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第 52 卷 第 2 期 Vol.52,No.2,135146 2023 年 3 月 GEOCHIMICA Mar.,2023 收稿日期:2021-04-13;改回日期:2021-08-17 项目资助:国家自然科学基金项目(42030715、42107120)和“一带一路”国际科学组织联盟项目(ANSO-CR-KP-2021-05)共同资助。第一作者简介:王嘉琦(1993),女,博士研究生,环境科学专业。E-mail: 通信作者:赵时真(1989),女,副研究员,从事区域毒害有机污染物研究。E-mail: Geochimica Vol.52 No.2 pp.135146 Mar.,2023 曼谷城区总悬浮颗粒物的化学组成特征、来源解析 及其人肺上皮细胞A549毒性 王嘉琦1,2,赵时真1*,张倩玉1,梁耀辉1,马慧敏1,李 军1,张 干1(1.中国科学院 广州地球化学研究所,有机地球化学国家重点实验室,广东 广州 510640;2.郑州大学 电气与信息工程学院,河南 郑州 450001)摘 要:城市大气颗粒物暴露与人群健康不利效应密切相关,由于颗粒物来源广泛、组成复杂,其引致的健康毒性效应不尽相同。本研究旨在探查城市颗粒物的化学组成、来源及其对人体细胞的毒性效应。采集泰国曼谷城区一年的大气总悬浮颗粒物(TSP)样品,分析水溶性离子、微量金属元素、碳质组分及有机分子标志物含量,并利用正定矩阵因子(PMF)模型解析曼谷 TSP 来源;测定人肺上皮细胞 A549 暴露于 TSP 水萃取组分和有机萃取组分后细胞毒性的变化,包括细胞存活率、活性氧(ROS)生成、白细胞介素-8(IL-8)及细胞凋亡。结果表明,曼谷 TSP 浓度呈现干季高、湿季低的季节趋势,有机组分和水溶性离子是 TSP 的主要组分(50%)。PMF 模型解析结果显示,生物质燃烧(24.7%)、陆地化石燃料燃烧(21.1%)和土壤扬尘(20.6%)是干季内曼谷TSP 质量浓度的主要贡献者,而湿季内曼谷 TSP 的主要来源为陆地化石燃料燃烧(29.5%)、生物质燃烧(16.6%)及海盐(16.0%)。曼谷 TSP 水萃取组分和有机萃取组分均可引起 A549 细胞毒性,其中 TSP 有机萃取组分暴露后的细胞具有更高的死亡率、ROS 水平和凋亡率,而 TSP 水萃取组分暴露后的细胞则具有更高的 IL-8 水平,这种差异表明诱导胞内 ROS(即氧化应激响应)和细胞死亡(细胞存活率与凋亡率)的主导活性组分与诱导 IL-8的主导活性成分不同。关键词:总悬浮颗粒物;水萃取组分;有机萃取组分;A549 细胞;细胞毒性;源解析 中图分类号:X142 文献标志码:A 文章编号:0379-1726(2023)02-0135-12 DOI:10.19700/j.0379-1726.2023.02.001 Chemical characteristics and source apportionment of total suspended particles and their cytotoxicity towards human lung epithelial A549 cells in urban Bangkok WANG Jiaqi1,2,ZHAO Shizhen1*,ZHANG Qianyu1,LIANG Yaohui1,MA Huimin1,LI Jun1,ZHANG Gan1(1.State Key Laboratory of Organic Geochemistry,Guangzhou Institute of Geochemistry,Chinese Academy of Sciences,Guangzhou 510640,Guangdong,China;2.School of Electrical and Information Engineering,Zhengzhou University,Zhengzhou 450001,Henan,China)Abstract:Exposure to ambient particulate matter(PM)is associated with a range of adverse health impacts.PM is a complex,heterogeneous mixture that shows wide variations in time and space and contains numerous toxic and carcinogenic compounds that induce variable levels of cytotoxicity.This study was conducted to determine the chemical characteristics,source apportionment,and in vitro cytotoxicity of total suspended particulates(TSP).TSP samples were collected for one year in Bangkok,Thailand and analyzed to determine their chemical constituents including water-soluble ions,trace metals elements,organic and elemental carbon,and organic molecular markers.The cytotoxicity induced by the water-soluble and organic-solvent extracts of TSP on cell viability,136 2023 年 Geochimica Vol.52 No.2 pp.135146 Mar.,2023 reactive oxygen species(ROS)generation,interleukin(IL)-8,and apoptosis was investigated in human lung epithelial A549 cells.Higher TSP concentrations were observed in the dry season,with lower levels in the wet season.Water-soluble ions and organic matter were the main components of TSP in all samples.Both extracts of TSP reduced the viability of A549,induced the formation of ROS and production of IL-8,and altered apoptosis.Compared with the water-soluble extracts of TSP,the organic-solvent extracts caused a greater decrease in viability,ROS production,and apoptosis in A549 cells,but did not decrease IL-8 release.This difference indicates that the dominant active components inducing intracellular ROS(i.e.oxidative stress)and cell death(cell viability and apoptosis rate)differ from those inducing IL-8 release.Key words:total suspended particle;water-soluble extract;organic-solvent extract;A549 cell;cytotoxicity;source apportionment 0 引 言 大气颗粒物已成为影响全球人类健康的主要环境危害因素之一。柳叶刀杂志发表的 2015 年全球疾病负担研究数据分析显示,大气颗粒物已成为全球第五大风险致死因素,大气颗粒物的长期暴露造成 420 万死亡和 1.031 亿伤残调整寿命年(disability adjusted life years,DALYs),分别占全球死亡和 DALYs 的 7.6%和 4.2%,其中 59%的死亡发生在亚洲东部和南部(Cohen et al.,2017)。世界卫生组织(WHO)下属的国际癌症研究机构(IARC)根据流行病学和毒理学的大量研究结果,于 2013 年正式将大气颗粒物(PM)列为可导致肺癌的 I 类致癌物(Loomis et al.,2013)。目前学术界尚无法阐明颗粒物引发健康效应的完整机制通路,但基本达成共识的假说为,由活性氧自由基(ROS)引发的氧化应激效应是大气颗粒物导致人体健康效应的核心机制假说(Ayres et al.,2008;Shiraiwa et al.,2017;Bates et al.,2019)。大气颗粒物可作为 ROS 的携带者或诱导者进入人体导致过量 ROS 的生成,使得细胞氧化还原状态失衡,产生氧化应激效应(也称氧化损伤)。氧化应激效应可激活转录因子参与的一系列信号通路,产生各种生物学效应(如炎症反应、细胞凋亡、坏死等),最终造成机体损伤(Taniyama and Griendling,2003;Andreau et al.,2012)。虽然大气颗粒物的化学组分十分复杂,随时间和空间的变化而变化,但已有联合毒性和效应导向分析等相关研究证实大气颗粒物吸附的有机组分和无机组分与其致毒效应密切相关(Zou et al.,2016;Velali et al.,2016a,b)。Rashed(2008)发现,微量金属如 Fe、V、Ni、Cu、Zn 等能够诱导细胞氧化损伤,引起细胞毒性,尤其是 Zn、Pb 等金属元素与 A549 的炎性细胞因子 IL-6、TNF-的产生有很强的相关性,其中 IL-6 可促进炎症反应引起的肺部组织损伤,而TNF-可通过直接作用于血管内皮细胞,增强其通透性,最终引发肺水肿(Liu et al.,2014)。此外,Huang et al.(2015)发现颗粒物水提取物中的 SO2 4及NO 3可在细胞暴露时,通过调节溶液 pH 值改变细胞活力。Furuyama et al.(2006)分别采用 10 g/mL 的柴油机颗粒(DEP)和城市 PM2.5有机萃取组分对大鼠心脏微血管内皮细胞暴露 12 h,暴露后内皮细胞中凝血酶元激活物抑制因子(PAI-1)的合成均显著下降,指出有机萃取组分能够通过改变内皮细胞功能进而影响人体的心血管活性,并提示 DEP 有机萃取组分比城市PM2.5的诱导细胞ROS生成能力更强。Su et al.(2017)经气管内滴注射 PM2.5不同萃取组分于小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7),结果表明醌类化合物是导致细胞存活率下降、乳酸脱氢酶(LDH)分泌、ROS 生成的关键化学组分。此外,大气颗粒物中的微生物、内毒素也对细胞活力、氧化应激及炎性效应产生一定的影响。如 Samake et al.(2017)发现真菌孢子可显著增强大气颗粒物的 ROS 生成水平。Gualtieri et al.(2010)使用 A549 和 BEAS-2B 细胞的 IL-8 释放水平研究了意大利米兰的颗粒物毒性,结果表明 PM10引起的炎性效应更强,金属、元素碳(elemental carbon,EC)、有机碳(organic carbon,OC)、多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)等含量较高的 PM2.5并没有产生较强的炎性效应,提出 PM10可导致较强的炎性效应与其含有较高的内毒素有关。颗粒物的组成与其来源密切相关。一方面,一些特殊来源的颗粒物可能具有更高的毒性(Charrier et al.,2015);另一方面,细胞毒性是多种大气颗粒物成分联合作用的结果,并伴随大气扩散迁移发生时空变化,因此需将大气颗粒物的化学组分和毒性 第 2 期 王嘉琦等:曼谷城区总悬浮颗粒物的化学组成特征、来源解析及其人肺上皮细胞 A549 毒性 137 Geochimica Vol.52 No.2 pp.135146 Mar.,2023 研究,同其来源的研究共同开展、协调推进,为制定区域和城市人体健康保护措施提供合理的科学依据(Bates et al.,2019)。中南半岛地区是亚洲乃至全球最典型的生物质燃烧区之一,存在较严重的大气颗粒物污染问题(Lin et al.,2013;Yadav et al.,2017)。因此,本研究选取中南半岛典型城市曼谷,开展一年的总悬浮颗粒物(TSP)样品采集,在传统的空气质量监测和化学组分分析的基础上,对比 TSP 水萃取组分和有机萃取组分的人肺上皮 A549 细胞毒性(包括细胞存活率、ROS 生成量、白细胞介素 8(IL-8)分泌量和细胞凋亡);同时运用正定矩阵因子(PMF)模型确定 TSP 的排放源,并分析不同组分细胞毒性与排放源的关系,以期为进一步评价和预测区域大气颗粒物的健康效应提供新视角。1 材料与方法 1.1 主要仪器与试剂 仪器:大流量颗粒物采样器(XT-1025,上海新拓分析仪器科技有限公司,中国);离子色谱(761 Compact IC,Metrohm 公司,瑞士);电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS,ELAN DRCII,香港铂金埃尔默公司,中国);有机碳元素碳分析仪(MODEL 5,Sunset Laboratory Inc 公司,美国);CO2培养箱(2406-2 型,SHEL-LAB 公司,美国);超净工作台(Airstream Class,ESCO公司,新加坡);倒置显微镜(CKX41,Olympus 公司,日本);多功能酶标仪(Thermo Scientific Varioskan Flash,Thermo 公司,美国);流式细胞仪(BD FACSCelestal,BD 公司,美国);低速离心机(TD4-11,湖南长沙平凡仪器仪表有限公司,中国)。试剂:RPMI-1640 培养基(Gibco 公司);胎牛血清(Gibco公司);CCK-8细胞增殖检测试剂盒(日本同仁化学研究所);活性氧检测试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司);Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒(日本同仁化学研究所);IL-8 检测试剂盒(上海安迪生物科技有限公司);二甲基亚砜(DMSO,Sigma 公司);PBS 缓冲液(Gibco 公司);二氯甲烷(色谱纯,Oceanpak 公司);甲醇(色谱纯,Merk 公司)。1.2 样品采集 TSP 采集于曼谷泰国农业大学环境学院楼顶(10057E,1385N),采样点海拔高度 57 m。采样点周边无明显人为污染源和高大建筑物遮蔽,能够较好地反映该区域的空气质量。采样时间分别为 2016年 13 月及 2016 年 11 月2017 年 1 月(干季,n=51)、2016 年 46 月及 10 月(湿季,n=35)当地时间 9:00次日 9:00,24 h,300 L/min。TSP 采样前,所需石英纤维滤膜需置于 450 马弗炉内烘烤 6 h,冷却后装入密实袋并置于20 冷库中待用。样品采集完成后,将滤膜对半折叠,包于铝箔,装于密封袋,存放于冷库中。1.3 颗粒物化学组分分析 1.3.1 水溶性离子、微量金属元素、OC 及 EC 分析 用直径为 2.5 cm 的切刀取滤膜置于离心管中,称取约 10 g 超纯水加入离心管后超声萃取 30 min,静置后取上清液,并通过 0.22 m 聚四氟乙烯(PTFE)微针式滤器过滤后转移至 PTFE 瓶。重复上述步骤,合并 2 次滤液用于 IC 分析水溶性离子组成(Na+、K+、NH4+、Mg2+和 Ca2+;Cl、NO 3和 SO2 4)(Mo et al.,2018)。用直径为 4.7 cm 的切刀取滤膜置于 PTFE 罐中,以二次纯化硝酸(保证酸液完全浸没膜)在 120 下密闭消化 10 h。消解完毕后,将消解液转移定容,加入 50 ng/mL 的 Re 作为内标,利用 ICP-MS 测量微量金属元素(Zong et al.,2018;Wang et al.,2020)。OC和 EC 分析采用热分解光学分析法,使用的热/光OC/EC 分析方法是 National Institute of Occupational Safety and Health(NIOSH)870(Chow et al.,2001;Wu et al.,2016)。本研究中水溶性离子、金属元素、OC 和 EC 的检测限(Wang et al.,2020)分别为 0.01 0.08 g/m3、0.01 ng/mL、0.13 g/m3和 0.025 g/m3。1.3.2 有机分子标志物分析 用直径为 4.5 cm 的切刀切取滤膜装入索氏抽提管中,抽提试剂为二氯甲烷和甲醇混合液(体积比937),加入回收率指示剂左旋葡聚糖-13C6和正二十四烷-d50。将索氏抽提管与平底烧瓶组装好置于水浴锅中抽提 24 h。将烧瓶中的抽提液过无水硫酸钠柱,旋转蒸发约 1 mL,后氮吹浓缩至细胞瓶中,加入甲基-L-木吡喃糖苷(m-XP)作为内标物。将细胞瓶中的浓缩液分成 2 份,一份过硅胶氧化铝层析柱分离净化,并用二氯甲烷和正己烷的混合溶剂(体积比 11)淋洗,淋洗液收集于样品瓶中,氮吹浓缩至 0.5 mL,上机前加入内标物六甲基苯。该组分为非极性化合物,用气相色谱质谱仪(GC/MS-QP2010,Shimadzu)在选择性离子检测模式(SIM)下进行分析(Mao et al.,2018;Wang et al.,2020)。另一份加入衍生化试剂(含1%trimethylsi chloride的 N,O-bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamide(BSTFA)138 2023 年 Geochimica Vol.52 No.2 pp.135146 Mar.,2023 试剂与吡啶的混合溶剂,体积比 11),置于 70 下衍生 60 min,冷却至室温,滴加正己烷定容至0.5 mL,等待上机。该组分为极性化合物,用气相色谱质谱仪(7890/5975,Agilent)在全扫描模式(Scan)下进行分析(Mao et al.,2018;Jiang et al.,2018)。样品中非极性组分(正二十四烷-d50)和极性组分(13C-levoglucosan)的回收率分别为(11411)%及(8710)%。所有报道的有机分子标志物浓度均经空白和回收率校正(Wang et al.,2020)。1.4 细胞毒性评估 1.4.1 大气颗粒物的提取 为模拟大气颗粒物体外低浓度暴露,取 5 m3同等空气体积(38.0416.3 g/cm2)TSP 样品(Ma et al.,2019)。直径为 2.5 cm 的切刀切取单个滤膜样品,以月为单位混合该月内所有单日采样滤膜样品,标记为对应月混合样品,共计 10 个典型月混合样品(即2016-01、2016-02、2016-03、2016-04、2016-05、2016-06、2016-10、2016-11、2016-12、2017-01)。将采样滤膜剪碎放入灭菌烧杯中,加入等比例体积的二氯甲烷和甲醇混合溶液(超纯水),保鲜膜、锡箔纸依次封口,水浴超声 30 min,后将萃取液通过0.45 m PTFE 针式滤器。重复上述步骤 3 次,收集滤液旋蒸、氮吹(冷冻干燥)至尽干,称重。细胞暴露实验前,使用 DMSO(灭菌超纯水)配制为 50 g/L 的有机萃取组分(水萃取组分)储备液,置于20 冰箱中备用。每一批样品测试细胞毒性指标前,均需设置空白组(只含培养基)和对照组(细胞、培养基),其细胞毒性测定的具体操作同样品分析。1.4.2 细胞培养 采用人肺上皮细胞 A549探讨大气颗粒物的致毒机理和潜在的人体健康影响,研究证实 A549 对大气颗粒物具有较强的生物敏感性,包括细胞毒性、DNA损伤以及氧化应激效应(Shang et al.,2013)。本研究中的 A549 购自上海市中国科学院细胞库。A549 用含10%胎牛血清、1%双抗(青霉素、链霉素)的 RPMI-1640培养基,在 37、5%CO2的饱和湿度条件下培养。分别用 TSP 水萃取组分和有机萃取组分,于 37、5%CO2培养箱中暴露 A549 细胞 72 h(Ma et al.,2019)。1.4.3 细胞存活率和 ROS 检测 细胞存活率的检测根据 CCK-8试剂盒的操作说明进行。A549 细胞染毒暴露 72 h 后,弃去培养液。用培养基轻缓清洗 3 遍,每孔加入 100 L 培养基、10 L CCK-8,于培养箱中避光孵育 2 h,用酶标仪于 450 nm处测定其吸光度 OD值(参比波长 600 nm),试验时每种处理设定 3 个平行孔。细胞存活率表示为实验组占对照组的百分比(Perrone et al.,2010)。细胞内 ROS 的检测根据 ROS 试剂盒的操作说明进行。A549 细胞染毒暴露 72 h 后,添加 500 L DCFH-DA 探针(其终浓度 10 mol/L),于培养箱中避光孵育 30 min。弃去培养液,用 PBS 清洗 3 遍,再加入 500 L PBS 重悬细胞于流式管中,利用流式细胞仪检测荧光强度,试验时每种处理设定 3 个平行孔。细胞内 ROS 水平表示为实验组吸光值相对对照组的倍数(Zhang et al.,2018)。1.4.4 IL-8 和细胞凋亡的检测 IL-8 的检测按照 IL-8 试剂盒(酶联吸附法,ELISA)的操作说明进行。A549 细胞染毒暴露 72 h后,吸取上清液加入酶标包被板,根据试剂盒说明书依次加入检测试剂,并在实验加入终止液后的30 min 内用酶标仪测定 450 nm 波长处的 OD 值,试验时每种处理设定 3 个平行孔。以浓度梯度稀释标准品OD值做出标准曲线,根据样品OD值计算出相应含量。最终细胞释放 IL-8 水平以实验组相对于空白组的增长倍数表示(Ma et al.,2019)。细胞凋亡的检测按照 Annexin V-FITC/PI 试剂盒的操作说明进行。A549 细胞染毒暴露 72 h 后,用0.25%EDTA 的胰蛋白酶消化细胞,加入适量培养液终止胰酶消化,收集细胞后离心,弃去细胞上清液。加入 500 L PBS 重悬细胞,过筛染色,随后 1 h内加样到流式细胞仪上机检测 A549 细胞早期凋亡率(Annexin V+/PI,%)、晚期凋亡率(Annexin V+/PI+,%)和总凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率,%)情况,试验时每种处理设定 3 个平行孔。本研究中仅统计了总凋亡率的相对变化,细胞凋亡最终数据以实验组相对于对照组的增长倍数表示(Di et al.,2020)。1.5 统计学方法 所有数据使用 IBM SPSS Statistics 25 和 Origin 2018 进行统计分析和绘图。采用单因素方差分析(One Way ANOVA)进行多组间比较,采用 LSD 检验进行组间两两比较。p0.05 表示差异有统计学意义(95%置信区间)。2 结果和讨论 2.1 TSP 浓度和化学组成特征 采样期间,曼谷 TSP 的质量浓度范围为 16.6 第 2 期 王嘉琦等:曼谷城区总悬浮颗粒物的化学组成特征、来源解析及其人肺上皮细胞 A549 毒性 139 Geochimica Vol.52 No.2 pp.135146 Mar.,2023 182 g/m3,年平均浓度为 56.332.1 g/m3,呈现干季浓度高(72.032.2 g/m3)、湿季浓度低(32.910.5 g/m3)的季节特征(p0.01,ANOVA)。总体来说,本研究曼谷城区 TSP 浓度低于大部分城市区域大气中 TSP 浓度,如印度新德里(Li et al.,2014)、中国西安(Zhang et al.,2015)、伊朗阿瓦兹(Ashrafi et al.,2018),但是与一些具有相似气候特征的沿海城市区域相近,如中国厦门(Ma et al.,2017)、广州(Chen et al.,2012)、巴西里约热内卢(Mateus et al.,2013)。这主要是由于沿海城市(泰国曼谷、中国厦门等)多为季风性气候,大气扩散条件较好,同时湿沉降作用较强,使得前者区域内大气颗粒物浓度普遍低于内陆城市(印度新德里、中国西安等)(Chen et al.,2012)。质量平衡是指通过测量和计算的方法获取大气颗粒物中的主要化学组成,并将其质量浓度之和与由称重法确定的质量浓度相比较,其差值即为不确定组分的含量(Li et al.,2014)。本研究将 TSP 的化学组成按以下几类进行质量重构:有机组分(OM=1.6OC)(Xing et al.,2013)、EC、水溶性离子、微量金属元素及不确定组分。图 1 显示了不同季节曼谷 TSP 化学组成特征。可以看出,不同季节中主要化学成分较为一致,但是含量具有明显差别。OM 在 TSP 已知组分中占比最高,干湿季比例无显著差别。水溶性离子的含量占比次之,呈现湿季比例(25.3%)高于干季比例(17.4%)。整体来看,OM 与水溶性离子是曼谷 TSP的主要组成部分,微量金属元素及 EC 对 TSP 的贡献较小(分别为 6.6%7.8%和 2.5%3.5%)。除了 OM和水溶性离子,不确定组分也对 TSP 具有显著贡献(28.1%37.4%)。不确定组分主要由以下 3 个原因产生(Pey et al.,2010):二次无机气溶胶(NH+4、NO 3和 SO2 4)具有高度吸湿性,会捕获或者含有在过滤过程中难以去除的水分;碳质组分可能由于老化或者生物成因而高度氧化,因此本研究中 OM 的推算可能低估了该组分的实际质量;TSP受地壳元素的显著影响,地壳元素对 TSP 的主要贡献以硅酸盐形式存在,然而硅酸盐只能溶解于氢氟酸而不是本研究中所采取的消解液硝酸,因此本研究中微量金属元素的质量受未溶解部分影响,也可能存在被低估的现象。2.2 TSP 来源解析 本研究采用PMF受体模型对曼谷TSP进行来源解析,将与已知化学组分具有相同排放源或经历相同大气环境过程的未知化学组分对 TSP 的贡献纳入为已知排放源。对 PMF 模型进行 49 的因子结果分析,并根据结果的稳定性与所得到的 Q值选取7 个因子来运行 PMF 模型(Wang et al.,2017)。进一步将PMF模型解析出的TSP浓度与实际观测值进行线性拟合,结果显示拟合方程的斜率为 0.97(R2=0.93,p0.7,则被认为主要来自于船舶烟气排放(Zhang et al.,2014)。采样期间 图 1 不同季节 TSP 的化学组成特征 Fig.1 Chemical composition of TSP in various seasons 140 2023 年 Geochimica Vol.52 No.2 pp.135146 Mar.,2023 图 2 PMF 模型解析的 7 个源成分谱 Fig.2 Source profiles of individual factors resolved from seven-factor constrained run by positive matrix factorization V 和 Ni 的浓度平均值为 1.340.98 g/m3,说明船舶烟气排放对曼谷 TSP 的浓度贡献十分显著,因此将因子 1 定义为船舶排放。因子 2 对 NH+4和 SO2 4有最高的贡献。此外,该因子中也包括一些重金属,与 Fang et al.(2017)的研究结果一致,即 SO2 4能够改变气溶胶的 pH 值从而促进金属元素的溶解。因此,因子 2 被定为二次硫酸盐。因子 3 对地壳元素 Al、Fe、Ca 和 Mn 表现出很高的载荷,故将因子 3 定义为土壤扬尘(Xu et al.,2019)。因子 4 对 OC、EC、藿烷及甾烷、Cu 和 Zn 具有较高的贡献。藿烷及甾烷被广泛用作化石燃料燃烧的分子标志物,尤其是在汽油机柴油车的引擎润滑油中被广泛检测到(Zheng et al.,2006)。而机动车尾气排放中也包括 Cu 和 Zn 等重金属(Tan et al.,2014)。此外,这个因子是 Cl的最大贡献源,煤燃烧过程中会产生一定量的 Cl,与这个因子的高贡献一致。因此,将因子 4 定义为陆地化石燃料燃烧。因子 5 具有较高的 Na+和 Mg2+,这 2 种成分主要来自于海平面的机械破损,被认为是海盐气溶胶的指标物质(Hu et al.,2010),因此,因子 5 被定义为海盐。因子 6 在左旋葡聚糖、甘露聚糖、半乳聚糖和K+贡献占比很高,而上述 4 种物质通常被认为是生物质燃烧的标志物,因此将因子 6 定义为生物质燃烧(Zong et al.,2018;Jiang et al.,2018)。该因子对OC、NO 3和 NH+4具有一定的贡献,与生物质燃烧的源成分谱十分相近(Li et al.,2007)。第 2 期 王嘉琦等:曼谷城区总悬浮颗粒物的化学组成特征、来源解析及其人肺上皮细胞 A549 毒性 141 Geochimica Vol.52 No.2 pp.135146 Mar.,2023 因子 7 对 Pb、Zn 和 Mn 有较高的贡献,体现了工业过程的排放特征(Xu et al.,2019)。此外,这个因子中 NO 3的贡献可能来自老化矿物颗粒物外包裹的无机及有机组分(Bove et al.,2016;Jain et al.,2017)。图 3 显示了不同季节内 7 个排放源对 TSP 质量浓度的贡献。生物质燃烧以 24.7%的高比例成为干季内 TSP 的主要贡献者,紧随其后的为陆地化石燃料燃烧(21.1%)和土壤扬尘(20.6%),而船舶排放(3.2%)的比例最低。湿季内陆地化石燃料燃烧(29.5%)、海盐(16%)对 TSP 的贡献则显著上升,而生物质燃烧(16.6%)和土壤扬尘(5.5%)的比例则迅速下降。干湿季内排放源的贡献差异主要与生物质燃烧、土壤扬尘及海盐 3 种具有典型季节性特征的源有关。中南半岛生物质燃烧爆发期处于本研究采样干季,且该季节内研究区域的大气气团主要来自泰国东北部(陆地区域),而湿季内研究区域风向为西南或东南风,大气气团主要来源于泰国湾和安达曼海(Zhang et al.,2010;Wang et al.,2020)。2.3 TSP 暴露导致的细胞毒性 细胞存活率是反映毒物毒性大小的重要指标(Chen et al.,2019)。A549 细胞经 TSP 水萃取组分和有机萃取组分暴露处理 72 h 后,与对照组相比,细胞活力均呈现下降趋势(图 4a)。不同组分颗粒物对细胞活力影响具有差异性,就水萃取组分而言,干季颗粒物(82.6%)引起的细胞毒性大于湿季颗粒物(80.5%);就有机萃取组分而言,湿季颗粒物(80.3%)引起的细胞毒性高于干季颗粒物(79.1%)。就采样期间总体分布趋势来说,TSP 有机萃取组分的细胞毒性大于水萃取组分。ROS 是氧化应激最重要的生物标志物,体内和体外相关研究证实,经大气颗粒物暴露后,细胞内ROS 生成的数量会增加(Ayres et al.,2008;Bates et al.,2019)。TSP 水萃取组分和有机萃取组分均能刺激 A549 细胞产生 ROS(图 4b)。在 TSP 水萃取组分暴露后,干季和湿季的 ROS 水平无明显差异,分别为对照组的 1.22 和 1.23 倍。在 TSP 有机萃取组分暴露后,干季的 ROS 水平高于湿季的 ROS 水平,分别为对照组的 3.2 和 2.1 倍。与水萃取组分相比,TSP有机萃取组分诱导A549细胞产生ROS的能力更强。ROS 的产生可诱导炎症细胞因子(如 IL-6、IL-8、TNF-)的表达,导致细胞活力下降甚至凋亡(Liu et al.,2014;Xu et al.,2020)。大气颗粒物中的重金属、某些碳质组分和内毒素会诱导细胞产生炎症因子,尤其是过渡金属元素和多环芳烃(Goudarzi et al.,2019)。TSP 水萃取组分和有机萃取组分暴露 A549细胞后均可导致炎症因子分泌,但二者未呈现明显的季节变化特征(图 4c)。相比于有机萃取组分,TSP水萃取组分的促炎症能力更强,诱导 A549 细胞分泌了更多的 IL-8。细胞凋亡是指细胞程序性死亡,其在保证生物体的正常进化、内环境稳定和系统生长发育等过程中起到重要作用。但当细胞凋亡出现异常时,细胞群体平衡破坏易导致疾病的发生。研究表明大气颗粒物可通过氧化损伤途径使得细胞凋亡异常,导致慢性阻塞性肺疾病(COPD)和肺癌的发生(Andreau et al.,2012)。TSP 水萃取组分暴露后,与对照组相比,细胞凋亡率略有增加,但无明显季节性差异(图 4d)。TSP 有机萃取组分暴露后,细胞凋亡率明显高于水萃取组分,其采样期间整体分布趋势表现为干季高湿季低,分别为对照组的 2.3 和 1.8 倍。研究结果显示,TSP 水萃取组分和有机萃取组分均可引起A549细胞毒性,其中TSP有机萃取组分暴露后的细胞具有更高的死亡率、ROS 水平和凋亡率,而 TSP 水萃取组分暴露后的细胞则具有更高的IL-8 水平。根据 TSP 各组分样品的制备过程及前期研究结果可知,TSP 水萃取组分主要为可溶性盐、图 3 不同季节内 PMF 模型解析的 7 个源对 TSP 质量浓度的贡献 Fig.3 Contribution of individual resolved factors to mass concentration of TSP during different seasons 142 2023 年 Geochimica Vol.52 No.2 pp.135146 Mar.,2023 与对照组相比,*表示 p0.05。图 4 TSP 水萃取组分和有机萃取组分暴露 72 h 后细胞存活率(a)、ROS 生成量(b)、IL-8 分泌量(c)和细胞凋亡率(d)的分布趋势 Fig.4 Distribution trends in cell viability(a),ROS level(b),IL-8 level(c),and apoptosis rate(d)after 72 h exposure to water-soluble extracts and organic-solvent extracts of TSP 可溶性金属离子等成分,而 TSP 有机萃取组分主要为碳质组分。将细胞存活率与细胞凋亡视作同一靶点,诱导胞内 ROS(即氧化应激响应)和细胞死亡的主导活性组分(有机物为主,如多环芳烃、硝基多环芳烃及醌类有机物)(Jin et al.,2017;Xu et al.,2020),与诱导 IL-8(即促炎性应激响应)的主导活性成分(水溶性组分为主,如内毒素、毒性强度极高的天然活性组分)(Zhong et al.,2015;Samake et al.,2017)明显不同。本研究进一步尝试利用多元线性回归初步探寻A549细胞毒性与 TSP排放源的关系,以标准化系数比较 TSP 水萃取组分和有机萃取组分诱导细胞毒性的关键排放源。多元线性回归指含有多个解释变量的线性回归模型,其定义如下:1 12 2i iyk xk xk x (1)式中:因变量 y 为 TSP 引发的细胞毒性(细胞存活率、细胞内 ROS