（高清正版）DB37_T 3893-2020 芋头病毒检测技术规程.pdf

ICS 65.020 B 16 DB37 山东省地方标准 DB 37/T 38932020 芋头病毒检测技术规程 Detection and identification of taro viruses 2020-03-31 发布 2020-05-01 实施 山东省市场监督管理局 发 布 前 言 本标准由山东省农业农村厅提出。本标准由山东省农业标准化技术委员会归口。本标准起草单位：山东省农业科学院植物保护研究所。本标准主要起草人：姜珊珊、辛相启、吴斌、张眉、王升吉、辛志梅。芋头病毒检测技术规程 1 范围 本标准规定了芋花叶病毒（Dasheen mosaic virus，DsMV）和黄瓜花叶病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）的RT-PCR的检测方法。本标准适用于芋头叶片中芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒的检测。2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 3 检测对象 3.1 芋花叶病毒 中文名：芋花叶病毒 学名：Dasheen mosaic virus 缩写：DsMV 分类地位：马铃薯Y病毒科（Potyviridae），马铃薯Y病毒属（Potyvirus）病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子呈线状，长度约为750 nm。一般通过蚜虫传播，还可通过机械摩擦传播。感染DsMV的芋头植株通常表现为叶片花叶、斑驳、皱缩卷曲、叶脉黄化和茎坏死等症状。3.2 黄瓜花叶病毒。中文名：黄瓜花叶病毒 学名：Cucumber mosaic virus 缩写：CMV 分类地位：雀麦花叶病毒科（Bromoviridae），黄瓜花叶病毒属（Cucumovirus）病毒粒子、传播途径及危害：病毒粒子为球状，直径28 nm30 nm。主要由蚜虫以非持久性方式传播。导致寄主出现花叶、黄化、皱缩等症状。4 主要仪器设备、用具和试剂 4.1 仪器设备和用具 仪器设备和用具主要有：a)PCR 仪；b)电泳仪；c)水平电泳槽；d)凝胶成像仪；e)高速冷冻台式离心机；f)纯水仪；g)万分之一天平；h)普通冰箱（04）；i)-20低温冰箱；j)-70低温冰箱；k)磁力搅拌器；l)高压灭菌锅；m)可调微量移液器（10 L、100 L、200 L、1000 L、5000 L）；n)RNase-free 吸头（10 L、200 L、1000 L）；o)RNase-free 离心管（1.5 mL、2.0 mL）；p)RNase-free PCR 反应管。4.2 试剂 所有实验用试剂均为分析纯；相关试剂配制方法详见附录A；除特殊说明外，均为符合GB/T 6682，实验用水为无菌超纯水或去离子水。4.2.1 RNA 提取试剂：a)多糖多酚植物 RNA 提取试剂盒或其他等效产品；b)三氯甲烷；c)异丙醇；d)75%乙醇；e)RNase-free 超纯水。4.2.2 反转录试剂：a)随机引物；b)RNase 抑制剂；c)逆转录酶：AMV 或其他等效酶；d)dNTPs（10 mM）；e)-20 C 贮藏。4.2.3 PCR 试剂：a)DNA 聚合酶试剂盒：2 Es Taq MasterMix 或其他等效产品；b)DNA 分子量标记物：100 bp2000 bp；50 TAE 缓冲液；c)核酸染料：Gelred（10000）溶液或其他等效溶液；d)含 10-4倍浓度 Gelred 的 1%琼脂糖凝胶；e)6 DNA 上样缓冲液。5 RT-PCR 检测方法 5.1 方法提要 芋花叶病毒和黄瓜花叶病毒皆为RNA病毒，利用TransZol Plant多糖多酚植物RNA提取试剂盒进行RNA纯化，然后进行RT-PCR检测，通过琼脂糖凝胶电泳对检测结果进行判定。5.2 样品采集 观察芋头叶片是否出现叶脉褪绿、脉间褪绿黄化、叶片皱缩、花叶、叶片畸形等典型病毒病症状，取出现上述症状的样品装至无菌样品袋中，标记样品编号、取样时间、取样地点，于低温条件下（28）运送至实验室，放置-70超低温冰箱保存备用。样品避免反复冻融。以通过分子检测不含病毒的样品作为阴性对照，以确定感染DsMV或CMV的样品为阳性对照。以下操作对阴性对照、阳性对照进行同样处理。5.3 RNA 的提取和纯化 5.3.1 称取 100 mg 样品置 2 ml 离心管中，用液氮速冻后迅速研磨，然后加入 1 mL 裂解缓冲溶液（1 mL/100 mg 样品），剧烈振荡混匀，室温放置 5 min；4，13000 rpm 离心 5 min。5.3.2 取上清液于 1.5 mL 离心管中，加等体积的缓冲液 2，颠倒混匀后加入 1/4 体积三氯甲烷，再次颠倒混匀，室温静置 2 min3 min。4，13000 rpm 离心 10 min。5.3.3 将上层水相转入新的 1.5 mL 离心管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置 10 min。4，13000 rpm 离心 10 min。5.3.4 弃上清液，加入 1 mL 预冷的 75乙醇，洗涤沉淀。4，13000 rpm 离心 5 min。5.3.5 重复上述步骤一次，彻底洗净残留盐分。5.3.6 弃上清液，室温晾干，加适量 RNase-free H2O 溶解。用紫外分光光度计测定 RNA 浓度。放置-80备用。5.4 引物合成 依据文献报道引物序列进行合成（DsMV：Reyes et al.，2009；CMV：姚明华等，2009）。引物配制成10 mol/L储存液备用。表1 RT-PCR 检测的引物序列 检测病毒 引物序列 扩增片段大小/bp DsMV 正义引物：5-AGGTTGTATTGCAGGCAGATG-3 反义引物：5-GCCAATAACTGTGGCCTGTT-3 1034 CMV 正义引物：5-ATGGACAAATCTGAATCAACC-3 反义引物：5-TAAGCTGGATGGACAACCCGT-3 777 5.5 检测 5.5.1 反转录合成 cDNA 第一链 取纯化的RNA合成cDNA第一链，反应体系为25 L，各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整，反应体系成分见表2。将上述试剂依次加入RNase-free离心管中，混匀后，放置于42恒温水浴中1 h后，转入72恒温水浴5 min，用于RT-PCR扩增或置-20以下冰箱备用。表2 反应体系成分表 成分 用量 RNA 1.0 g dNTP（10 mM each）5.0 L 随机引物（10 mol/L）2.0 L 5 Reverse Transcriptase Buffer 5.0 L RNase 抑制剂 1.0 L AMV 逆转录酶（10 U）1.0 L RNase-free H2O 补足 25.0 L 5.5.2 PCR 反应 5.5.2.1 反应体系 取合成的cDNA第一链进行RT-PCR反应。反应体系中各试剂的量可根据具体情况或不同的反应总体积进行适当调整。以水代替模板作为空白对照。反应体系成分见表3。表3 反应体系成分表 成分 用量 2 Es Taq MasterMix 25.0 L 正义引物（10mol/L）2.0 L 反义引物（10mol/L）2.0 L cDNA 2.0 L RNase-free H2O 补足 50.0 L 5.5.2.2 反应程序 将上述反应成分混合好后，放置PCR仪进行反应，反应程序参数见表4。表4 反应程序参数 步骤 温度 时间 预变性 94 2 min 变性 94 30 s 35个循环 退火 56 30 s 延伸 72 1 min 终延伸 72 5 min 5.5.3 PCR 产物的琼脂糖凝胶电泳检测 将50 TAE电泳缓冲液稀释成1 TAE电泳缓冲液，制备1%的琼脂糖凝胶。取上述PCR产物10 L，加入上样缓冲液（终浓度为1），混匀后移入胶孔，并在样品孔一侧加入DNA分子量标记。电压大小根据电泳槽长度确定，一般控制在3 V/cm5 V/cm，当溴酚蓝指示带移动到凝胶2/3处时关闭电源。电泳结束后，在凝胶成像仪的紫外透射光下观察是否扩增出预期的特异性条带，拍摄并记录。6 结果判定及表述 6.1 结果判定 6.1.1 阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照出现预期大小的扩增条带（芋花叶病毒：1034 bp；黄瓜花叶病毒：777 bp），待测样品未出现预期大小的扩增条带，则可判断样品为阴性。6.1.2 阴性对照和空白对照未出现条带，阳性对照及待测样品出现与所测病毒预期大小的扩增条带（芋花叶病毒：1034 bp；黄瓜花叶病毒：777 bp），则判定样品检测结果为阳性。6.1.3 阴性对照或空白对照出现条带，阳性对照未出现预期大小扩增条带，出现以上情况之一，则不予判定，重新鉴定。6.2 结果表述 检出结果表述如下：a)待测样品中检出芋花叶病毒或未检出芋花叶病毒；b)待测样品中检出黄瓜花叶病毒或未检出黄瓜花叶病毒。_