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蛋白质测定
衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。
    一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。
原理：凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。
    (1)  2NH2(CH2)2COOH+13H2S04    (NH4)2S04+6C02+12S02+  16H2
    (2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4
    (3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O
(4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2
试剂与仪器：
1、硫酸钾 2、硫酸铜  3、硫酸 4、2％硼酸溶液 5、40％氢氧化钠溶液
6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成．
7、0.OIN HCL标准溶液或0．01N硫酸标准溶液．
8、凯氏微量定氮仪一套。
9、定氮瓶100m1或50ml一只。10、三角瓶150ml 3只。
11、量筒50ml、lOml、lOOml。12、吸量管10ml只。
13、酸式滴定管1支。14、容量瓶100毫升1只。15、小漏斗1只。
四、操作方法：
1、  样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、硫酸铵同一方法做试剂空白试验。
2、  按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。
3、  想接收瓶内加入10ml 2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。将10ml 40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。
同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。
计算：
X =(（V1-V2）*N*0.014)/( m*（10/100）) +F*100　
X：样品中蛋白质的含量，g；
V1：样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；
V2：试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；
N：硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；
0.014：1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；
m：样品的质量（体积），g（ml）；
F：氮换算为蛋白质的系数。
注：
（1）样品应是均匀的，固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。
（2） 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上，万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。
（3）消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢2-3ml，促使氧化。
（4）在整个消化过程中，不要用强火，保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下。使氮有损失。
（5） 如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用，因此当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。
（6） 加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。
（7） 混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。
（8） 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。
（9）  吸收叶也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。
（10）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。
（11） 向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。有时铜离子与氨作用，生成深兰色的结合物[Cu(NH3)4]++
常采用的水份测定方法如下：
1、热干燥法：
① 常压干燥法（此法用的广泛）；
② 真空干燥法（有的样品加热分解时用）；
③ 红外线干燥法；
④ 真空器干燥法（干燥剂法）；
2、蒸馏法
3、卡尔费休法
4、水分活度AW的测定
下面我们分别讲述测定水分的方法。
一、常压干燥法
1、特点与原理
⑴ 特点：此法应用最广泛，操作以及设备都简单，而且有相当高的精确度。
⑵ 原理：食品中水分一般指在大气压下，100℃左右加热所失去的物质。但实际上在此温度下所失去的是挥发性物质的总量，而不完全是水。
2、干燥法必须符合下列条件（对食品而言）：
⑴ 水分是唯一挥发成分
这就是说在加热时只有水分挥发。例如，样品中含酒精、香精油、芳香脂都不能用干燥法，这些都有挥发成分。
⑵ 水分挥发要完全
对于一些糖和果胶、明胶所形成冻胶中的结合水。它们结合的很牢固，不宜排除，有时样品被烘焦以后，样品中结合水都不能除掉。因此，采用常压干燥的水分，并不是食品中总的水分含量。
⑶ 食品中其它成分由于受热而引起的化学变化可以忽略不计。
例：还原糖+氨基化合物  △→    变色（美拉德反应）+H2O↑
还有 H2C4H4O6（酒石酸）+ 2NaHCO3  →   NaC4H4O6（酒石酸钠）+2H2O+2CO2
发酵糖（NaHCO3+KHC4H4O6）  △  →H2O+CO2+ NaKC4H4O6
高糖高脂肪食品不适应
只看符合上面三点就可采用烘箱干燥法。烘箱干燥法一般是在100～105℃下进行干燥。
我们讲的上面三点，应该是具体的具体分析，对于一个分析工作人员，或者是一个技术员，虽然干燥法必须符合三点要求，那么我们在只有烘箱的情况下，而且蓑红样品不见得符合以上讲的三点，难道就不测水分吗？
例如，啤酒厂要经常测啤酒花的水分，啤酒花中含有一部分易挥发的芳香油。这一点不符合我们的第一点要求，如果用烘箱法烘，挥发物与水分同时失去，造成分析误差。此外，啤酒花中的α—酸在烘干过程中，部分发生氧化等化学反应，这又造成分析上的误差，但是一般工厂还是用烘干法测定，他们一般采取低温长时间（80～85℃烘4小时），或者高温短时（105℃烘1小时）
所以应根据我们所在的环境和条件选择合适的操作条件，当然我们应该首先明白有没有挥发物和化学反应等所造成的误差。
3、烘箱干燥法的测定要点
⑴ 取样（称样）
在采样时要特别注意防止水分的变化，对有些食品例如奶粉、咖啡等很容易吸水，在称量时要迅速，否则越称越重。
⑵ 干燥条件的选择
三个因素：①温度；②压力（常压、真空）干燥；③时间。
一般是温度对热不稳定的食品可采用70～105℃；温度对热稳定的食品采用120～135℃。
4、操作方法
清洗称量皿→烘至恒重→称取样品→放入调好温度的烘箱（100～105℃）→烘1.5小时→于干燥器冷却→称重→再烘0.5小时→称至恒重（两次重量差不超过0.002g即为恒重）
＊ 油脂或高脂肪样品，由于脂肪氧化，而后面一次重量反而增加，应以前一次重量计算。
＊ 对于易焦化和容易分解的食品，可以选用比较低的温度或缩短干燥时间。
＊ 对于液体与半固体样品，要在称量皿中加入海砂，使样品疏松，扩大蒸发的接触面，并且用一个玻璃棒作为容器。先放到沸水浴中烘，烘的差不多，再放到烘箱烘，否则不加海砂样品容易使表面形成一层膜，造成水分不易出来，另外易沸腾的液体飞沫使重量损失。
计算：水分=  G2   －   G1 /   W   
固形物（%）=100 － 水分%
G1 —— 恒重后称量皿重量（g）
G2 —— 恒重后称量皿和样品重量（g）
W —— 样品重量（g）
固形物 —— 指食品内将水分排除以后的全部残留物。其组分有蛋白质、脂肪、粗纤维、无氮抽出物和灰分等。
5、烘箱干燥法产生误差的原因
⑴ 样品中含有非水分易挥发性物质（酒精、醋酸、香精油、磷脂等）；
⑵ 样品中的某些成分和水分的结合，使测的结果偏低（如蔗糖水解为二分子单糖），主要是限制水分挥发；
⑶ 食品中的脂肪与空气中的氧发生氧化，使样品重量增重；
⑷ 在高温条件下物质的分解（果糖对热敏感）；
   果糖 C6H12O6   大于70℃  △→C6H6O3 + 3H2O
⑸ 被测样品表面产生硬壳，妨碍水分的扩散；尤其是对于富含糖分和淀粉的样品；
⑹ 烘干到结束样品重新吸水。
二、真空干燥法
1、原理：利用较低温度，在减压下进行干燥以排除水分，样品中被减少的量为样品的水分含量。
本法适用于在100℃以上加热容易变质及含有不易除去结合水的食品。其测定结果比较接近真正水分。
2、操作方法
准确称2.00～5.00g样品→于烘至恒重的称量皿→至真空烘箱→70℃、真空度93.3～98.6KPa（700～740mmHg）→烘5小时→于干燥皿冷却→称至恒重
计算：水分=  G /   W
G —— 样品中干燥后的失重（g）
W —— 样品重量（g）
真空干燥法测水分，一般用于100℃以上容易变质、破坏或不易除去结合水的样品，如糖浆、味精、砂糖、糖果、蜂蜜、果酱和脱水蔬菜等样品都可采用真空干燥法测定水分。
三、蒸馏法测定水分（迪安—斯达克）
蒸馏发出现在二十世纪初，当时它采用沸腾的有机液体，将样品中水分分离出来，此法直到如今仍在适用。
1、原理：把不溶于水的有机溶剂和样品放入蒸馏式水分测定装置中加热，试样中的水分与溶剂蒸汽一起蒸发，把这样的蒸汽在冷凝管中冷凝，由水分的容量而得到样品的水分含量。
2、步骤：准确称2.00～5.00g样品→于250ml水分测定蒸馏瓶中→加入约50～75ml有机溶剂→接蒸馏装置→徐徐加热蒸馏→至水分大部分蒸出后→在加快蒸馏速度→至刻度管水量不在增加→读数
计算：            水分=V/W
V —— 刻度管中水层的容量ml
W —— 样品的重量（g）
3、常用的有机溶剂及选择依据
常用的有机溶剂有比水清的，也有比水重的。
       苯      甲苯      二甲苯      CCl4
   密度   0.88      0.86       0.86        1.59
   沸点   80℃     80℃       140℃      76.8℃
选择依据：对热不稳定的食品，一般不采用二甲苯，因为它的沸点高，常选用低沸点的有机溶剂，如苯。对于一些含有糖分，可分解释放出水分的样品，如脱水洋葱和脱水大蒜可采用苯，要根据样品的性质来选择有机溶剂。
4、蒸馏法的优缺点
优点： 
⑴ 热交换充分 ⑵ 受热后发生化学反应比重量法少 ⑶ 设备简单，管理方便
缺点：⑴ 水与有机溶剂易发生乳化现象 ⑵ 样品中水分可能完全没有挥发出来 ⑶ 水分有时附在冷凝管壁上，造成读数误差
对分层不理想，造成读数误差，可加少量戊醇或异丁醇防止出现乳浊液。
这种方法用于测定样品中除水分外，还有大量挥发性物质，例如，醚类、芳香油、挥发酸、CO2等。目前AOAC规定蒸馏法用于饲料、啤酒花、调味品的水分测定，特别是香料，蒸馏法是唯一的、公认的水分检验分析方法。
四、卡尔—费休法
众所周知，卡尔费休法是测定各种物质中微量水分的一种方法，这种方法自从1935年由卡尔费休提出后，一直采用I2、SO2、吡啶、无水CH3OH（含水量在0.05%以下）配制而成，并且国际标准化组织把这个方法定为国际标准测微量水分，我们国家也把这个方法定为国家标准测微量水分。
1、原理：在水存在时，即样品中的水与卡尔费休试剂中的SO2与I2产生氧化还原反应。
I2 + SO2 + 2H2O  →    2HI + H2SO4
但这个反应是个可逆反应，当硫酸浓度达到0.05%以上时，即能发生逆反应。如果我们让反应按照一个正方向进行，需要加入适当的碱性物质以中和反应过程中生成的酸。经实验证明，在体系中加入吡啶，这样就可使反应向右进行。
3 C5H5N+H2O+I2+SO2 →   2氢碘酸吡啶+硫酸酐吡啶
生成硫酸酐吡啶不稳定，能与水发生反应，消耗一部分水而干扰测定，为了使它稳定，我们可加无水甲醇。
硫酸酐吡啶 + CH3OH（无水）→     甲基硫酸吡啶
我们把这上面三步反应写成总反应式为：
I2+SO2+H2O+3吡啶+CH3OH  →2氢碘酸吡啶+甲基硫酸吡啶
从反应式可以看出1mol水需要1mol碘，1mol二氧化硫和3mol吡啶及1mol甲醇而产生2mol氢碘酸吡啶、1mol甲基硫酸吡啶。这是理论上的数据，但实际上，SO2、吡啶、CH3OH的用量都是过量的，反应完毕后多余的游离碘呈现红棕色，即可确定为到达终点。
I2︰SO2︰C5H5N = 1︰3︰10
2、卡尔费休试剂的配制与标定
若以甲醇作溶剂，则试剂中I2、SO2、C5H5N（含水量在0.05%以下）三者的克分子数比例为
I2︰SO2︰C5H5N = 1︰3︰10
这种试剂有效浓度取决于碘的浓度。新配制的试剂其有效浓度不断降低，其原因是由于试剂中各组分本身也含有一些水分，但试剂浓度降低的主要原因是由一些副反应引起的，较高消耗了一部分碘。
这也说明了配制这种试剂要单独配，分甲乙两种试剂并且分别贮存，临用时再混合，而且要标定。
甲液   I2的CH3OH溶液
乙液   SO2的CH3OH吡啶溶液
这种方法对试剂要求严格，要求甲醇、吡啶都是无水的，并且要求有KF水分测定仪（上海化工研究所制）
配制： 称85gI2→于干燥的有塞棕色烧瓶中→加670ml无水CH3OH→塞上瓶塞→振摇使I2全部溶解→加270ml吡啶→混匀→于冰水浴冷却→通干燥的SO2气体60g→塞上瓶塞→于暗处24小时后标定使用
标定：先加50ml无水甲醇→于反应器中→接通电源→启动电磁搅拌器→用KF试剂滴入甲醇中使甲醇中尚残留的痕量水分与试剂达到终点（即指针到达一定刻度，不记录KF试剂用量）→保持一分钟→用10μl注射器从反应器加料口注入10μl蒸馏水（相当于0.01g水）→电流表指针接近零点→用KF试剂滴定到原定终点→记录
F =G*100/V
F —— KF试剂的水当量（mg/ml）
V —— KF滴定消耗试剂的体积（ml）
G —— 水的重量（g）
3、步骤
对于固体样，如糖果必须预先粉碎，称0.30～0.50g样于称样瓶中
取50 ml甲醇 → 于反应器中，所加甲醇要能淹没电极，用KF试剂滴定50ml甲醇中痕量水 → 滴至指针与标定时相当并且保持1min不变时 → 打开加料口 → 将称好的试样立即加入 → 塞上皮塞 → 搅拌 → 用KF试剂滴至终点保持1min不变 → 记录
计算：
水分=FV/W
F —— KF试剂的水当量（mg/ml）
V —— 滴定所消耗的卡尔费休试剂（ml）
W —— 样品重量（g）
注：① 此法适用于食品中糖果、巧克力、油脂、乳糖和脱水果蔬类等样品；
② 样品中有强还原性物料，包括维生素C的样品不能测定；
③ 卡尔费休法不仅可测得样品中的自由水，而且可测出结合水，即此法测得结果更客观地反映出样品中总水分含量。
④ 固体样品细度以40目为宜，最好用粉碎机而不用研磨，防止水分损失。
五、水分活度值的测定
食品中水分活度的检验方法很多，如蒸汽压力法、电湿度计法、附感敏器的湿动仪法、溶剂萃取法、扩散法、水分活度测定仪法和近似计算法等。一般常用的是水分活度测定仪法（AW测定仪法）、溶剂萃取法和扩散法。水分活度测定仪法操作简便，能在较短时间得到结果。
1、AW测定仪法
⑴ 原理：在一定温度下主要利用AW测定仪中的传感器根据食品中水的蒸汽压力的变化，从仪器的表头上读出指针所示的水分活度。在样品测定前需用氯化钡和溶液校正AW测定仪的AW为9.000。
⑵ 步骤
① 仪器校正
两张滤纸→浸于氯化钡饱和液中→用小夹子轻轻地把它放在仪器的样品盒内→然后将传感器的表头放在样品盒上，轻轻地拧紧→于20℃恒温烘箱→加热恒温3小时后→将校正螺丝校正AW为9.00
② 样品测定
取样→于15～25℃恒温后→（果蔬样品迅速捣碎取汤汁与固形物按比例取样→肉和鱼等固体试样需适当切细）→于容器样品盒内→将传感器的表头置于样品盒上轻轻地拧紧→于20℃恒温烘箱中→加热2小时后→不断观察表头仪器指针的变化情况→等指针恒定不变时→所指的数值即为此温度下试样的AW值
2、溶剂萃取法
⑴ 原理：食品中的水可用不混溶的溶剂苯来萃取。苯在一定温度下其萃取的水量随样品中水分活度而变化，即萃取的水量与水相中的水分活度成比例，其结果与同温度下测定的苯中饱和溶解水值与水相中的水的比值即为该样品的水分活度。
⑵ 步骤
称样1.00g → 于250 ml磨口三角烧瓶 → 加100ml苯 → 塞上瓶塞 →振摇1小时 → 静置10分钟 →
吸50ml → 于卡尔费休水分测定器中 → 加无水甲醇70ml → 混合 →用KF试剂滴至微红色→ 置电
流指针再不变即为终点 → 记录
求苯中饱和溶解水值：
取蒸馏水10ml代替样品 → 加苯100 ml → 振摇2分钟 → 静置5分钟 →同上样品测定
⑶ 计算
AW =[H2O]n×10/[H2O]0
AW —— 样品中水分活度值
[H2O]n —— 从食品中萃取的水量，即从KF试剂滴定度乘滴定样品消耗KF试剂毫升数
[H2O]0 —— 测定纯水中萃取水量
3、扩散法
样品在康威氏微量扩散皿密封和恒温下，分别在较高和较低的标准饱和溶液中扩散平衡后，根据样品重量的增加和减少的量，求出样品中AW值。
六、其它测定水分方法
1、化学干燥法
化学干燥法就是将某种对于水蒸汽具有强烈吸附作用的化学药品与含水样品同装入一个干燥器（玻璃或真空干燥器），通过等温扩散及吸附作用而使样品达到干燥恒重，然后根据干燥前后样品的失重即可计算出其水分含量，此法在室温下干燥，需要较长时间，几天、几十天甚至几个月。
干燥剂有五氧化二磷、氧化钡、高氯酸镁、氢氧化锌、硅胶、氧化氯等。
2、微波法
微波是指频率范围为103～3×105MHZ的电磁波。当微波通过含水样品时，因水分引起的能量损耗远远大于干物质所引起的损耗，所以测量微波能量的损耗就可以求出样品含水量。
3、红外吸收光谱法
红外线属于电磁波，波长0.75～1000μm的光。红外波段可分三部分：① 近红外区 0.75～2.5μm；② 中红外区 2.5～25μm；③ 远红外区 25～1000μm。
根据水分对某一波长的红外光的吸收程度与其在样品中含量存在一定的关系的事实即建立了红外光谱测定水分方法。
*   *    *    *    *    *    *    *    *   *    *
（1）水分测定常用什么方法？它对被检验物有何要求？误差可能来自哪些方面？
（2）蒸馏法测定水分主要有哪些优点？常有试剂有哪些，使用依据是什么？
（3）卡尔费休试剂？此方法如何完成水分定量测定的？
糖的测定方法有很多，大致可分为三类
1.物理法，（1.旋光法,  2 .折光法,  3.比重法,）
2.物理化学法,(1.点位法, 2极普法, 3.光度法, 4.色谱法)
3.化学方法,(1.斐林氏法. 2.高锰酸钾法. 3.碘量法. 4.铁氰化钾法. 5.蒽铜比色法. 6.咔唑比色法)
一.  总糖的测定
食品中的总糖主要指具有还原性的葡萄糖，果糖，戊糖，乳糖和在测定条件下能水解为
还原性的单糖的蔗糖（水解后为1分子葡萄糖和1分子果糖），麦芽糖（水解后为2分子葡萄糖）以及可能部分水解的淀粉（水解后为2分子葡萄糖）。还原糖类之所以具有还原性是由于分子中含有游离的醛基（-CHO）或酮基(=C=O)。
测定总糖的经典化学方法都是以其能被各种试剂氧化为基础的。这些方法中，以各种根据斐林氏溶液的氧化作用的改进法的应用范围最广。在这里我们主要给大家介绍铁氰化钾法，蒽铜比色法，斐林氏容量法。斐林氏容量法由于反应复杂，影响因素较多，所以不如铁氰化钾法准确，但其操作简单迅速，试剂稳定，故被广泛采用。蒽铜比色法要求比色时糖液浓度在一定范围内，但要求检测液澄清，此外，在大多数情况下，测定要求不包括淀粉和糊精，这就要在测定前将淀粉，糊精去掉，这样就使操作复杂化，限制了其广泛应用。
（一）    铁氰化钾法
1.原理：样品中原有的和水解后产生的转化糖都具有还原性质，在碱性溶液中能将铁氰化钾还原，根据铁氰化钾的浓度和检验滴定量可计算出含糖量。其反应为下：
C6H12O6+6K3[Fe(CN)6] + 6KOH →(CHOH)4·(COOH)2 + 6K4［Fe(CN)6］+ 4H2O
滴定终了时，稍过量的转化糖即将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体。
2，试剂
1）1％的次甲基兰指示剂
2)盐酸（水解作用）
3）10％和30％的NaOH溶液
4）1％铁氰化钾（贮存特色瓶，临用前标定）
标定步骤
称蔗糖1.0000g→定容500ml→取此液50ml→于100ml容量瓶→加hcl5ml→摇匀→65-70℃水裕15分钟→取出冷却→用30％NaOH中和→加水于刻度→倒入滴定管中→取10ml1％铁氰化钾于锥形瓶中→加10％NaOH2.5ml加12.5ml的水加玻璃珠颗粒→加热至沸→保持一分钟→加次甲基兰1滴→立即以糖液滴足至蓝色退去为止，记录用量。
正式滴定比较滴定时少0.5ml糖液，煮沸1分钟，加指示剂一滴，再用糖液滴定至兰色褪去，计算铁氰化钾溶液的浓度。
A=(W·V)/(1000×0.95)
A：相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的量（克）
V：滴定时消耗的糖液的体积
W：称取纯蔗糖的量
1000：稀释比
0.95：换算等数
3．操作方法
稀释10g→用100ml水作溶液→于250ml容量瓶→加20％醋酸铅10ml→至沉淀完为止→加10ml10％NA2HPO4→至不在产生沉淀为止→加水至刻度→过滤－取滤液50ml→于100ml容量瓶中→按铁氰化钾标定法进行转化，中和及滴定
计算糖含量
总糖（以转化糖计%）= (A × 1000)/(W·V)× 100                                            
A：相当于10ml铁氰化钾溶液的转化糖的重量，
W：样品的重量
V：滴定时样液消耗的体积
4．实验应注意
（a）达终点时，过量的转化糖将指示剂次甲基兰还原为无色的隐色体，隐色体容量受空气中氧所氧化，很快又变
成指示剂的颜色。
（b）整个过程应在低温电炉上进行，滴定要速度，否则终点不明显
（c）糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓度
成正比，单、双糖等糖类都直接于试剂发生作用，因此不需要水解。
（二）蒽铜的比色法
1.原理：糖与硫酸反应脱水生成羟甲基呋喃甲醛，生产物再与蒽铜缩合成兰色化合物，其颜色深浅与溶液中糖的浓
度成正比，可比色定量。
2.试剂
（1）    硫酸锌溶液：溶解500g化学纯硫酸锌于500ml水中
（2）    亚铁氰化钾溶液：溶解10.6g化学纯亚铁氰化钾于100ml水中
（3）    0.2％蒽铜试剂：溶解蒽铜0.2g于100ml95％硫酸中，置棕色瓶中冷暗处保存
（4）    0.1％葡萄糖液：准确称干燥葡萄糖0.1000g 定容100ml
3.操作方法
（1）    标准曲线绘制
（2）    100ml容量瓶编号 
沸水浴加热6分钟，取出冷却→用1cm比色杯→610nm测定吸光度→作出以吸光度为横坐标，糖液浓度为纵坐标的准
曲线
（3）样品测定
称10g样品→于100ml热水加入500ml容量瓶中－加硫酸锌5ml→沸水浴5分钟→取出再摇动下加亚铁氰化钾5ml，→冷却→定容500ml→过滤→吸滤液25ml→于250ml容量瓶→定容250ml→取稀释液1ml，于比色管中→加10ml蒽铜试剂→摇匀→水浴加热6分钟→冷却→比色
试验注意
1，样液必须清澈透明，加热后不应有蛋白质沉淀
2，样品颜色较深时，可用活性炭脱色后再进行测定
3，此法与所用的硫酸浓度和加热时间有关
4，所取糖液浓度在1-2.5mg/100ml之间
二.  还原糖的测定方法
还原糖包括葡萄糖、果糖、麦芽糖，在葡萄糖分子中含有淤青的醛茎，在果糖分子中含有淤青的酮茎，在乳糖中和
麦芽糖中含有淤青的半缩羧茎，因此都有还原性。在测定还原糖时一般测定总糖时所有将糖类水解为转化糖再测定
的方法都可用来测定还原糖。
（一）斐林氏容量法
1.此法的原理、试剂、方法与总糖的测定方法相同。只是样品溶液不必以过转化，而是直接取滤液进行滴定，滤液进行滴定，滤液中的还原糖含量以在0.2-0.5%为好，又能通过增减样品量或改变稀释倍数来调节。10毫升费林氏A、B液混合时理论上相当还原糖量如下：
葡萄糖（无水）果糖或转化糖尿病  0.0500克
乳糖尿病                        0.0678克
麦芽糖                          0.0807克 
2试剂
（1）    斐林氏A液，称69.8g cp硫酸铜于100ml水中，过滤备用
（2）    斐林氏B液，称34.6g.cp浓流锌钠和100gcp NaOH于1000ml水中，过滤备用
3方法
称取样品10-20g：制备与转化同铁氰化钾法。将样液倒入滴管中，吸取A,B液准备预滴定
预滴定：
吸A、B液各5ml→从滴管中加15ml样液→加热至沸→继续滴加样液→至兰色变潜→加3滴次甲基兰→在1分钟内滴定到终点
达到终点时，稍微过量的转化糖，将兰色的次甲基兰染色体还原为无色的隐色体，而显出氧化亚铜的红色，去碱性条件下加热糖的产物是复杂的。
去碱性中断裂是由于碱度不同，加热时间不同，生产不等的碎片，这种碎片给后面滴定带来误差，而且，这种碎片与糖没有化合量的关系，所以，Lanecrol-Eynon Method 作出数据检索表
正式滴定：
吸A,B液各5ml→于三角瓶→加比预定量少0.5-1.0ml样液→2分钟内要求沸腾1分钟→加3滴指示剂→用样液滴定兰色消失
总沸腾时间为3分钟，即滴定在3分钟完成。
计算：
还原糖＝( F·V2)/(W·V1)×100
F：转还糖回数，即与10ml斐林氏试液相当的转化糖毫克数，
V1：样品试液总体积
V2：样品试液滴定量
W：样品重量
在测量乳糖制品时，若蔗糖与乳糖的含量比超过3：1时，则应与滴定量中加上相关表中（课本中表9-8）校正值后在进行计算
我们举例如下：
如果标准果糖溶液度为每100ml溶液含糖262.5mg。对于10ml斐林试液从9-5可以查得果糖液滴定应为20ml。如果不是20ml，可先算出A,B液 校正等数。然后进行计算
再如标准糖溶液浓度为每100ml溶液含糖199.3ml，对于10ml A,B液 从9-4中查到，糖液滴定量应为 25.00ml，若有出入可校正。如果要求不高，可省略校正步骤但要求1％得测定误差，则省略校正。另外有时候并未根据检索表计算样含糖量，但对A,B液进行标定，以使确定相当得 还原糖量。这种误差为0.5％。下面我们讲标定量A,B液
准确准确称取烘干冷却得 A.R蔗糖1.5g→用水溶解称取250ml容量瓶中→定容→吸50ml于100ml 定量瓶中→加HCL5ml→再65-70摄氏度水裕15分钟→冷却→用30％NaOH中和→定容
准确吸A,B液 各5ml于三角瓶中→加水约50ml玻璃珠三粒→加热至沸→保持1分钟→加指示剂1滴→再煮1分钟→立即用糖液滴定至兰色褪去，红色出现即为终点
正式滴定，先加入比预滴定时少0.5ml左右得糖液煮沸1分钟→加指示剂1滴→再煮沸1分钟→继续滴至终点
计算： A＝W*V/500×0.95
A：相当于10ml斐林氏A、B液的转化糖的量
W：称取蔗糖的质量
V ：滴定蔗糖的量
500：稀释比
0.95：换算等数
最后计算：
总糖（还原糖）以转化糖计%=（A*1000/W*V）*100
A：同上
W：制取样品的量
V：滴定是时样品消耗量
1000：是稀释倍数（100/50*500）
1.预测定的目的：对样品溶液中还原糖浓度有一定要要求（0.1%左右），测定时样品溶液的消耗体积应该与标定葡萄糖标液的消耗体积相近，通过测定了解样品浓度是否合适，浓度过大或过小应该加以调整，使测定时消耗样品溶液量在10毫升左右；二是通过测定可知道此溶液的大概消耗量，以便在正式的滴定时，预先加入比实际用量少1毫升左右的样液，只留下1ml左右的样液在续滴定时加入，以便保证在1分钟内完成续滴定工作，提交预测定的准确度。
2.此实验影响测定结果的主要操作因素是反应液碱度、热源强度，煮沸时间和滴定速度一般煮沸时间短消耗糖多，反之，消耗糖液少，滴定速度过快，消耗糖量多，反之，消耗糖量少。另外溶液碱度愈高，二价铜的还原愈快，因此必须严格控制反应的体积，使反应体系碱度一致。热源一般采用800W电炉，反应液在2秒内沸腾。
（二）KMNO4（高锰酸钾法）
1．原理，还原糖在碱性溶液中使铜盐还原成氧化亚铜，在酸性条件下，氧化亚铜能使硫酸铁还原为硫酸亚铁，再用KMNO4溶液滴定硫酸亚铁，即可标出还原糖的量。
2. 操作方法
（1）样品处理
a. 乳糖：包括乳制品以及含蛋白质的冷食类
 称样2-5g（液体样25~50ml）→于250ml容量瓶→加水50ml→加A液10ml+1N NaOH 4ml→定容→静置30秒→过滤→弃去初液→可测还原糖及蔗糖用。
b. 低酒度饮料：麦精露、各类汽酒等饮料。
先暴气除CO2→取100ml→于蒸发皿中→用1 N NaOH 中和→沸水浴蒸至原体积四分之→转入250ml容量瓶→加50ml水→摇匀→（加A液10ml→加1 N NaOH 4ml）→加水至刻度→静置30秒→过滤。
c. 含多量淀粉的食品：婴儿食品、糕干粉、宝宝乐、代乳粉、饼干、面包、糕点等
 称样10-20g→250ml容量瓶→加水200ml→45度水浴加热1小时→不停摇动→冷后加水至刻度→静置→吸出清夜200ml于另一容量瓶（250ml）→加A液10ml+1N NaOH 4ml→静置30秒→过滤。
d. 汽水、果露、国产七种可乐及可口可乐
 处理CO2→吸样液100ml→于250ml容量瓶→加水至刻度→可测还原糖及蔗糖。
（2）测定方法
取50ml处理的样液→于400ml烧杯→加A、B液各25ml→加热在4min左右沸腾→再煮2min→趁热抽滤→用60℃水洗烧杯和沉淀→直到洗液不成碱性→将抽滤的纸（或者石棉）及Cu2O→转入原来烧杯→用25ml硫酸铁溶液冲洗抽滤瓶→使冲洗液全部洗入原烧杯中→加水25ml→使Cu2O溶解→用0.1N KMnO4标液滴定至微红色，同时用50ml水按上述方法做空白实验。
 （3）计算
3. 注意事项：
（1）煮沸后的溶液显红色不显兰色，则表示糖量高，可减少取样体积。
（2） 在洗涤Cu2O的整个过程中应使沉淀上层保持一层水层，以隔绝空气，避免Cu2O被空气中的氧所氧化。
（3）此法适用于各类食品中还原糖的测定，有色样液不受限制，准确度高，重现性好。准确性和重现性都优于直接滴定法，但操作复杂、费时，需使用特制的高锰酸钾法糖类检索表。
（二）直接滴定法（斐林氏溶液法）
1.     原理
样品经过处理除去蛋白质等杂质后，加入盐酸，在加热条件下使蔗糖水解为还原性单糖，用直接滴定法测定水解后样品中的还原糖总量。
2. 试剂
3. 方法
（1）    取过量样品进行提取，放入250ml容量瓶，加5ml醋酸锌和5ML亚铁氰化锌，定容，静止30分后过滤，滤液备用。
（2）    测定
样品预滴定：
取A、B液各5ml于三角瓶中加水10ml，玻璃珠数粒，加热在2分内沸腾，趁热滴定，滴定到兰色褪去，记录用量。
正式滴定：
取A、B液各5mL于三角瓶→加玻璃珠三粒→从滴定管直接加比预滴定时少0.5-1.0ML样液，在2分沸腾，趁热滴定兰
色褪去，记录，取三次平均值计算结果。
三．蔗糖的测定
1．原理：样品除蛋白质后，其中的蔗糖经盐酸水解转化为还原糖，用还原糖的测定方法，确定样品中蔗糖的含量。
实际上测定还原糖包括两部分：一是样品中原有的还原糖、二是蔗糖经酸水解后的还原糖。
2．方法
吸还原糖样品处理稀释液50mL→于100ML容量瓶→加→于68-70度水浴上15分→冷却→加甲基红2滴→中和→定容→
取此溶液按还原糖的测定方法测定。
2．计算
蔗糖%=F(100/V2-100/V1) /(W╳50/250╳1000)╳ 100╳0.95
式中：F：10ml斐林氏试液相当于转化糖的质量mg。
V1：测定时消耗未经水解的样品稀释体积ml
V2：测定时消耗经过水解的样品稀释体积ml
w：原测定还原糖时样品的重量(G)
1000：将毫升换算成克
0.95：分子的蔗糖经水解后成为2分子的还原糖(一分子的葡萄糖和一分子的果糖)蔗糖的分子量为342,后来成为2×180.则342/360=0.95.所以转化糖换算到蔗糖应乘以0.95.
四.纸上层析法.
在食品中,糖的组分较为复杂,在淀粉糖浆中含有麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖、麦芽四糖等多种组分.对于这些食品中的各种组分,不可能用化学分析方法进行测定,而用物理分析方法进行测定.
纸层析应用于糖类的分离分析,它利用混合物中各组分物理化学性质的差别,使各组分以不同速度移动而达到分离.
比移值Rf==组分展开的距离/溶剂展开的距离
糖的RF值的规律为:
单糖>双糖>三糖 
戊糖>己糖 
酮糖>醛糖
实验室常用的展开剂:
正丁醇:HAc:H2O==4:1:5
常用的显色剂:
0.1N AgNO3:NH4OH(SN)=1:1(灵敏度高，但斑点易扩散)
AgNO3/丙酮:NaOH/乙醇=1:1(克服上面缺点)
（显色剂书上给出许多,同学们可以自己看）
样品的处理可采用常规法如:糖的提取和蛋白质的除去可看前面讲的。
根据Rf值可求出各种糖的Rf与标准样品的Rf值进行比较,可确定出糖的种类,也可进行定量,用斑点光密度定量法直接在滤纸上测定.用斑点面积校正进行定量。
窗体窗体底端
窗体顶端