DB15T 2690-2022青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏技术规程.pdf

ICS 65.020.01 CCS B25 15 内蒙古自治区地方标准 DB15/T 26902022 青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏 技术规程 Technical protocol for isolation and preservation of lactic acid bacteria strains in silage 2022-07-15 发布 2022-08-15 实施 内蒙古自治区市场监督管理局 发 布 前言 本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由内蒙古农业大学提出。本文件由内蒙古自治区畜牧业标准化技术委员会（SAM/TC 19）归口。本文件起草单位：内蒙古农业大学、内蒙古自治区农牧业科学院、中国农业科学院草原研究所、白城师范学院、巴林左旗林业和草原局、内蒙古伊禾绿锦农业发展有限公司。本文件主要起草人：格根图、包健、贾玉山、王志军、孙林、尤思涵、都帅、降晓伟、侯美玲、丁霞、卢强、马千鹏、王瑞峰、赵牧其尔、李宇宇、刘明健、王宇、张佳伟。青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏技术规程 1 范围 本文件规定了青贮饲料中乳酸菌菌种分离与保藏的基本原则、设备、试剂、菌种分离、菌种保藏方法。本文件适用于青贮饲料中乳酸菌菌种的分离与保藏。2 规范性引用文件 下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB 20287 农用微生物菌剂 SN/T 1538.1 培养基制备指南 第1部分：实验室培养基制备质量保证通则 3 术语和定义 本文件没有需要界定的术语和定义。4 基本原则 应针对菌种的生物学性状选择分离与保藏方法。应使分离和保藏的菌种不染杂菌，使退化和死亡降到最低限度。应保证菌种分离和保藏的安全性，不能对周围环境造成污染和危害。5 设备 恒温培养箱：5 60。厌氧培养装置：5 60。振荡器：往复式。冰箱：4 冰箱、超低温冰箱（-50-86）。分析天平：感量 0.001 g。光学显微镜：4100。均质器及无菌均质袋、均质杯或灭菌乳钵。水浴锅：0 100。超净工作台。6 试剂 乳酸菌培养基：MRS 琼脂，见附录 A。稀释液：称取氯化钠 8.5 g，溶于 1000 mL 蒸馏水中，分装后，121 高压灭菌 30 min。所用试剂均为分析纯，水符合 GB/T 6682 三级水规格。7 乳酸菌菌种分离 菌液制备 以无菌操作称取10 g样品置于盛有90 mL无菌生理盐水的聚乙烯均质袋内，用拍打式无菌均质器拍打2 min，制成1：10的样品菌液。菌液稀释 用1 mL 无菌吸管（移液枪）吸取1:10样品匀液1 mL，沿管壁缓慢注于装有9 mL 无菌水的无菌试管中，振摇试管或利用小型试管振荡器使其混合均匀，按110进行系列稀释，分别得到11101、11102、11103、11104，11105 稀释的样品菌液（每个稀释度应更换移液管或枪头）。菌种培养 按照GB 20287规定制备琼脂培养基，于高压灭菌锅灭菌后备用。选择23个适宜稀释度的样品菌液（可包括原液），吸取20L样品菌液于制备好的无菌琼脂培养基培养皿内，利用无菌涂布棒涂抹均匀，每个稀释度做两个培养皿。同时，分别吸取20L 空白稀释液加入两个无菌培养皿内作空白对照。将培养皿翻转，倒置于恒温培养箱（乳酸菌：30 厌氧条件下培养72 h）。乳酸菌的分离与纯化 观察菌落的形态、大小、颜色和光泽，选择典型的菌落进行革兰氏染色、镜检和过氧化氢试验。经过革兰氏染色（呈阳性）和过氧化氢（呈阴性）试验，初步判断乳酸菌种类。用接种环挑取典型菌落12于MRS琼脂斜面培养基上，用接种环从底部自下而上划密“之”字形线，在30 恒温厌氧培养箱中培养48 h72 h，重复划线分离培养3次，得到纯化的单菌株。乳酸菌菌种分离及筛选程序见图1。乳酸菌的筛选 7.5.1 生长繁殖能力 将分离纯化的乳酸菌菌液混匀并提取其悬液以6%的浓度接种至 MRS 培养基中，恒温培养（37）24 h，期间每2 h用紫外可见分光光度计测其在波长620 nm的OD值，每个菌种均重复3次，最终将测定结果绘制生长曲线。7.5.2 产酸能力 将乳酸菌菌液混匀，提取其悬液以3.0%的浓度接种于pH=6.5的MRS液体培养基中，恒温（37）培养24 h，期间每2 h用pH计测发酵液的pH值，每个菌种均重复3次，最终将测定结果绘制产酸速率曲线。7.5.3 生理生化特性 将乳酸菌菌株以3%的浓度接种于 MRS 液体培养基，分别在4，10，30，45 条件下进行培养，其中4 培养10 d，10 与30 培养3 d，45 培养7 d，培养结束后观察乳酸菌菌株对温度的响应情况。分别在pH值为3.0，3.5，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0 以及浓度为3.0%和6.5%NaCl的 MRS液体培养基中30 培养48 h，观察乳酸菌菌株对酸碱与盐的耐受能力。采用紫外可见分光光度计测定乳酸菌在波长620 nm的OD值，以判断乳酸菌在不同环境下的生长情况（弱生长：0.2小于OD值小于0.5，生长：0.5小于OD 值小于0.1，不生长：OD 值小于0.2，生长好：OD 值大于1.0）。用细菌微量生化鉴定管检测乳酸菌菌株对49种碳源的利用情况，均重复测定3次。图1 菌种分离及筛选程序 8 菌种保藏方法 定期移植保藏法 按附录B的规定。低温冷冻保藏法 按附录C的规定。A A 附录A （规范性）乳酸菌培养基 A.1 MRS 培养基 乳酸菌培养基见表A.1。表A.1 乳酸菌培养基 成分组成 称取量 蛋白胨 10.0 g 牛肉粉 5.0 g 酵母粉 4.0 g 葡萄糖 20.0 g 吐温 80 1.0 mL K2HPO47H2O 2.0 g 醋酸钠3H2O 5.0 g 柠檬酸三铵 2.0 g MgSO47H2O 0.2 g MnSO44H2O 0.05 g A.2 制法 将上述成分加入到1000 mL蒸馏水中，加热溶解，调节pH至6.20.2，分装后121 高压灭菌15 min。B B 附录B （规范性）定期移植保藏法 B.1 适用范围 本方法广泛适用于细菌、放线菌、真菌等的短期保藏。B.2 原料 保藏培养基一般含有机氮多，糖分总量不超过2%，既能满足菌种培养时生长繁殖的需要，又可防止因产酸过多而影响菌种性能。大多数在低温条件下保藏可大大减缓菌种的代谢活动，抑制繁殖速度，降低突变频率，延长菌种保藏时间。B.3 技术要求 B.3.1 不同菌种应根据要求选择合适的培养基。B.3.2 接种时要求无菌操作，避免污染。B.3.3 保藏期间要定期检查菌种存放的房间、冰箱、冷库等的温度、湿度，不可使培养基干枯，如发现异常应重新移植培养。B.3.4 在传代过程中，将保藏菌种在营养贫乏和丰富的新鲜培养基中作交替培养，有利于保持菌种的优良特性。B.3.5 每次移植培养后，应于原保藏菌株及其登记卡片（包含菌株名称、编号、所用培养基等信息）逐个对照，检查无误后再存放。B.3.6 保藏菌种的移植不宜频繁，每次移植时，数量可以多一些，以延长使用期。B.4 方法与步骤 B.4.1 培养基制备 按照GB/T 4789.28和SN/T 1538.1执行。B.4.2 接种 B.4.2.1 斜面接种 B.4.2.1.1 点接 用接种环把菌种点接在斜面中部偏下方处。适用于扩散型生长及绒毛状气生菌丝类霉菌（如：毛霉、根霉等）。B.4.2.1.2 中央划线 用接种环从斜面中部自下而上划一直线。适用于细菌和酵母菌等。B.4.2.1.3 稀波状蜿蜒划线法 用接种环从斜面底部自下而上划稀“之”字形线。适用于易扩散的细菌，也适用于部分真菌。B.4.2.1.4 密波状蜿蜒划线法 用接种环从斜面底部自下而上划密“之”字形线。能充分利用斜面获得大量菌体细胞，适用于细菌和酵母菌等。B.4.2.1.5 挖块接种法 用接种铲挖取菌丝体连同少量琼脂培养基，转接到新鲜斜面上。适用灵芝等担子菌类真菌。B.4.2.2 穿刺接种 用接种针从原菌种斜面上挑取少量菌苔，从平固体培养基中心自上而下刺入，直到接近管底（勿穿到管底），然后沿原穿刺途径慢慢伸出接种针。适用于细菌和酵母菌等。B.4.2.3 液体菌种 挑取少量固体斜面菌种或用无菌滴管等吸取原菌液接种于新鲜液体培养基中。B.4.3 培养 将接种后的培养基放入30 38 的恒温培养箱中，培养至良好状态，根据菌种类别确定设定温度。B.4.4 保藏 B.4.4.1 保藏温度 培养好的菌种于4 6 保藏，有些菌种（如：部分弧菌、假单胞菌等）4 6 容易死亡，适于25 室温保藏。B.4.4.2 保藏湿度 通常相对湿度为50%70%。B.4.5 定期移植 定期移植的间隔时间，因微生物种类不同而异。一般不产生芽孢的细菌间隔较短，需12周，最长一个月移植一次。放线菌、酵母菌和丝状真菌间隔时间较长，每46个月移植一次即可。对于某些菌种（如：芽裂酵母，棉病囊霉等），应13个月移植一次。按相应的间隔时间将保藏菌种转接到新鲜培养基中，在30 38 培养，根据菌种类别确定设定温度。C C 附录C （规范性）低温冷冻保藏法 C.1 适用范围 本方法适用于大多数需要长期保藏的细菌、真菌、放线菌、病毒等。C.2 原理 大多数微生物可在-60 及以下的低温中保藏。通过低温，使微生物代谢活动停止。一般而言，冷冻温度愈低，效果愈好。C.3 技术要求 C.3.1 为了获得满意的冷冻效果，应在培养物中加入一定的冷冻保护剂。C.3.2 冷冻保藏时，要掌握好冷冻速度和解冻速度。C.3.3 注意低温冰箱的故障和停电事故，可以在低温槽内留有一定的空间，如果发生使低温冰箱温度变化的情况，可加入干冰以防止培养融化。C.3.4 融化后的菌种不能再用低温保藏，应重新接种后再冷冻保藏。C.4 方法与步骤 C.4.1 冻存管的准备 将2.0 mL冻存管（圆底硼硅玻璃安瓶管或螺旋式塑料管）清洗干净，121 高压灭菌15 min20 min，备用。也可使用商品化的菌种保藏管。注意冻存管不能有裂纹。C.4.2 保护剂的准备 保护剂种类要根据微生物的类别选择，一般采用无菌的10%20%甘油或脱脂奶粉，或10%二甲亚砜。C.4.3 培养物的准备 微生物不同的生理状态对存活率有影响，一般使用对数生长中后期培养物。菌种的准备可采用下列几种方法：a)刮取培养物斜面上的孢子或菌体，与保护剂混匀后加入冻存管内；b)接种液体培养基，振荡培养后取菌悬液与等体积的保护剂混匀后分装于冻存管内；c)将培养物在平皿培养，形成菌落后，用无菌打孔器从平板上切取一些大小均匀的小块（直径约5 mm10 mm），真菌最好取菌落边缘的菌块，与保护剂混匀后加入冻存管内；d)在安瓶管中 1.2 mm2 mm 的琼脂培养基，接种菌种，培养 2 d10 d 后，加入保护剂，待保藏。C.4.4 冷冻保藏 将含菌种的冻存管插入保藏塑料盒中置于-60 80 低温冰箱中保藏，保藏期间应定期检查活力及杂菌情况。保藏周期一般15年。C.4.5 复苏方法 从冰箱中取出菌种冻存管，应立即置37 40 水浴中轻轻摇动，直到融化为止。开启冻存管，将内容物移接至适宜的培养基培养。