2022年高三生物(人教版)一轮复习-基础课时案43-基因工程原理及技术-考点探究.docx

考点一　基因工程的原理及工具　
[典例引领]
【典例】 (2022·课标，40)依据基因工程的有关学问，回答下列问题。
(1)限制性核酸内切酶切割DNA分子后产生的片段，其末端类型有________和________。
(2)质粒运载体用EcoRⅠ切割后产生的片段如下：
AATT C……G
G……CTTAA
为使运载体与目的基因相连，含有目的基因的DNA除可用EcoR Ⅰ切割外，还可用另一种限制性核酸内切酶切割，该酶必需具有的特点是____________________。
(3)按其来源不同，基因工程中所使用的DNA连接酶有两类，即________DNA连接酶和________DNA连接酶。
(4)反转录作用的模板是________，产物是_______________。
若要在体外获得大量反转录产物，常接受________技术。
(5)基因工程中除质粒外，________和________也可作为运载体。
(6)若用重组质粒转化大肠杆菌，一般状况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，缘由是______________。
解析　此题考查基因工程应用的相关学问。(1)DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有黏性末端和平末端两种类型。(2)为使运载体与目的基因相连，应使二者被切割后产生的末端相同，故用另一种限制酶切割产生的末端必需与EcoR Ⅰ切割产生的末端相同。(3)依据酶的来源不同，DNA连接酶分为E·coli DNA连接酶和T4 DNA连接酶。(4)以RNA为模板，合成DNA的过程称为逆转录，若要体外获得大量DNA分子，可以使用PCR技术。(5)在基因工程中，通常利用质粒作为运载体，另外噬菌体和动植物病毒也可作为运载体。(6)大肠杆菌作为受体细胞时，常用Ca2＋处理，使之成为能吸取四周环境中DNA分子的感受态细胞。
答案　(1)平末端　黏性末端　(2)切割产生的DNA片段末端与EcoRⅠ切割产生的相同　(3)T4　E·coli　(4)mRNA(或RNA)　cDNA(或DNA)　PCR(聚合酶链式反应)　(5)动植物病毒　噬菌体　(6)未处理的大肠杆菌吸取质粒(外源DNA)的力量极弱

1．基因工程的基本原理和理论基础概括(如下图)

2．限制酶选择的留意事项

(1)依据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类
①应选择切点位于目的基因两端的限制酶，如图甲可选择PstⅠ。
②不能选择切点位于目的基因内部的限制酶，如图甲不能选择SmaⅠ。
③为避开目的基因和质粒的自身环化和任凭连接，也可使用不同的限制酶切割目的基因和质粒，如图甲也可选择用Pst Ⅰ和EcoR Ⅰ两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。
(2)依据质粒的特点确定限制酶的种类
①所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相全都，以确保具有相同的黏性末端。
②质粒作为载体必需具备标记基因等，所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构，如图乙中限制酶Sma Ⅰ会破坏标记基因；假如所选酶的切点不是一个，则切割重组后可能丢失某些片段，若丢失的片段含复制起点区，则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
易错警示！　基因工程操作基本工具的8个易错点
(1)限制酶是一类酶，而不是一种酶。
(2)限制酶的成分为蛋白质，其作用的发挥需要适宜的理化条件，高温、强酸或强碱均易使之变性失活。
(3)在切割目的基因和载体时要求用同一种限制酶，目的是产生相同的黏性末端。
(4)将一个基因从DNA分子上切割下来，需要切两处，同时产生4个黏性末端。
(5)不同DNA分子用同一种限制酶切割产生的黏性末端都相同，同一个DNA分子用不同的限制酶切割，产生的黏性末端一般不相同。
(6)限制酶切割位点应位于标记基因之外，不能破坏标记基因，以便进行检测。
(7)基因工程中的载体与细胞膜上物质运输的载体不同。基因工程中的载体是DNA分子，能将目的基因导入受体细胞内；膜载体是蛋白质，与细胞膜的通透性有关。
(8)基因工程中有3种工具，但工具酶只有2种。
[跟进题组]
1．下列有关限制性核酸内切酶的叙述中正确的是(　　)
A．用限制性核酸内切酶切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有2个
B．限制性核酸内切酶识别序列越短，则该序列在DNA中消灭的几率就越大
C．—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数不同
D．只有用相同的限制性核酸内切酶处理含目的基因的片段和质粒，才能形成重组质粒
解析　切割一个DNA分子中部，获得一个目的基因时，被水解的磷酸二酯键有4个；—CATG↓—和—G↓GATCC—序列被限制酶切出的黏性末端碱基数相同，都为4个碱基；只要切割出来的黏性末端的碱基序列相同，都可以被DNA连接酶连接。
答案　B
2.限制性核酸内切酶Mun Ⅰ和限制性核酸内切酶EcoR Ⅰ的识别序列及切割位点分别是—C↓AATTG—和—G↓AATTC—。如图表示四种质粒和目的基因，其中箭头所指部位为限制性核酸内切酶的识别位点，质粒的阴影部分表示标记基因。适于作为图示目的基因载体的质粒是(　　)

解析　由图可知，质粒B上无标记基因，不适合作为载体；质粒C和D的标记基因上都有限制性核酸内切酶的识别位点。只有质粒A上既有标记基因，且Mun Ⅰ的切割点不在标记基因上。
答案　A
考点二　基因工程的操作程序　
[典例引领]
【典例】 (2022·北京四中期中)科学家从某细菌中提取抗盐基因，转入烟草并培育成转基因抗盐烟草。下图是转基因抗盐烟草的培育过程，含目的基因的DNA和质粒上的箭头表示相关限制酶的酶切位点。请分析回答下列问题。

(1)①过程获得的抗盐基因可用PCR技术进行扩增，该技术必需用________酶，所需的原料是________。
(2)已知几种限制酶识别序列及其切割位点如表：
限制酶
BamHⅠ
HindⅢ
EcoRⅠ
SmaⅠ
识别序列及切割位点
G↓GATCC CCTAG↑G
A↓AGCTT TTCGA↑A
G↓AATTC
CTTAA↑G
CCC↓GGG
GGG↑CCC
用图中的质粒和目的基因构建重组质粒，不能使用SmaⅠ酶切割，缘由是__________。
图中①②过程为防止质粒和含目的基因的外源DNA片段自身环化，应选用________________酶对外源DNA、质粒进行切割。
(3)图中⑤、⑥依次表示组织培育过程中抗盐烟草细胞的________、________过程。
(4)为确定转基因抗盐烟草是否培育成功，既要用放射性同位素标记的________作探针进行分子杂交检测，又要在个体水平上鉴定，后者具体过程是__________________。
解析　理解转基因技术的步骤、成果是解题的关键。(1)PCR技术所需的原料是合成DNA的四种脱氧核苷酸。依据PCR反应原理，每次循环可分为在95 ℃时进行变性，在55 ℃时进行复性，在72 ℃时延长，该过程需要耐热的DNA聚合酶。(2)从图中信息可知，SmaⅠ酶的切割位点位于目的基因和M抗生素抗性基因上。分析抗盐基因的DNA片段，可知该DNA含四种限制酶切点，其中SmaⅠ位于目的基因上，不宜接受。EcoRⅠ位于目的基因两侧，若用EoRⅠ切割则目的基因会自身环化。BamHⅠ与HindⅢ位于目的基因两端，且质粒中也有相应的合适的切割位点，因此用BamHⅠ和HindⅢ才能完整地切下该抗盐基因，同时保证目的基因与质粒连接方式的唯一性，防止自身环化。(3)转基因后的植物细胞，经脱分化产生愈伤组织，经再分化形成根、芽等，进而产生新的植株。
答案　(1)耐热的DNA聚合　四种脱氧核苷酸
(2)SmaⅠ会破坏质粒的抗性基因和外源DNA中的目的基因　BamHⅠ和HindⅢ　(3)脱分化　再分化　(4)抗盐基因(或目的基因)　将培育的烟草幼苗栽培于含有肯定盐的土壤中，观看该烟草植株的生长状态

基因工程操作的基本步骤
1．目的基因的猎取
目前有两种途径：一是直接提取目的基因，如从基因文库中猎取。二是人工合成目的基因，常用的方法有化学合成法和反转录法。
2．基因表达载体的构建
(1)基因表达载体的组成

(2)构建过程

3．将目的基因导入受体细胞
细胞类型
常用方法
受体细胞
转化过程
植物细胞
农杆菌转化法
体细胞
将目的基因插入Ti质粒的T—DNA上→转入农杆菌→导入植物细胞→整合到受体细胞的DNA上
动物细胞
显微注射技术
受精卵
将含有目的基因的表达载体提纯→取卵→获得受精卵→显微注射→早期胚胎培育→胚胎移植→发育成为具有新性状的动物
微生物细胞
Ca2＋处理增大细胞壁通透性
原核细胞或酵母菌
用Ca2＋处理细胞→感受态细胞→重组表达载体DNA分子与感受态细胞混合→感受态细胞吸取

4.目的基因的检测与鉴定

[跟进题组]
(2022·山东文登三模，35)在培育转基因植物的争辩中，卡那霉素抗性基因(kan)常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培育基上生长。如图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答。

(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的猎取、________、
将目的基因导入受体细胞、_________________。
(2)A过程需要的酶有________和________。
(3)要把重组质粒导入土壤农杆菌，首先必需用________处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为________态；然后将________在缓冲液中混合培育完成转化过程。
(4)含有重组质粒的土壤农杆菌侵染离体棉花叶片组织后，将离体棉花叶片组织培育成再生植株要经过[C]________和[E]________。如要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培育基中加入________。
(5)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是______________。
这需要通过检测才能知道，检测接受的方法是________。
解析　(1)基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：目的基因的猎取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。(2)基因表达载体构建过程中，需要用同种限制酶切割目的基因和载体，使它们产生相同的黏性末端，再用DNA连接酶把这两个DNA片段连接起来。(3)农杆菌转化法导入目的基因时，首先必需用Ca2＋处理土壤农杆菌，使土壤农杆菌转变为感受态；然后将重组质粒和感受态细胞在缓冲液中混合培育完成转化过程。(4)植物组织培育过程的关键步骤是脱分化和再分化。由于只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培育基上生长，故若要确保再生植株中含有抗虫基因，可在C过程的培育基中加入卡那霉素。(5)目的基因能否在棉花植株体内维持和表达其遗传特性的关键是目的基因是否插入受体细胞的DNA分子上，检测接受的方法是DNA分子杂交技术。
答案　(1)基因表达载体的构建　目的基因的检测与鉴定
(2)限制酶　DNA连接酶
(3)Ca2＋　感受　重组质粒和感受态细胞
(4)脱分化　再分化　卡那霉素
(5)目的基因是否插入受体细胞的DNA分子上　DNA分子杂交技术