沙蒜软胶囊中5种功效指标的同步测定及其指纹图谱构建_李军波.pdf

285 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期A and E in milk powder using supercritical fluid extraction for sample clean-upJ.Journal of Chromatography A,2000,874(2):275-283.20CAMPBELL S,STONE W,WHALEY S,et al.Development of gamma(gamma)-tocopherol as a colorectal cancer chemopreventive agentJ.Critical Reviews in Oncology/Hematology,2003,47(3):249-259.21张艳海,其布勒哈斯,金燕,等.在线二维液相色谱法同时测定婴幼儿和成人配方营养品中的维生素A、D3和EJ.色谱,2015,33(3):291-297.22戚绿叶,颜琳琦,张丽媛,等.二维液相色谱法测定保健食品中VA、VD3、VE的含量J.中国卫生检验杂志,2015,25(3):340-343,347.23陈建彪.在线净化二维液相色谱快速检测食品中维生素A、D、EJ.食品安全质量检测学报,2019,10(6):1726-1733.收稿日期：2022-11-03 *通信作者 作者简介：李军波(1989)，男，湖北天门人，硕士，工程师，研究方向为保健食品及化妆品相关标准。李军波，郁晓艺*，欧阳浩栩，伍 蓥，郭 丹，李晓敏*(完美(广东)日用品有限公司，广东 中山 528451)摘要：文章建立了一种能同时测定沙蒜软胶囊中槲皮素、山奈素、异鼠李素、大蒜素、-生育酚含量的高效液相色谱法(High performance liquid chromatography，HPLC)和沙蒜软胶囊全面的质量监控方式。对提取条件和检测色谱条件进行优化，采用乙醇超声和甲醇:25%盐酸(4:1)加热回流两步提取，以流速1.0 mL/min，甲醇-0.4%磷酸水为流动相梯度洗脱；3种检测波长为360、240、204 nm。对生产的14批次沙蒜软胶囊进行监控，建立指纹图谱，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统分析样品批次间的相似度，评估产品批次间的稳定性。在优化后的样品提取和色谱条件下，对测定方法进行系统的方法学验证，结果表明该方法的线性相关性R值均大于0.999、回收率高、精密度好，是一种可靠的测定方法，沙蒜软胶囊批次间相似度大于0.85。该方法可靠，可用于产品监控，可提升产品中活性组成的检测效率和产品质量监控效果。关键词：沙蒜软胶囊；高效液相色谱法；方法学验证；指纹图谱中图分类号：TS 207.3 文献标志码：A 文章编号：1005-9989(2023)04-0285-07Construction the Method of Five Functional Composition Simultaneous Determination and Fingerprint in the Sea Buckthorn Garlic Soft CapsuleLI Junbo,YU Xiaoyi*,OUYANG Haoxu,WU Ying,GUO Dan,LI Xiaomin*(Perfect(Guangdong)Co.,Ltd.,Zhongshan 528451,China)沙蒜软胶囊中5种功效指标的同步测定及其指纹图谱构建DOI:10.13684/ki.spkj.2023.04.031 286 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期0 引言沙蒜软胶囊是以沙棘籽油、大蒜油、银杏叶提取物为原料1，经混合配制而成的具有降血脂功能的保健产品。现有研究表明沙棘籽油中富含-生育酚、黄酮苷元类、甾醇等活性物质2-3，该类活性成分具有抗氧化、抗肿瘤、降低血液胆固醇防止血栓形成、治疗胃肠黏膜损伤等功效2-8。大蒜油含有丰富的大蒜素9，其在抗菌、调节肠道菌群、改善高甘油三酯等方面具有较好的作用10-11。银杏叶提取物中的黄酮含量可高达45.6%12，其中的黄酮苷元等物质可促进脂质代谢、抑制细胞凋亡、改善脑缺血、抗肿瘤等13-17。沙蒜软胶囊产品中富含活性成分，如黄酮类、大蒜素、-生育酚、植物甾醇类等物质。而现有研究表明对沙蒜软胶囊中活性成分的全面监控需要采用多种检测方法才能实现，如高博闻18采用乙醚提取沙棘油中-生育酚，使用高效液相法测定其含量；徐丽红等19用乙醇超声提取保健食品中大蒜素，使用高效液相测定其含量；王亚等20使用酸液水解回流处理银杏叶提取物，使用HPLC测定提取物中槲皮素、山奈素、异鼠李素的含量。故研究开发一种可针对沙蒜软胶囊中特有的活性成分，实现各指标的同步检测，对提升检测效率和控制产品质量具有重要意义。本文拟探究沙蒜软胶囊适宜的前处理方式和HPLC测试条件，分析沙蒜软胶囊中的活性成分：槲皮素、山奈素、异鼠李素、大蒜素、-生育酚，实现5项指标同步检测，并尝试通过多批次产品的测定，建立沙蒜软胶囊的液相指纹图谱，为生产质量控制提供参考。1 材料与方法1.1 材料与试剂槲皮素(纯度97.1%)、山奈素(纯度97.6%)、异鼠李素(纯度99.7%)、大蒜素(纯度96.6%)、-生育酚(纯度98.2%)：上海安谱公司；无水甲醇、无水乙醇、盐酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。1.2 仪器与设备1260型高效液相色谱仪：美国Agilent公司；ML204型电子天平：0.1 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司；TW20数显恒温水浴锅：德国JULABO公司；Milli-Q去离子水发生器：美国Millipore公司。1.3 试验方法1.3.1 标准溶液的配制 精密称取槲皮素11.37 mg、山奈素11.40 mg、异鼠李素5.87 mg、大蒜素8.39 mg、-生育酚5.99 mg，以甲醇溶解、摇匀、定容于5 mL棕色容量瓶至刻度，依次得Abstract:A method for the simultaneous determination of quercetin,kaempferide,isorhamnetin,allicin,-tocopherol in the sea buckthorn garlic soft capsule by high performance liquid chromatography(HPLC)and a method for the comprehensive quality control of the sea buckthorn garlic soft capsule was established.To optimize the extracting conditions and chromatographic conditions,the research extract sample by two-step,which include ethanol ultrasonic and methanol:25%hydrochloric acid(4:1)heated reflux.The chromatographic conditions were as follows:flow rate 1.0 mL/min,moving phase gradient elution of methanol and 0.4%phosphoric acid.And three different detection wavelengths were chosen(360,240,204 nm).Moreover,the study detected 14 batches of the sea buckthorn garlic soft capsule,and established the fingerprint.The similarity evaluation system of traditional Chinese medicine chromatography fingerprint similarity was used to analyze the similarity and stability between different batches of the sample.After optimize the extracting conditions and chromatographic conditions,the optimized method finished methodological validation.The results showed that the linear correlation R value of the method was higher than 0.999.In addition,this method can possess high recovery rate and precision.The similarity between the different batches of the sea buckthorn garlic soft capsule more than 0.85,which means these research method is reliable.The optimized method is reliable,that can use to monitor product.It has positive impact on the detection efficiency of functional composition and the monitoring effect of product quality.Key words:sea buckthorn garlic soft capsule;high performance liquid chromatography(HPLC);methodological validation;fingerprint 287 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期到对照品溶液溶度分别为2.208、2.225、1.170、1.621、1.176 mg/mL。分别吸取0.1、0.4、0.8、1.2、1.8 mL各对照品溶液于10 mL棕色容量瓶中，用甲醇定容至刻度线。1.3.2 样品提取 取供试样品20粒，挤出内容物于50 mL小烧杯中，混合均匀，精密称取沙蒜软胶囊内容物1.0 g(精确至0.1 mg)于250 mL平底烧瓶中，加10 mL无水乙醇溶解，超声提取15 min。加甲醇:25%盐酸溶液(4:1)的混合溶液25 mL，水浴(98100)回流30 min，迅速冷却至室温，转移至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 m滤膜过滤，滤液待测。1.3.3 色谱条件 流动相比例设置详见表1，适宜的流速为1.0 mL/min。色谱柱：Agilent Extend C18柱5 m4.6 mm250 mm。柱温箱温度：35。DAD检测器波长设置详见表2。表1 流动相设置比例时间/min甲醇/%A0.4%磷酸/%B0406054060750502050502260403060403585154585155095560955621000881000904060表2 检测器波长设置波长变更时间/min波长/nm03603024051204883601.3.4 数据处理 使用Agilent 1260仪器配套的Open LAB采集上机数据，使用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2010版)分析样品批次间的相似度，所生成指纹图谱的相似度在0.85以上时认为批次间样品质量稳定。2 结果与分析2.1 提取方式的选择2.1.1 不同提取方式对结果的影响 参考徐丽红等19和王亚等20对大蒜素和黄酮类成分的提取方式，设计本研究的提取方案，对比不同提取方式的提取效果。提取方式1：取供试样品20粒，挤出内容物于50 mL小烧杯中，混合均匀，称取沙蒜软胶囊内容物1.0 g于50 mL离心管中，加10 mL无水乙醇溶解，超声提取15 min，用无水乙醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 m滤膜过滤，滤液待测。提取方式2：称取沙蒜软胶囊内容物1.0 g于250 mL平底烧瓶中，再加甲醇-25%盐酸溶液(4:1)的混合溶液25 mL，水浴(98100)回流30 min，迅速冷却至室温，转移至50 mL容量瓶中用甲醇稀释至刻度，摇匀，用0.45 m滤膜过滤，滤液待测。提取方式3为两步提取，按照方式一提取后，在提取液中加入甲醇-25%盐酸溶液(4:1)的混合溶液25 mL，水浴(98100)回流30 min，迅速冷却至室温，转移至50 mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度、摇匀，用0.45 m滤膜过滤，滤液待测。以上提取方式均一式2份开展试验。3种提取方式色谱图如图1所示，试验结果如表3所示。图1 3种提取方式色谱图0102030405060700200400600800100012001400乙醇超声提取超声回流两步提取盐酸-甲醇回流提取槲皮素异鼠李素山奈素大蒜素生育酚80 90mAU时间/min表3 3种提取方式试验结果成分提取方式1/(mg/100 g)提取方式2/(mg/100 g)提取方式3/(mg/100 g)平行1平行2平行1平行2平行1平行2槲皮素126122471471466472山奈素121130463471465472异鼠李素2631117112120122大蒜素241231261257256261-生育酚413647504856由表3可知，提取方式1中槲皮素、山奈素、288 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期异鼠李素提取不充分，测得的含量偏低，是因为银杏提取物中的黄酮类物质以黄酮苷形式存在，使用乙醇超声仅能提取样品中的游离黄酮类物质21。提取方式2和提取方式3在酸性条件下使黄酮苷类物质充分水解，因此提取充分22；沙棘油和银杏叶中存在多种槲皮素苷元、山奈素苷元、异鼠李素苷元，如槲皮素-3-O-芸香糖苷、异鼠李素-3-O-芸香糖苷等3,23-25，多采用液相色谱质谱串联技术进行分析。因各黄酮单体在产品中含量相对较低3,25-26，不利于产品质量稳定监控及内控标准建立，而水解后黄酮类物质能较好体现产品活性物质总体含量，更有利于产品质量监控。由表3可知，3种提取方式均能较好提取出大蒜素和-生育酚，提取方式2和3条件下效果更佳；提取方式3条件下，-生育酚提取更为充分，较提取方式2高7.2%，可能是两步提取溶剂pH值更高，提取溶剂量更充足，提取时间更长，更有利于-生育酚的提取27。故最终选取两步提取法对沙蒜软胶囊中5种组分进行同步提取。2.1.2 不同提取方式对结果的影响 由2.1.1试验可知超声和回流两步提取法最佳，因几种待测物的酸碱稳定性存在差异，提取液的pH值也可能影响提取效果，所以两步提取的基础上，设置了25%盐酸添加量的对比试验，持续探索最优提取条件。提取方式参考两步提取执行，加入的25%盐酸与甲醇溶液体积参考表4执行，测试结果详见表5。由表5数据可知，25%盐酸:甲醇为1:4时提取效果最佳，各组分提取较充分。使用100%甲醇提取槲皮素、山奈素、异鼠李素含量偏低，主要是因为纯甲醇仅能提取游离的黄酮类物质，而天然的黄酮类物质多以黄酮苷形式存在，黄酮苷在酸性条件下水解为黄酮类物质，被甲醇充分回流提取。当25%盐酸:甲醇为2:4和4:4时，3种黄酮类物质的含量略微降低，大蒜素、-生育酚显著降低。主要有两方面原因：一方面是大蒜素、-生育酚在低酸环境不稳定，盐酸含量增加，提取液pH值降低，对-生育酚有一定破坏27；另一方面盐酸含量增加，也减少了甲醇的添加量，甲醇的减少可能降低了提取效率。故最终选取两步提取法，第二步以25%盐酸:甲醇为1:4为提取条件对沙蒜软胶囊中5种组分进行同步提取。2.2 色谱条件的选择2.2.1 流速的选择 为了验证本试验色谱条件的耐用性，从流动相流速和磷酸浓度两方面设置了比较试验。选择了0.8 mL/min和1.0 mL/min这2种流速进行梯度洗脱，结果如图2所示。图2 2种流速条件下的色谱图mAU时间/minmAU时间/min01020304050607002004006008001.0mL/min0.8mL/min80 901000mAU时间/min测试样在0.8 mL/min和1.0 mL/min条件下5种组分均能较好分离，各组分的分离度均大于1.5；1.0 mL/min的流速条件下最小分离度为2.7，分离效果更佳，故最终选取1.0 mL/min条件下进行测试。各组分分离度如表6所示。表6 2种流速测试结果的分离度对比流速/(mL/min)槲皮素山奈素 异鼠李素 大蒜素-生育酚0.85.611.31.54.84.01.06.47.72.75.54.82.2.2 缓冲液的选择 设置了纯水、0.4%磷酸、0.8%磷酸作为流动相B，结果如图3所示。表4 溶剂比例设置试验组第一步：乙醇超声提取第二步：25 mL，25%盐酸-甲醇溶液回流提取盐酸加入体积/mL甲醇体积/mL试验1加10 mL无水乙醇溶解，超声提取15 min025试验2520试验38.3316.67试验412.512.5表5 不同溶剂提取结果成分含量/(mg/100 g)试验1试验2试验3试验4槲皮素11465423448山奈素26465397358异鼠李素11120112112大蒜素2622558171-生育酚5649258 289 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期0.4%0.8%磷酸作为B流动相检测效果较佳，各组分分离度均大于1.5。纯水条件下50 min后基线波动较大，0.4%0.8%磷酸作为流动相B同样的洗脱梯度条件均能洗脱出5种组分，0.4%磷酸效果最佳，各峰之间的分离效果最好，最小分离度2.7。故最终选取0.4%磷酸条件下进行测试。各组分分离度如表7所示。准曲线相关系数满足R0.999，5种成分在各自范围内均线性良好。各成分的线性范围为：槲皮素22.08397.44 g/mL，山奈素22.25400.5 g/mL，异鼠李素11.70210.6 g/mL，大蒜素16.21291.78 g/mL，-生育酚11.76211.68 g/mL。按S/N=10确定各成分的定量限，各组分分别为：槲皮素0.25 mg/100 g，山奈素0.21 mg/100 g，异鼠李素0.22 mg/100 g，大蒜素0.31 mg/100 g，-生育酚0.36 mg/100 g。表9 加标回收试验结果成分样品中浓度/(mg/100 g)加标量/(mg/100 g)加标回收平行试验/(mg/100 g)回收率/%1234567槲皮素465255730733732734732735735104106山奈素475285763762765763764762765100102异鼠李素1352453563553553603643613659094大蒜素255205480481475478479476480107110-生育酚50150215213215215212211210107110表8 5种成分在的标准曲线、线性范围及定量限情况成分回归方程R线性范围/(g/mL)定量限/(mg/100 g)槲皮素y=195.45608x+1.853790.9994522.08397.440.25山奈素y=169.57933x+6.059710.99944 22.25400.50.21异鼠李素y=224.42063x+12.232140.99936 11.70210.60.22大蒜素y=33.32055x+1.1034820.9995416.21291.780.31-生育酚y=211.35165x+9.9788190.9993611.76211.680.36标回收率在90%110%，满足GB/T 274172017合格评定化学分析方法确认和验证指南的要求，表明该方法的准确度高，检测结果准确。具体数据详见表9。2.3.3 精密度验证 通过对同一批次样品，按照最优条件提取，重复制备7份样品，参考最优色谱条件进样分析，参考混合对照品的保留时间确认7份样品对应共有含量，通过峰面积计算5种组分含量的RSD(n=7)，RSD值均小于5%，表明该方法的重表10 精密度试验结果成分同一样品7份平行试验/(mg/100 g)平均值RSD/%1234567槲皮素478475462470457471 4694691.5山奈素466471458470458440 4604602.3异鼠李素 128127126128126135 1351293.1大蒜素257260258257258248 2482552.0-生育酚 48524849464845484.7图3 3种流动相B条件下的色谱图01020304050607080 900204060801000.8%磷酸-甲醇纯水-甲醇0.4%磷酸-甲醇120mAU时间/min表7 3种流动相B测试结果的分离度对比流动相B槲皮素 山奈素 异鼠李素 大蒜素-生育酚0.8%磷酸6.17.71.63.21.60.4%磷酸6.47.72.75.54.8纯水6.17.40.93.10.42.3 方法学考察2.3.1 标准曲线和定量限 将储备液使用色谱甲醇进行等倍稀释，稀释成6个浓度水平，做标准曲线，确定各成分的线性范围(如表8所示)。由表8中数据可知，所得沙蒜软胶囊中5种成分的标2.3.2 准确度验证 通过对样品的加标回收试验考察本方法的准确度，取供试样品50粒，加入适量的混合对照品，混合均匀。按照最优条件提取，重复制备7份样品，参考最优的色谱条件进样分析，计算各对照品的加标回收率。各对照品的加 290 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期复性好，精密度高。具体数据详见表10。2.4 指纹图谱构建与应用GB/T 274172017的要求。各指标的平均回收率分别为槲皮素105%、山奈素101%、异鼠李素92%、大蒜素109%、-生育酚109%，检测精密度良好RSD控制在5%以内。采用该方法建立的沙蒜软胶囊液相指纹图谱能有效监控产品质量稳定性，通过14批次产品比对，各指标相似度均大于0.85。本研究首次探索了沙蒜软胶囊多项指标含量的同步测定，该检测技术提升了检测效率，同时对沙蒜软胶囊的质量监控也更加全面。在探索过程种发现沙蒜软胶囊测试的色谱图中仍有9种成分被识别但未对其使用对照品进行定量，故本方法的探索仍存在局限性。为了充分发掘沙蒜软胶囊中的活性成分及对其含量测定，可参考孙冬梅等28和赵一懿等29的方法，进一步尝试采用液相色谱-四级杆-飞行时间等技术对沙蒜软胶囊中的黄酮苷全组分进行解析，可参考XU G等30银杏蜜环口服溶液质量评价的定性定量研究及黄酮醇苷类成分的稳定性研究的方式进一步筛选出沙蒜软胶囊中含量高、活性功能强的指标，然后采用HLCP或液相色谱-质谱-质谱联用技术对目标组分进行含量测定，从而更全面挖掘产品功能，监控产品质量。参考文献：1周爽利,刘钧发,许树立,等.一种沙蒜软胶囊制备工艺:CN 113662923AP.2021-11-19.2吴晓云,谢强胜,李启艳,等.基于7种脂肪酸含量测定和化学计量学的沙棘籽油质量评价研究J.食品安全质量检测学报,2021,12(20):8128-8135.3顾关云.沙棘的化学成分、生物活性与临床研究J.国外医药植物药分册,2007,22(4):139-149.4周浩楠,胡娜,董琦,等.沙棘化学成分及药理作用的研究进展J.华西药学杂志,2020,35(2):211-217.5HUANG N K H,MATTHAN N R,GALLUCCIO J M,et al.Supplementation with seabuckthorn oil 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生育酚大蒜素异鼠李素123456789样品对照品3000mAU时间/min应用本研究建立的方法对样品进行了测定，上机测试的色谱图如图4所示，样品中除含本研究测定的5种成分外，还有9个未知峰。对14批次样品进行同步测定，通过14批次产品构建指纹图谱。将获得的指纹图谱，共标识出14个共有峰，并指认了1、2、3、4、12号峰分别为槲皮素、山奈素、异鼠李素、大蒜素、-生育酚。以中位法生成对照指纹图谱。以1号样为参考图谱，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。相似度评级后发现14批沙蒜软胶囊供试液的指纹图谱相似度均0.85，建立指纹图谱指标，相似度评价图谱详见图5。表明沙蒜软胶囊生产质量稳定可控27。3 结论与讨论本研究通过对沙蒜软胶囊的提取条件和HPLC检测色谱条件进行探索和优化，建立了沙蒜软胶囊中槲皮素、山奈素、异鼠李素、大蒜素、-生育酚的含量测定方法，可以实现5项指标的同步检测，将该检测技术应用于产品质量监控过程中可实现14种组分的同步监控。试验结果表明，采用两步提取法处理样品，样品上机的色谱条件选择流速1.0 mL/min、流动相甲醇-0.4%磷酸水条件下，各方法学验证指标参数均符合 291 食 品 科 技FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY食品安全与检测2023年 第48卷 第04期8VINITA,PUNIA D,KUMARI N.Potential health benefits of Sea buckthorn oil-A reviewJ.Agricultural Reviews,2017,38(3):233-237.9王煜伟,李琳琳,王乐,等.响应面法优化大蒜油的提取工艺研究J.食品研究与开发,2022,43(13):95-100.10WANG Y H,ZHANG H Q,TENG X Y,et al.Garlic oil alleviates high triglyceride levels in alcohol-exposed rats by inhibiting liver oxidative stress and regulating the intestinal barrier and intestinal floraJ.Food 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