，RSD 为 0.8%(n=6)；阿魏酸平均回收率为 98.9%，RSD 为 1.0%(n=6)。试验结果表明，该方法准确度符合规定。结果见表 34。Table 3.Results of the recovery test for hydroxysafflower yellow pigment A(n=6)表表 3.羟基红花黄色素 A 加样回收试验结果(n=6)取样量(g)样品含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率 平均回收率及 RSD%低 0.5012 0.952 0.816 1.662 94.0%95.9%RSD=1.0%0.5036 0.957 0.816 1.677 94.6%中 0.5016 0.953 1.020 1.943 98.5%0.5002 0.950 1.020 1.931 98.0%高 0.5062 0.962 1.224 2.077 95.0%0.5097 0.968 1.224 2.090 95.3%Table 4.Results of Ferulic Acid sample recovery test(n=6)表表 4.阿魏酸加样回收试验结果(n=6)取样量(g)样品含量(mg)加入量(mg)测得量(mg)回收率 平均回收率及 RSD%低 0.5012 0.0226 0.016 0.0386 97.8%98.8%RSD=1.0%0.5036 0.0227 0.016 0.0387 95.1%中 0.5016 0.0226 0.020 0.0426 100.6%0.5002 0.0225 0.020 0.0425 100.1%高 0.5062 0.0228 0.024 0.0468 99.4%0.5097 0.0229 0.024 0.0469 99.9%赵文法，冯家龙 DOI:10.12677/pi.2024.132017 138 药物资讯 3.9.样品测定样品测定 对 3 批样品进行测定，分别按“3.2.1.”项下方法制备供试品溶液，按 3.1.”项下色谱条件测定，以峰面积计算含量，结果见表 5。Table 5.Determination results of three batches of samples 表表 5.三批样品测定结果 批号 含量 20191001 20200201 20200302 羟基红花黄色素 A(mg/g)1.85 1.90 1.92 阿魏酸(mg/g)0.049 0.045 0.047 4.讨论讨论 4.1.色谱条件的选择色谱条件的选择 主要依据供试品溶液中羟基红花黄色素 A 和阿魏酸主峰有无干扰，通过 DAD 检测器对供试品中羟基红花黄色素 A 和阿魏酸的全波长检测，经比较供试品溶液在以乙腈-0.1%磷酸-四氢呋喃(18:80:2)为流动相，波长为 340 nm，流速为 1.0 ml/min，柱温为 30的色谱条件下，羟基红花黄色素 A 和阿魏酸主峰与其他杂质峰分离良好，羟基红花黄色素 A 主峰的纯度因子 999.92，阿魏酸主峰的纯度因子 1000，在可接受的阈值内。4.2.供试品溶液制备方法选择供试品溶液制备方法选择 比较了提取溶剂水、甲醇、50%甲醇，提取方法加热回流 30 min、超声 25 min 等不同的方法，结果表面用 50%甲醇，超声提取操作简单，测定的羟基红花黄色素 A 和阿魏酸的含量较高且与其他提取方法基本一致。4.3.综合评价综合评价 本文参考国内外大量中成药中有关羟基红花黄色素 A 和阿魏酸的含量测定方法的文献资料和多次试验，建立了本实验方法，实验结果显示，本方法简便、准确，结果稳定，可用于控制跌打活血散的质量及本品中羟基红花黄色素 A 和阿魏酸含量的质量评价。参考文献参考文献 1 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2020 年版一部S.北京:中国医药科技出版社,2020:1723-1724.2 王福成,冯瑞祥,杨玲霞,等.HPLC 法同时测定舒心宁片中羟基红花黄色素 A、阿魏酸的含量J.甘肃医药,2018,37(3):271-272.3 王亚洲,杨春旭.HPLC 同时测定蝎龙接骨散中羟基红花黄色素 A 和阿魏酸的含量J.中国实验方剂学杂志,18(22):109-111.4 戴作波,姜志戎.HPLC 法测定麝香接骨丸中羟基红花黄色素 A 的含量J.系统医学,2018,3(12):156-159.5 许爱珍,李欢,张宏,等.痹通冲剂中羟基红花黄色素 A 和葛根素的含量测定J.中国医院用药评价与分析,2019,19(6):721-723+728.6 李娣,曹雪晓,蒲位凌,等.血必净注射液用有效成分的 HPLC 法定量检测J.中国现代中药,2018,20(9):1157-1160.7 许辉,刘军,代鹏程,等.三七消痔栓中羟基红花黄色素 A 测定J.内蒙古石油化工,2019,45(1):3-5.8 刘雪,石晓倩,吴晏杰,等.UPLC 法同时测定新安名方脑络欣通中 5 个活性成分的含量J.贵州中医药大学学赵文法，冯家龙 DOI:10.12677/pi.2024.132017 139 药物资讯 报,2020,44(4):26-31.9 徐金玲,樊磊磊,王雪芹,等.浓缩当归丸质量标准的提高及阿魏酸的含量测定研究J.中国药品标准,2020,21(6):510-514.10 庄佳芳,李扬,史涛.HPLC 波长切换法同时测定强肝颗粒中 8 种活性成分的含量J.中国药师,2020,23(6):1223-1226.11 杨小兰,谢和兵,尼玛次仁,等.HPLC 法测定藏药十六味杜鹃花丸中羟基红花黄色素 A 的含量J.食品与药品,2023(5):432-435.12 欧贝丽,邹燕,龚秋翼,施文禧.基于阿魏酸和羟基红花黄色素 A 含量的肤痒颗粒质量评估J.中国医药导刊,2023(8):842-846.