水质粪大肠菌群操作注意事项-作业指导书1.doc

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作业指导书
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标题：水质 粪大肠菌群的测定 多管发酵法作业指导书
水质粪大肠菌群的测定 多管发酵法作业指导书
本试验基本操作参照《HJ/T 347—-2007 水质粪大肠菌群的测定 多管发酵法和滤膜法（试行)》制定此作业指导书.
1.培养基、试剂与仪器 
本标准所用试剂除另有注明外,均为符合国家标准的分析纯化学试剂；实验用水为新制备的去离子水；操作者必须建立“无菌概念”和掌握“无菌操作技术"，所有涉及微生物操作的器皿必须进行灭菌，试验中避免所有可能造成微生物污染的操作。 
单倍乳糖蛋白胨培养液：称取23.0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的玻璃倒管（杜氏小管)的20x200mm试管中，每试管10ml（注意玻璃倒管中不能有气泡，若出现气泡，可用手指轻弹玻璃管）塞紧塞子，置于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min,贮存于暗处备用。
三倍乳糖蛋白胨培养液:称取69。0g乳糖蛋白胨培养基于1L蒸馏水中(注意煮沸步骤可能糊底,也可用二倍乳糖蛋白胨培养液替代）,其它操作同上。
EC 培养液：称取37。0gEC肉汤于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全，分装于含有倒置的小玻璃管的试管中,每管10ml（操作方法同单倍乳糖蛋白胨营养液）,于高压蒸汽灭菌器中，在115℃灭菌20min，贮存于暗处备用。
伊红美蓝培养基：称取36。0g伊红美蓝培养基于1L蒸馏水中，加热煮沸至完全溶解后，分装于三角烧瓶中。于高压蒸汽灭菌器中，在121℃灭菌15min,贮存于暗处备用。
生理盐水：在烧杯中配制适量的质量分数为0。9%的生理盐水，分装于试管中，每试管9.5mL,于高压蒸汽灭菌器中,在121℃灭菌15min，贮存于暗处备用。（本实验室中灭菌锅蒸发量为0。5mL）
培养基的存放 :在密封瓶中的脱水培养基成品要存放在大气湿度低、温度低于30℃的暗处,存放时应避免阳光直接照射，并且要避免杂菌侵入和液体蒸发。当培养液颜色变化，或体积变化明显时废弃不用。本实验室将培养基放置在4℃冰箱中保存。
实验所需仪器 :超净工作台（有条件的实验室建议使用生物安全柜）、恒温培养箱、高压蒸汽灭菌器、冰箱、酒精灯、天平、电炉、500mL广口瓶、烧杯、玻璃棒、玻璃发酵管、试管架、移液管、移液枪、接种环等，详见附件.
2。试验前期准备 
器皿灭菌（高压蒸汽灭菌）:所用采集水样的广口玻璃瓶、玻璃试管、移液管、玻璃棒、移液枪枪头等器皿均需放入高压锅灭菌. 
采样广口玻璃瓶：将清洗干净的采样瓶盖好瓶盖，用牛皮纸将瓶盖、瓶顶和瓶颈处包裹好，用绳子绑好；培养皿：将清洗干净的培养皿，用牛皮纸包裹好，用绳子绑好。置于121℃的高压蒸汽灭菌器灭菌15min。培养皿：（湿热灭菌后4h内采集水样.本实验室采用干热灭菌法，145℃灭菌4。5h.可保存一个月，一个月后重新灭菌.采样瓶要抽样做无菌验证试验。）
玻璃试管（已经装好培养液）：将7支玻璃试管一捆用牛皮纸将上部包裹好，用绳子绑好。生理盐水：将10支玻璃试管一捆用牛皮纸将上部包裹好，用绳子绑好。移液枪枪头（将枪头插入枪盒后，用牛皮纸将其包裹好，用绳子绑好。）置于的高压蒸汽灭菌器121℃灭菌15min。(将包裹好灭菌后的枪盒用低温（45℃~72℃）烘干，存放时间更长。）
采样:采取水样时严格按照无菌操作进行，可握住瓶子下部直接将已灭菌的带盖采样瓶插入水中，约距水面10～15cm处,拔瓶盖，瓶口朝水流方向，使水样灌入瓶内然后盖上瓶盖,将采样瓶从水中取出。如果没有水流,可握住瓶子水平前推，直到充满水样为止。采好水样后，迅速盖上瓶盖和包装纸。（采样体积建议450mL~500mL最好，采自来水或含余氯水样时采样瓶（500mL)在灭菌前应加1.5％硫代硫酸钠2mL。） 采好的水样,应迅速运往实验室，进行检验，一般从取样到检验不宜超过2h,否则应使用10℃以下的冷藏设备保存样品，但不得超过6h。 
3.水样接种量 
将水样充分混匀后,根据水样污染的程度确定水样接种量。每个样品至少用三个不同的水样量接种。同一接种水样量要有五管。 
相对未受污染的水样（自来水、水源水、直饮水）接种量为10mL、1mL、0.1mL。受污染水样(生活污水）接种量根据污染程度接种1mL、0。1mL、0。01mL 或0.1mL、0。01mL、0.001mL 等。（根据实验经验,经过紫外消毒的水样取0。1mL、0。01mL、0.001mL体积进行检测，可根据水样的洁净度适当调整取样体积。）如接种体积为10mL，则试管内应装有三倍浓度乳糖蛋白胨培养液5mL（本实验室采用:二倍浓度乳糖蛋白胨培养液10mL）；如接种量为1mL 或少于1mL,则可接种于普通浓度的乳糖蛋白胨培养液10mL 中。
4 .初发酵试验 
将水样分别接种到盛有乳糖蛋白胨培养液的发酵管中.在37℃±0。5℃下培养24h±2h.产酸和产气的发酵管表明试验阳性（产酸发酵管由紫色变为黄色）。如在倒管内产气不明显，可轻拍试管，有小气泡升起的为阳性。（一般生活污水在接种2-4h后发酵管中有明显的大量气泡产生。)
5。平板分离 (推荐步骤,HJ/T347-2007无此步骤，此步骤为确定是否为大肠菌群操作,有条件实验室可进行，如无条件可跳过直接进行6。复发酵试验）
        将经24 h和48 h培养后产酸产气的发酵管,分别划线接种于伊红美蓝琼脂平板上，再于37 ℃培养18～24 h,将符合下列特征的菌落进行染色镜检（用革兰氏染液镜检,主要步骤有初染、媒染、脱色、复染.镜检后油镜镜头必须清洗干净）. a.深紫黑色,有金属光泽；b.紫黑色，不带或略带金属光泽； c.淡紫红色，中心颜色较深. 
6.复发酵试验 
轻微振荡初发酵试验阳性结果的发酵管，用3mm 接种环或灭菌棒将培养物转接到EC 培养液中。在恒温培养箱中44。5℃±0。5℃温度下培养24h±2h。培养后立即观察，发酵管产气则证实为粪大肠菌群阳性。
7。结果的计算 
根据不同接种量的发酵管所出现阳性结果的数目,表3（HJ/T 347-2007） 中查得每100mL水样中的粪大肠菌群。如接种水样为,接种5份10mL 水样、5 份1mL 水样、5 份0.1mL 水样时，查表3 求得MPN 指数,MPN 值再乘10，即为1L水样中的粪大肠菌群数.如果接种的水样不是10mL、1mL 和0。1mL，而是较低的或较高的三个浓度的水样量,也可查表3 求得MPN 值，再经下式计算成每1L水 的MPN 值，如接种前水样已经过多级稀释，还需要乘以水样稀释倍数。
MPN值=MPN指数*10(mL）/接种量最大的一管（mL)
7。试验过程注意事项 
1) 接种前的准备工作 
a．检查接种工具，进行环境消毒：微生物检测实验室尽可能为独立房间,避免环境污染。实验前提前半小时将无菌室的紫外灯对环境进行消毒，进入房间后关闭紫外灯.实验开始前用75％乙醇将台面和双手进行消毒）。 
b．在欲接种的培养基试管上贴好标签,标上接种的菌名、操作者、接种日期等。 
c．将培养基、接种工具和其他试验涉及的用品全部放在实验台上摆好，进行环境消毒。
  2）初发酵接种 
将移液枪调整至取样体积，装上已消毒相应的移液枪枪头，分别取三个不同体积的水样至已灭菌消毒的装有单倍乳糖蛋白胨培养液的试管中。（采样瓶中水样在接种之前应充分摇匀.当接种量小于1mL 时，应采取逐级稀释法进行接种，如要接种量为0。01ml水样，可在无菌操作条件下，先从样品中取1ml水样接种于上述已灭菌的生理盐水试管中在微型旋涡混合器上振荡均匀，再从上述试管中在取1ml水样接种于上述已灭菌的生理盐水试管中在微型旋涡混合器上振荡均匀.最后从此试管中取1ml水样接种于灭菌后的发酵管中进行发酵培养.）
3）复发酵接种 
  将产酸产气的发酵管进行镜检，当镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌时，进行复发酵试验（也可不进行镜检，直接进行复发酵试验）.
4） 试验过程应严格在无菌条件下进行，同时注意个人防护措施，做实验时应穿实验服(有条件的应穿隔离衣），穿带口罩、鞋套、手套、头套等。试验结束时实验室废弃物应进行消毒处理（高压蒸汽灭菌锅灭菌），应对实验室进行酒精/过氧化氢拖洗，试验台擦洗等，最后进行紫外线灯对环境进行消毒。
附件：实验室所需物品清单
仪器名称
仪器规格
仪器数量
生物安全柜/超净工作台
台面可双人操作
1台
生化培养箱
可调温度包含 常温～50℃
2台
恒温干燥箱
最高温度200℃以上
1台
显微镜
带×10/×16物镜、100倍油镜
1台
微型旋涡混合器
2000次/分以上
1台
高压蒸汽灭菌锅
30L以上，带恒温、定时设置功能
1台
冰箱
冷藏室宜较大
1台
空调
置于恒温培养箱屋内
1台
天平
0～500g，精度0。001g
1台
万用电炉
普通电炉
1台
移液枪
最大刻度 1mL/5mL
各1只
移液枪架
聚乙烯枪架
1只
移液枪头
配套1mL/5mL枪头
各1包
移液枪头盒
配套1mL/5mL枪头
各3个
脱脂棉
普通医用脱脂棉
1包
牛皮纸
120g左右大张牛皮纸
10张
棉线
普通棉线
1包
接种环
金属丝接种环
1根
手术剪
普通全金属手术剪
2只
扁嘴镊
普通全金属扁嘴镊
2只
酒精灯
普通玻璃/金属酒精灯
2只
试管
15×150mm试管配对应乳胶塞
50只
试管
20×200mm试管配对应乳胶塞
100只
试管架
适合15mm试管不锈钢丝试管架
2只
试管架
适合20mm试管不锈钢丝试管架
3只
试管刷
小号,可刷15mm和20mm试管
5只
杜氏小管
6×30mm玻璃小倒管
200只
玻璃三角烧瓶
150mL配对应乳胶塞
5只
玻璃三角烧瓶
250mL配对应乳胶塞
5只
玻璃三角烧瓶
500mL配对应乳胶塞
2只
玻璃培养皿
90mm直径
20个
玻璃烧杯
1000mL
2个
载玻片/盖玻片
规格配套
1盒
表面皿
φ80mm
5个
表面皿
φ60mm
5个
搪瓷托盘
中号
2个
广口玻璃采样瓶
500mL,耐高压,推荐蜀牛牌
10个
松柏油
小瓶
1瓶
革兰氏染液
一盒套装
1套
过氧化氢
国药30%浓度
4瓶
乙醇
国药无水乙醇
10瓶
乳糖蛋白胨培养基
推荐北京陆桥牌，混合培养基采购前应注意查看成分列表是否和国标相符.如未采购到成品混合培养基需按国标要求采购单品药剂：蛋白胨、牛肉浸膏、乳糖、氯化钠、溴甲酚紫。
1瓶
EC培养液(EC肉汤）
推荐北京陆桥牌，混合培养基采购前应注意查看成分列表是否和国标相符。如未采购到成品混合培养基需按国标要求采购单品药剂：胰胨(胰蛋白胨）、胆盐三号、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、氯化钠.
1瓶
伊红美蓝琼脂培养基
推荐北京陆桥牌,如未采购到成品混合培养基，则采购单品药剂：蛋白胨20g、乳糖10g、磷酸氢二钾2g、2％伊红溶液20mL、0.65％美蓝溶液10mL，蒸馏水1L，pH7。1。
1瓶