基于药物重定位建立以α1酸性糖蛋白为靶点的高通量筛选平台及潜在减肥药物的发现.pdf

论著 基于药物重定位建立以 1 酸性糖蛋白为靶点的高通量筛选平台及潜在减肥药物的发现陈枫1，杨慈荣2，张圳1，陈飞1，刘霞1（1.海军军医大学药学系临床药学教研室,上海 200433；2.92730 部队 92 分队，海南 三亚 572000）摘要目的1 酸性糖蛋白（ORM）是减肥药物研发的新靶点。基于药物重定位，拟从已上市药物的化合物库中寻找可以靶向 ORM 的潜在减肥药物。方法构建 pGL4.20-ORM1 启动子重组质粒，验证后利用慢病毒载体构建稳定表达ORM1 启动子-LUC-PURO 的 AML12 细胞株，利用该细胞株对上市药物库中化合物进行高通量筛选，通过酶标仪对细胞的荧光值进行表征。结果对 1 470 种化合物进行初筛和复筛，发现 42 种化合物可以提高 ORM1 启动子表达，可用于进一步的减肥效应评估。结论通过慢病毒载体成功构建了 LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO 稳定表达细胞株，为高效、稳定筛选靶向 ORM 的减肥药物奠定了基础。关键词 药物重定位；1 酸性糖蛋白；高通量筛选；肥胖；减肥药物文章编号 2097-2024（2024）03-0114-07DOI 10.12206/j.issn.2097-2024.202309057Establishment of a high-throughput screening platform based on drugrepurposing targeting alpha-1-acid glycoprotein and discovery of potentialweightlossdrugsCHEN Feng1,YANG Cirong2,ZHANG Zhen1,CHEN Fei1,LIU Xia1（1.School of Pharmacy,Naval Medical University,Shanghai200433,China;2.Unit 92,92730 Force,Sanya 572000,China）AbstractObjectiveAlpha-1-acid glycoprotein（ORM）was a new target for the development of weight loss drugs.Tosearch for potential weight loss drugs that could target ORM from the compound library of already marketed drugs based on drugrepurposing.MethodsThe pGL4.20-ORM1 promoter recombinant plasmid was contructed and validated,and then a lentiviralvector was utilized to establish stable AML12 cell lines expressing ORM1 promoter-LUC-PURO.This cell line was employed forhigh-throughput screening of compounds from the marketed drug library,and the luminescence value of the cells was characterizedby enzyme marker.Results Primary screening and secondary screening of 1 470 compounds identified 42 compounds thatincreased ORM1 promoter expression and could be used for further weight loss effect assessment.Conclusion This studysuccessfully constructed LV-AML12-ORM1 promoter-LUC-PURO stable expression cell lines using lentiviral vectors,laying afoundation for efficient and stable screening of weight loss drugs targeting ORM.Keywords drug repurposing；ORM；high-throughput screening；obesity；weight loss drugs 0前言肥胖是一种慢性代谢性疾病，是指由于能量摄入超过消耗，导致体内脂肪积聚过多或分布异常而造成体重增加的一种疾病。肥胖会提高 2 型糖尿病、高血压、血脂异常、心血管疾病和某些癌症的发病率1-3，降低生活质量并增加死亡风险。减肥手术是最有效的减肥方法4，但手术有潜在的风险和限制，且无法满足全球范围内患者的医疗需求。改善饮食结构、生活方式以及增加身体活动等短期行为干预也不足以达成长期减肥的目的5。因此，药物治疗是中、重度肥胖患者以及有并发症的轻度肥胖患者的首要治疗选择6。多年来，减肥药物有着坎坷曲折的研发历程，获批数量有限且许多已经上市的药物最终因心血管问题等不良反应而撤市，如盐酸氯卡色林（5-羟色胺 2C 受体激动剂）、西布曲明（抑制去甲肾上腺素和 5-羟色胺再摄取）等。因此，全球各大药物监管机构对减肥药物的批准一直非常严格。目前，全球共有 8 种上市的减肥药物，包括赛利司他（脂肪酶抑制剂）、奥利司他（脂肪酶抑制剂）、复方芬特 作者简介陈枫，硕士研究生，Email：通信作者刘霞，教授，博士生导师，研究方向：心脑血管药理学，Email： 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 114Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024 明-托吡酯（肾上腺素受体激动剂与-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异噁唑丙酸受体拮抗剂）、复方纳曲酮-安非他酮（肾上腺素吸收抑制剂与多巴胺摄取抑制剂）、二甲双胍（单磷酸腺苷活化蛋白激酶激动剂）、苄非他明（肾上腺素受体激动剂）以及最新批准的利拉鲁肽和司美格鲁肽（GLP-1 受体激动剂）。然而，这些上市减肥药物的耐受性和安全性也受到挑战，如奥利司他会导致严重的脂肪泻；利拉鲁肽价格昂贵，存在恶心等胃肠道反应，不易推广。匮乏的减肥药物市场亟需基于新靶点的全新减肥药物以应对肥胖日益严峻的发病形势。ORM（Orosomucoid），也称为 1 酸性糖蛋白（AGP），是肝脏急性期反应蛋白7。ORM 在人体中有 2 种亚型（ORM1 和 ORM2），小鼠中有 3 个亚型（ORM1、ORM2 和 ORM3），大鼠中仅有 1 种型。在人和小鼠体内，ORM1 的组成水平远高于 ORM2（5 倍），并且只有 ORM1 可以被急性期刺激诱导。ORM 具有转运药物、调节免疫、维持毛细血管屏障等功能8。团队前期研究发现，ORM 具有能量代谢的调节作用，循环中的 ORM 可以作用于下丘脑的瘦素受体，激活JAK2-STAT3 通路，抑制摄食、降低体重、改善胰岛素抵抗9。本团队进一步以 ORM为靶点，筛选到了一个靶向上调内源性 ORM 的全新小分子化合物 HMS-01，在瘦素缺陷的 ob/ob 肥胖小鼠和高脂喂食的肥胖小鼠上，均展示了良好的减肥效果，在国家重大新药创制资助下，已经进入到临床前研究阶段。这些研究均提示，ORM 是一个治疗肥胖的全新潜在靶点9,靶向上调内源性ORM 的小分子有可能发展为新型减肥药物。然而，新的减肥药物研发面临高投入、低回报的困境，传统新药研发需要消耗 1015 年的时间，以及约 25 亿美元的投入，而达到期临床试验最后阶段的药物中有 50%最终无法被批准上市10，每一次失败都会消耗大量的时间与资源。药物重定位是一种药物发现和开发的策略，旨在重新评估已经开发或研究的药物，以寻找其在新的疾病领域或治疗应用中的潜在价值。该策略的目的是最大化已有药物的利用，降低新药开发的时间和成本。本研究利用基因重组技术构建了含有 ORM1 启动子上游 2 000 个碱基对序列的荧光素酶报告基因，由于 ORM 主要由肝脏合成，通过血液分泌至全身发挥作用，于是选用 AML12 小鼠正常肝细胞构建了稳定表达 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO 的细胞株，从而建立了一个以 ORM 为靶点的药物筛选平台和评价体系，用于高通量筛选上市药物库中靶向 ORM 的药物，为药物重定位发现潜在减肥药物奠定基础。1材料和方法 1.1 细胞及载体AML12 小鼠正常肝细胞、HEK-293T 上皮细胞、载体pGL4.20luc2/Puro 与pHBLV-CMV-MCS-EF1-puro、慢病毒包装辅助质粒 pMD2.G 和 psPAX2均为实验室保存；DH5 感受态细胞（天根生化科技有限公司）；ORM1 启动子基因序列来自 NCBI 数据库（NC_000070.7）。1.2 主要仪器Veriti 96 孔快速热循环仪（Thermo FisherScientific 公司，美国）；移液器、低温高速台式离心机（EPPENDORF 公司，德国）；电热恒温培养箱（上海跃进医疗器械有限公司）；琼脂糖凝胶电泳仪、多功能水平电泳槽（上海天能科技有限公司）；电热恒温水浴锅（上海一恒科技有限公司）；倒置生物显微镜（重庆光电仪器总公司）；全波长多功能酶标仪（BMG，德国）。1.3 主要试剂PCR 引物和基因合成（生工生物工程股份有限公司）；RNA 提取试剂盒 RNAeasy动物 RNA 抽提试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；限制性内切酶 KpnI、限制性内切酶 Hind、限制性内切酶 AgeI、限制性内切酶 ApaI、限制性内切酶 ClaI、限制性内切酶BamHI、转染试剂Lipofectamine 3 000试剂盒（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；高保真聚合酶 phanta Max-Super-Fidlity DNA polymerase（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）；PCR 试剂盒 2X Pro Taq 预混液、反转录试剂盒 Evo M-MLV反转录试剂预混液、SYBR Green Pro Taq HS 预混型 qPCR 试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）；琼脂糖凝胶 DNA 纯化回收试剂盒、质粒小提试剂盒（天根生化科技有限公司）；HB-infusionTM 无缝克隆试剂盒（汉恒生物科技有限公司）；转染试剂polybrene（Sigma，美国）；Firefly-Glo 萤光素酶报告基因检测试剂盒（大连美仑生物技术有限公司）；FDA 上市药物库（陶术生物科技有限公司）；测序由赛业生物科技有限公司完成。1.4 基因组 RNA 提取提取小鼠新鲜的肝组织，使用 RNAeasy动物 RNA 抽提试剂盒提取总 RNA，反转录为 cDNA，用作 PCR 模板，保存于20 冰箱。药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024115 1.5 ORM1 启动子目的基因的获得和扩增根据同源重组引物设计原则和参考小鼠ORM1（NC_000070.7）基因组序列设计引物（选取起始位点上游 2 000 个碱基对），采用同源重组法设计引物，上游引物加入 KpnI 酶切位点，下游引物加入 Hind 酶切位点，引物序列见表 1。产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收目的基因。表1ORM1启动子基因引物序列 引物名称引物序列（53）ORM1-FGGGGTACCGTTCTCAGCATGTTGCATAAATORM1-RCCAAGCTTGCTGAGGGCACTCAGAGC注：F:正向引物;R:反向引物。1.6 报告基因质粒 pGL4.20-ORM1 启动子的构建及扩增将 PCR 产物与载体质粒 pGL4.20 luc2 Puro（插入位点选择 AgeI 与 ApaI）于 37 双酶切 5 h，用同源重组酶将目的片段与载体质粒连接。使用DH5 感受态细胞将重组质粒进行转化后，接种于含有嘌呤霉素抗性的固体平板，用涂布器将重组质粒涂抹均匀，倒置 37 恒温箱培养 1216 h。将筛选出来的阳性克隆进行测序，随后进行菌液扩增和质粒抽提纯化。对提取的质粒进行浓度检测和A260/280 检测，把质粒保存于20 冰箱。构建成功的重组载体命名为 pGL4.20-ORM1 启动子。根据 Lipofectamine 3 000 试剂盒说明书，分别将pGL4.20-ORM1 启动子和 pGL4.20 转染至 AML12小鼠正常肝细胞中，使用地塞米松（DXMS）来验证报告基因的有效性和可行性。1.7 慢病毒表达载体LV-ORM1 启动子-LUC-PURO的构建及扩增以 pGL4.20-ORM1 启动子重组质粒为模板，设计引物，引物序列见表 2。产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒回收目的基因。表2LV-ORM1启动子-LUC-PURO 基因引物序列 引物名称引物序列（53）LV-ORM1启动子-LUC-PURO-FGGACAGCAGAGATCCAGTTTATCGATGTTCTCAGCATGTTGCATAAATTLV-ORM1启动子-LUC-PURO-RGAGCGATCGCAGATCCTTAGGATCCTTACACGGCGATCTTGCCGCCCTT注：F:正向引物;R:反向引物。将 PCR 产物与载体质粒 pHBLV-CMV-MCS-EF1-PURO（插入位点选择 ClaI 与 BamHI）于 37 双酶切 5 h，用同源重组酶将目的片段与载体质粒连接。使用 DH5 感受态细胞将重组质粒进行转化后，接种于含有嘌呤霉素抗性的固体平板，用涂布器将重组质粒涂抹均匀，倒置 37 恒温箱培养1216 h。将筛选出来的阳性克隆，送赛业生物科技有限公司进行测序。测序成功之后，进行菌液扩增和质粒抽提纯化。对提取的质粒进行浓度检测和 A260/280 检测，把质粒保存于20 冰箱。构建成功的重组载体命名为 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法构建 LV-LUC-PURO 作为对照载体。1.8 慢病毒包装及浓缩纯化及滴度检测 1.8.1 包装提前传代 HEK-293T 细胞用于转染，将慢病毒包 装 辅 助 质 粒 pMD2.G 10 g、psPAX2 5 g和 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO 10 g 以及转染试剂 75 l 混匀后静置，在室温下温育 15 min 后缓慢滴加至 293T 细胞中，于 37、5%CO2细胞培养箱中培养。转染后16 h 更换含10%胎牛血清 FBS的新鲜完全培养基。转染后 48 h 和 72 h，分别收集两次病毒上清液（48 h 收集后置换新鲜完全培养基），将两次收集的上清液混合，进行离心浓缩和病毒管分装，80C 冰箱保存。1.8.2 病毒滴度检测将生长状态良好的 HEK-293T 细胞消化计数后稀释至 1105个/ml,加入 96 孔板，100 l/孔，为每个病毒准备 6 个孔。放入 37C、5%CO2 培养箱中培养。将病毒进行 3 倍梯度稀释，共 6 个稀释度，接种于 293T 细胞，继续培养 48 h 后，在荧光显微镜下观察结果。在观察结果前 6 h 需更换新鲜10%FBS 完全培养基，从孔中吸出 80 l 培养基，然后加入 80 l 新鲜 10%FBS 完全培养基，放入 37C、5%CO2 培养箱中培养。6 h 后荧光显微镜下观察结果，荧光或活细胞百分比在 10%50%的孔计算病毒滴度。目的病毒命名为 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法，阴性对照病毒命名为 LV-LUC-PURO。1.9 LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO 稳转细胞株的筛选及建立将 AML12 小鼠正常肝细胞在含有 10%FBS、1%ITS（10 g/ml 胰岛素+5.5 g/l 转铁蛋白+5 ng/ml硒）、1%双抗以及 40 ng/ml DXMS 的 DMEM 培养基，于 37、5%CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。AML12 细胞在 10 cm 培养皿中细胞长满以后，用 0.25%胰蛋白酶消化，离心收集细胞后稀释 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 116Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024 成密度为 1.5105个/ml 的细胞悬液，接种于 6 孔板，每孔 2 ml，使得第 2 天细胞的融合率在 60%左右，利于感染。设置实验组 LV-ORM1 启动子-LUC-PURO 和阴性对照组 LV-LUC-PURO，为促进病毒的感染效率，首先，感染时弃原有培养基，添加含5%FBS 的新鲜培养液 2 ml，其次，添加助感染试剂 polybrene，使其最终浓度为 7 g/ml。设置 2 个（10/20）感染复数（MOI）组，感染 24 h 后换新鲜完全培养基。在感染 48 h 后，观察慢病毒颗粒感染效率，倒置荧光显微镜下观察荧光比例以确定最佳感染效率，最终选定 MOI=20 的分组进行后续实验。待细胞融合率达 60%时，用嘌呤毒素（0.8 g/ml）浓度处理 48 h，然后换新鲜的嘌呤毒素培养基继续处理，细胞密度超过 80%时则进行传代处理，后续每隔 23 d 更换含嘌呤毒素培养基扩大培养，经过反复挑取抗药性细胞后获得的稳定转染细胞，命名为 LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO。同样方法，阴性对照细胞株命名为 LV-AML12-LUC-PURO。1.10 qPCR 检测稳转细胞株中荧光素基因的表达水平使用 TRIzol 试剂提取组织总 RNA，使用反转录试剂盒将其逆转录成 cDNA，然后进行 PCR 扩增，采用 2CT分析目的基因的相对表达量，引物序列见表 3。表3qPCR 引物设计序列 引物名称引物序列（53）Luciferase-FCGCACATATCGAGGTGGACALuciferase-RGCAAGCTATTCTCGCTGCACmGapdh-FGTCAAGGCCGAGAATGGGAAmGapdh-RCTCGTGGTTCACACCCATCA注：qPCR：实时荧光定量聚合酶链式反应；mGapdh：小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶；F：正向引物；R：反向引物。1.11 荧光素酶报告分析使用二甲基亚砜（DMSO）和 DXMS 来验证LV-AML12-ORM1 启动子-LUC-PURO 作为药物筛选工具的有效性和可行性。将 LV-AML12-ORM1启动子-LUC-PURO 稳转细胞株培养于 96 孔黑色侧壁透明底板，用 10 mol/L DXMS 处理 12 h，同时用 0.1%DMSO 作为溶剂对照组。参照荧光素酶报告基因检测试剂盒说明书，加入 80 l 检测溶液，细胞充分裂解后在酶标仪中检测荧光素发光值。为了评估本高通量细胞筛选平台的精确性和稳定性，使用 Z因子作为度量标准，Z因子是高通量筛选中常用来评估和验证的主要统计参数之一：Z=13DMSO+3DXMS|DMSODXMS|式中 DMSO和 DXMS分别为阴性对照组和阳性对照组的标准差，DMSO和 DXMS分别为阴性对照组和阳性对照组的平均值。若 0.5Z1，则认为此筛选模型具有良好的精确性与稳定性。1.12 药物筛选基于对美国食品药品监督管理局（FDA）批准的药物库的筛选，选用陶术生物的 FDA 上市药物库，筛选可靶向升高 ORM 的药物。1.13 统计学方法实验数据使用软件 GraphPad Prism 9 进行作图和分析。两组间比较用 t 检验，以 P1.5 的 135 种化合物作为初步命中的化合物，如图 5 所示。这 135 种药物中包含 40 种糖皮质激素类药物，但由于长期服用糖皮质激素易出现 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024117 向心性肥胖，这与减肥的初衷相悖，所以将这些药物排除。之后将剩余的 95 种药物进行 30、10、1 mol/L 浓度的复筛，避免单一浓度筛选实验出现假阳性。根据复筛结果，42 种化合物呈现出量效关系的趋势，如图 6 所示，这些化合物的类别可分为抗肿瘤药（图 6A）、抗生素（图 6B）、抗炎药（图 6C）、抗病毒药（图 6D）以及其他药物（图 6EG）。3讨论本课题组基于药物重定位的方法，通过构建带 7 401碱基对1 0002 0003 0004 0005 0006 0007 000PuroR嘌呤霉素抗性基因poly(A)信号SV40复制起点Kozak序列SV40启动子SV40 poly(A)信号荧光素酶ORM1 启动子Poly(A)信号暂停位点氨苄青霉素抗性基因复制起点pGL4.20-ORM1 启动子重组质粒图 1pGL4.20-ORM1启动子重组质粒图谱 20 00015 00010 0005 0000+*+GL4.20DMSODXMS荧光强度(F/a.u.)pGL4.20-ORM1 启动子图 2报告基因载体 pGL4.20 与 pGL4.20-ORM1启动子荧光值检测结果*P0.001，与空白对照组（第一组）比较。LV-AML12-LUC-PUROLV-AML12-ORM1-LUC-PURO荧光素酶mRNA相对表达量150100500*图 3稳转细胞株 LV-AML12-LUC-PURO 与 LV-AML12-ORM1启动子-LUC-PURO 的荧光素mRNA 表达情况*P0.001，与 LV-AML12-LUC-PURO 组比较。药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 118Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024 有 ORM 启动子的稳转细胞株作为高通量筛选平台，Z因子的值为 0.77，证明此细胞筛选平台可作为一种高通量筛选的稳定方法。经过初筛和复筛后，筛选出 42 种小分子药物，这些药物可能是潜在的以 ORM 作为靶点并能发挥减肥作用的药物。中国科学院上海生命科学研究院和上海中医药大学通过合作研究这种高通量化合物筛选发现的方式，成功发现舒尼替尼作为一种新的激活褐色脂肪组织（BAT）的小分子，是治疗肥胖等相关代谢性疾病的潜在药物11。本课题组下一步将对这 42 种小分子药物进行体内验证实验，拟使用各个药物临床实验的安全范围内的剂量，在高脂饮食（HFD）小鼠模型中给药，观察药物能否显著抵抗高脂饮食诱导的肥胖，肝脏组织和血清中 ORM 的含量是否被上调，以及在ORM 敲除的肥胖小鼠上观察药物的效应是否消除，从而确定其 ORM 靶点效应。综上所述，本课题组为 ORM 靶向药物提供了一个快速细胞筛选平台，并从 FDA 上市药物库中筛选出了靶向上调 ORM 的潜在治疗肥胖的药物，为下一步减肥作用的观察奠定了基础。对这些药物及其潜在机制的研究可能会为减肥药物的发现和脂肪功能的新调节途径提供新的线索。【参考文献】SERAVALLE G,GRASSI G.Obesity and hypertensionJ.Pharmacol Res,2017,122：1-7.1 6420相对荧光值DMSO DXMS*图 4阴性对照组 DMSO 与阳性对照组 DXMS 荧光值检测结果*P0.001，与 DMSO 组比较。化合物数量(种)DXMS02004006008001 000 1 200 1 40012345678相对荧光值图 5初筛 1470 种化合物作用于 LV-AML12-ORM1启动子-LUC-PURO 稳转细胞的相对荧光值 64ABCDEFG2030301013010130101301013010130101301013010130 30301013010130 30101303010130 301013030301013010130101301013010130101301013010130101301013030101301013010130101301013010130101301013010130101303030相对荧光值6420相对荧光值6420相对荧光值6420相对荧光值6420相对荧光值6420相对荧光值6420相对荧光值DMSO 药物1药物2 药物3药物4药物5 DXMSDMSO 药物14 药物15 药物16 药物17 药物18药物19 药物20 药物21 药物22 药物23 DXMS3030101301013010130101301013010130101301013010130DMSO 药物34 药物35 药物36 药物37 药物38 药物39 药物40 药物41药物42 DXMSDMSO 药物24 药物25 药物26 药物27 药物28 药物29 药物30 药物31 药物32 药物33 DXMSDMSO 药物6药物7药物8药物9 DXMSDMSO 药物10药物11 DXMSDMSO 药物12药物13 DXMS图 6复筛 42 种化合物作用于 LV-AML12-ORM1启动子-LUC-PURO 稳转细胞的相对荧光值(mol/L)A.抗肿瘤药；B.抗生素；C.消炎药；D.抗病毒药；E.其他药物 1423；F.其他药物 2433；G.其他药物 3442 药学实践与服务2024 年 3 月 25 日第 42 卷第 3 期 Journal of Pharmaceutical Practice and Service，Vol.42，No.3，March 25，2024119 ALPERT M A,OMRAN J,BOSTICK B P.Effects of obesityon cardiovascular hemodynamics,cardiac morphology,and ven-tricular functionJ.Curr Obes Rep,2016,5（4）：424-434.2 TWIG G,YANIV G,LEVINE H,et al.Body-mass index in 2.3million adolescents and cardiovascular death in adulthoodJ.NEngl J Med,2016,374（25）：2430-2440.3 WOLFE B M,KVACH E,ECKEL R H.Treatment of obesity:weight loss and bariatric surgeryJ.Circ Res,2016,118（11）：1844-1855.4 BLHER M.Obesity:global epidemiology and pathogenesisJ.Nat Rev Endocrinol,2019,15（5）：288-298.5 SQUADRITO F,ROTTURA M,IRRERA N,et al.Anti-obesi-ty drug therapy in clinical practice:evidence of a poor prescrip-tive attitudeJ.Biomed Pharmacother,2020,128：110320.6 RUAN Y,XIANG K F,ZHANG H M,et al.Orosomucoid:apromising biomarker for the assessment of exercise-induced fa-7tigue triggered by basic combat trainingJ.BMC Sports SciMed Rehabil,2022,14（1）：100.徐栋平.急性期蛋白 ORM 在缺血性脑卒中的保护作用及其机制研究 D.上海:第二军医大学,2018.8 SUN Y,YANG Y L,QIN Z,et al.The 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