DB21_T 3785—2023牛羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测技术规程.pdf

ICS11.220CCS B 4121辽宁省地方标准DB21/T 37852023牛羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测技术规程Detection of brucellosis in cattle and sheep by Fluorescence PolarizationAssay(FPA)2023-07-30 发布2023-08-30 实施辽宁省市场监督管理局发 布DB21/T 37852023I目次前言.II1范围.12规范性引用文件.13术语和定义.14缩略语.15生物安全要求.16技术原理.17设备试剂与材料.28样品采集和处理.29操作前准备工作.210试验操作.2附录 A（规范性）试剂配制.5DB21/T 37852023II前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由辽宁省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：辽宁省农业发展服务中心、锦州市疾病预防控制中心、哈尔滨平河生物技术有限公司、辽宁中科基因技术有限公司。本文件主要起草人：张雅为、于本良、顾贵波、兰德松、朱江巍、王克才、陈瑶、段亚良、李井春、孙世宇、魏澍、张辉、刘坤洋、刘佳、白梅、张旭、李泽钦、张祎。本文件发布实施后，任何单位和个人如有问题和意见建议，均可以通过来电和来函等方式进行反馈，我们将及时答复并认真处理，根据实际情况依法进行评估及复审。归口管理部门通讯地址：辽宁省农业农村厅（沈阳市和平区太原北街2号），联系电话：[phone]。文件起草单位通讯地址:辽宁省农业发展服务中心（沈阳市沈北新区人和街95号），联系电话：[phone]。DB21/T 378520231牛羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测技术规程1范围本文件规定了牛、羊布鲁氏菌病荧光偏振（FPA）检测的生物安全要求、技术原理、设备试剂与材料、样品采集和处理、操作前准备、试验操作等技术内容。本文件适用于牛、羊布鲁氏菌抗体水平的初筛检测。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB 19489实验室 生物安全通用要求NY/T 541兽医诊断样品采集、保存与运输技术规范NY/T 1948兽医实验室生物安全要求通则3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4缩略语下列缩略语适用于本文件。FPA:荧光偏振检测（Fluorescence Polarization Assay）mP:荧光偏振值（Millipolarisation Units）OPS:O-多糖（O-Polysaccharide）DEAE:二乙氨基乙基葡聚糖FITC:荧光素异硫氰酸酯5生物安全要求为了保护实验室检测人员的安全，实验操作应在相应级别的生物安全实验室内进行，严格按照 GB19489 和 NY/T 1948 要求执行。6技术原理溶液中的分子作随机转动，分子的大小是影响转动速率的主要因素，与其成反比关系，因而小分子较大分子转动得快。如果给分子标记上荧光色素，通过68.5角度的转动时间，可以通过测量水平和垂直的偏振光强度来确定。DB21/T 378520232诊断布鲁氏菌病时，采用牛种布鲁氏菌LPS的小分子量片段(平均22KD)，标记荧光素异硫氰酸酯(FITC)作为抗原，被检血清中若有抗体存在，与标记抗原结合后就会降低其转动速度，使用荧光偏振分析仪测定出偏振值，通过偏振值判断样品的阴、阳性。7设备试剂与材料设备荧光偏振检测仪（试管型便携式FPA仪、台式FPA分析仪）、微量移液器（1 L10 L、20 L200L、100 L1000 L）、多道移液器（10 L200 L）、旋涡振荡器。试剂标准阳性血清（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂）、标准阴性血清（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂）、FPA标记抗原（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置试剂，配置方法见附录A.1）、FPA样品稀释液（布鲁氏菌病荧光偏振商品化试剂或自行配置试剂，配置方法见附录A.2）、氯化钠、Tris、Tween-20、EDTA。材料10 mm75 mm硼硅玻璃试管（试管应清洁无指纹等，且无刮痕）、96孔黑色平底微量板、吸头（10L、200 L、1000 L）。8样品采集和处理按照NY/T 541中的方法采集和分离受检牛、羊的血清，分离后的血清应清亮透明没有溶血现象和腐败现象，血清量通常为 1 mL备用。9操作前准备工作将试剂和样品恢复至室温（18 26），检测操作应在室温（18 26）下进行。10试验操作试管法检测10.1.1仪器校准10.1.1.1每天第 1 次试验前或 FPA 检测仪被移动后，都要检测对照血清。10.1.1.2在两个 10 mm75 mm 硼硅玻璃试管中分别加入 1 mL 的 FPA 样品稀释液。10.1.1.3在两个试管中分别加入 10 L 的阳性和阴性对照血清，充分混合均匀（旋涡混合器振动 5s）。10.1.1.4使用试管型便携式 FPA 仪分别读取两管的空白密度值。10.1.1.5每管加入 10 L 的 FPA 标记抗原，充分混合均匀（旋涡混合器振动 5s）。10.1.1.6孵育至少 2min，最长不超过 5min。10.1.1.7使用便携式 FPA 仪读取两管的 mP 值。试管的检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。DB21/T 37852023310.1.1.8对照结果：阴性对照牛血清的 mP 值低于 90 mP（通常在 75 mP 左右）；阳性对照血清的 mP值在 200 mP 左右，则对照成立，可以进行样品检测。否则，按照 FPA 仪器的操作软件和操作程序，调试 FPA 检测仪的参考因子值，使对照成立，才可进行样品的检测。10.1.2样品检测10.1.2.1向每个 10 mm75 mm 硼硅玻璃试管加入 1 mL 的 FPA 样品稀释液，试管数量等于样品数量。10.1.2.2在上述试管中加入待检血清，用旋涡混合器振动 5 s 充分混合均匀。各畜种血清稀释度具体如下：a)牛血清按10 L血清加到1.0 mL 样品稀释液中稀释；b)绵羊血清按25 L血清加到1.0 mL 样品稀释液中稀释；c)山羊血清按40 L血清加到1.0 mL样品稀释液中稀释。10.1.2.3使用试管型便携式 FPA 仪读取被检样品试管的空白密度值。10.1.2.4在上述试管中加入 10 L 的 FPA 标记抗原，旋涡混合器振动 5 s 充分混合均匀。10.1.2.5孵育 2 min5 min。10.1.2.6使用试管型便携式 FPA 仪读取被检样品的 mP 值。试管的测量顺序与读取空白密度值时的顺序一致。10.1.3结果判定10.1.3.1没有接种布鲁氏菌病疫苗的动物：样品 mP 值大于其阈值时，判为阳性；mP 值小于阈值时，判为阴性；mP 值等于阈值时，需重新检测。牛、羊血清阈值如下：a)牛血清阈值为95 mP；b)绵羊血清阈值为78 mP；c)山羊血清阈值为88 mP。10.1.3.2已经接种 A19 疫苗 12 个月以后或接种 S2 疫苗 6 个月以后的动物：a)牛血清95 mP为阴性；95 mP检测值115 mP为可疑；116 mP为阳性；b)绵羊78 mP 为阴性；78 mP检测值88 mP为可疑；88 mP为阳性；c)山羊88 mP为阴性；88 mP为阳性。d)试验结果可疑牛、羊经60 d90 d后采血重检，如果结果仍为可疑，判为阳性。微量法检测10.2.1仪器校准10.2.1.1每天第 1 次试验前或 FPA 检测仪被移动后，都要检测对照血清。10.2.1.2在干净的 96 孔黑色平底微量板的第 1 列中的 6 个孔中分别加入 190 L FPA 样品稀释液。复孔分别加入 10 L 的阳性（C+）、阴性（C-）的对照牛血清和样品稀释液（Cc）10.2.1.3振动 2 min，充分混合均匀。使用台式 FPA 仪读取平板的空白密度值。10.2.1.4每孔加入 10 L FPA 标记抗原，振动 2 min，充分混合均匀。10.2.1.5孵育 2 min5 min。10.2.1.6使用台式 FPA 分析仪读取平板的检测密度值 mP 值。检测顺序与读取空白密度值时的顺序一致。10.2.1.7对照结果：阴性对照血清的 mP 值低于 90 mP（通常在 75 mP 左右）；阳性对照血清的 mP 值在 200 mP 左右，则对照成立，可以进行样品检测。否则，按照 FPA 仪器的操作软件和操作程序，调试FPA 检测仪的参考因子值，使对照成立，才可进行样品的检测。DB21/T 37852023410.2.2样品检测10.2.2.1在干净的 96 孔黑色平底微量板中每个孔加入 190 L FPA 样品稀释液。其中设置阳性对照和阴性对照孔各两个。10.2.2.2向每个对照孔和样品孔中分别加入 10 L 的阳性、阴性对照血清和被检牛血清（1 个孔检测1 个样品），室温下振动 2 min，充分混合均匀。96 孔黑色平底微量板置入荧光偏振检测仪中进行第一次读数，得到对照血清和样品的空白值。10.2.2.3从 FPA 检测仪上取出 96 孔板向每个孔中分别加入 10 L 的 FPA 标记抗原，室温下振动 2 min，充分混合均匀。10.2.2.4非自动加样的台式 FPA 检测仪，需要将 96 孔黑色平底微量板置入荧光偏振检测仪中进行第2 次读数，得到对照血清和样品的 mP 值。平板的测量顺序与读取空白板时的顺序一致。10.2.2.5自动加样的台式 FPA 检测仪，后续程序设置好后，仪器自动加入 10 L 的 FPA 标记抗原、然后振动 2 min，充分混合均匀；再孵育至少 2 min；FPA 检测仪进行第 2 次读数，得到对照血清和样品的 mP 值。10.2.3结果判定10.2.3.1阴性对照血清的读值介于 60 mP90 mP 之间，阳性对照血清的读值介于 140 mP300 mP之间，试验成立。10.2.3.2没有接种布鲁氏菌病疫苗的牛、已经接种A19 疫苗12个月或接种 S2 疫苗6 个月后的牛检测，结果判定如下:a)牛血清95 mP为阴性；95 mP检测值115 mP为可疑；116 mP为阳性；b)试验结果可疑牛经60 d90 d后采血重检，如果结果仍为可疑，判为阳性。DB21/T 378520235AA附录A（规范性）试剂配制A.1FPA 标记抗原制备制备OPS时，5 g干重(或50g湿重)牛种产布鲁氏菌S119-3株菌体悬液中加入400 mL2%(V/V)醋酸，121 高压灭菌15 min，于5 3 10000 g离心10 min，去除菌体碎体。然后，上清液用20 g 的三氯醋酸沉淀任何蛋白质和核酸,4 1000 g再离心10 min去除沉淀。取上清液置100倍体积的蒸馏水透析，浓缩后冻干备用。将3 mg OPS溶于0.6 mL0.1 M的氢氧化钠(4克NaOH/升)中，37 2 孵育1 h，加入二甲亚砜配制的异硫氰酸荧光素异构体-I(浓度为100 mg/mL)0.3 mL 再于37 2 温育1 h。结合的OPS加到110 cm的用0.01 M pH（7.40.2）磷酸缓冲液平衡的DEAE层析柱上。加10 mL15 mL缓冲液后为亮绿色，然后换为pH（7.40.2）的0.1 M的磷酸缓冲液，这将导致10 mL15 mL的缓冲液洗脱后有25 mL40 mL的绿色荧光物质洗脱下来。将此物质用作FPA 中的抗原。抗原可按比例增加。试验所用抗原的量可通过洗脱上述物质直至FPM的荧光强度达到250000至300000 而确定。抗原于5 3 以液体状态可贮存于深色瓶中数年，或冻干保存于深色瓶中。标记抗原可以从少量商业来源处获得。A.2FPA 样品稀释液称取8.5 g氯化钠，12.1 g Tris，0.5 mL Tween-20，5.7 g EDTA，加蒸馏水至1000 mL，混匀。调节pH值至7.2，121 高压灭菌30 min。室温保存。直接使用。