不同商品规格黄芪中2种苷类成分的含量测定2.doc

不同商品规格黄芪中2种苷类成分的含量测定 摘要：目的：比较不同商品规格黄芪中2种苷类成分(黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷)的含量。方法：采用高效液相色谱法，对不同商品规格黄芪中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量进行测定。结果：一级、二级、三级、四级黄芪药材中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量分别为0.114 2、0.129 8、0.157 3、0.284 3 mg.g1和0.054 7、0.057 4、0.0481、0.052 2 mg.g1。结论：黄芪甲苷含量与黄芪药材商品等级成负相关，毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量与其商品等级没有规律。建议等级划分在考虑药材外观性状直径、长短时，应根据不同的应用需求，结合有效成分的含量测定进行综合评价。 关键词：黄芪：商品等级；黄芪甲苷；毛蕊异黄酮葡萄糖苷；含量测定黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus (Bge.)Hsiao或膜荚黄芪Astragalus embranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根，为临床常用补气中药之一1。化学成分研究结果表明，黄芪药材主要含皂苷类、黄酮类和多糖类等活性成分2。药理作用研究表明，皂苷类为其抗病毒、保肝、抗肿瘤、改善心脏功能、抗炎、镇痛及抑制滑膜成纤维细胞增殖等生物活性3；黄酮类成分具有调节免疫、抗心肌缺血、保肝、抗炎、抗突变、清除自由基等多种生物活性4。其中皂苷类化合物主要是黄芪甲苷，具有强心、清除氧自由基、Ca2+通道的调控、减少炎症物质的产生、抗衰老、抗高糖、抗病毒及心脏、脑、肝、肾的保护作用等药理作用5；黄酮类化合物主要包括毛蕊异黄酮、芒柄花素等2，而毛蕊异黄酮具有抗局部缺血损伤、阻断钙离子通道、舒张血管、减轻血管紧张素引起的内皮细胞损伤等多种血管保护效应6 黄芪商品规格以长短、粗细分为四个等级7，市场上多以饮片大小决定质量优劣及价格高低8。现行版中国药典对黄芪的质量评价主要是采用高效液相色谱法对其所含的黄芪甲苷、黄酮类进行含量测定9，中国药典也是测定其黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷1，有报道黄芪不同商品规格中黄酮类含量不同8,10，而不同商品等级规格黄芪中2种苷类成分的含量测定则尚未见报道。为此，本试验采用高效液相色谱法测定黄芪中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量，比较不同商品规格对黄芪中2种苷类成分含量的影响，为研究黄芪中黄芪甲苷和毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量的变化提供实验依据，为进一步完善其质量标准提供参考依据。1仪器与试药1.1仪器 1100 LC高效液相色谱仪(美国Agilent公司，DAD检测器，ELSD检测器)；KQ-250B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；W2018型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)；RE-2000型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；SHZ-III循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)；AE240天平梅特勒一托利多仪器(上海)有限公司；FZl02 型微型植物试样粉碎机(北京中兴伟业仪器有限公司)。2.2试药 黄芪甲苷对照品、毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品（中国药品生物制品检定所，批号分别为：110781200613、20633674，供含量测定用)；甲醇、乙腈为色谱纯(德国默克公司)，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。黄芪药材购买于重庆市万州区中药材市场，经重庆三峡医药高等专科学校李洁玉老师鉴定为豆科植物蒙古黄芪Amembranaceus var.mongholicus或膜荚黄芪A.embranaceus，的干燥根；不同商品规格黄芪区分：一级：长50以上，上中部直径15 以上，末端直径不少于0.5。 二级：长40以上，上中部直径1以上，末端直径不少于0.4，间有老皮。三级：根不分长短，上中部直径0.7，末端直径不少于0.3，间有破短节子、老皮。四级：又名毛条，即细支根和须根。2方法与结果2.1黄芪甲苷的定量分析2.1.1色谱条件与系统适应性试验 色谱柱：Agilent SB-C18柱(46 mm 150，5um)；流动相为乙腈-水(32：68)；流速：1 mL.min-1；柱温30：ELSD漂移管温度：90；氮气流量：2.5 mL.min-1；进样量10uL，碰撞器：关。2.1.2溶液的配制2.1.2.1对照品溶液的制备 取黄芪甲苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含400ug的溶液，即得。2.1.2.2供试品溶液的制备 取本品中粉约2.0g，精密称定，置索氏提取器中，精密加入甲醇40 mL，冷浸过夜，再加甲醇适量，加热回流4h，静置放冷，滤过，回收甲醇至干，残渣加蒸馏水10mL，微热使溶解，用水饱和的正丁醇提取4次，每次40 mL，合并正丁醇液，用氨试液充分洗涤2次，每次40 mL，弃去氨液，正丁醇液蒸干，残渣加水5mL使溶解，放冷，通过D101型大孔吸附树脂柱，以水50 mL洗脱，弃去水液，再用40乙醇30mL洗脱，弃去洗脱液，继续用 70乙醇80mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。2.1.2.3线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液(含黄芪甲苷400ugmL-1)5、10、15、20、30 uL，注入液相色谱仪，得进样量X(ug)与峰面积Y的线性方程。结果表明，黄芪甲苷进样量在2.0120 ug与峰面积成良好的线性关系，回归方程为Y=1.678 6 C+4.934 2，r=0.999 2(n=5)。2.1.2.4精密度试验 取黄芪甲苷对照品溶液(400ugmL-1)，进样量10uL，连续测定，进样5次，测定黄芪甲苷对照品峰面积的RSD为122(n=5)，表明仪器精密度良好。2.1.2.5重复性试验 取同一黄芪样品5份(一等品)，按“2.1.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备及“2.1.1”项下色谱条件测定，测得黄芪甲苷RSD为12l(n=5)，表明本方法重复性良好。2.1.2.6稳定性试验 取同一供试品溶液(一等品)，室温密闭放置，分别在制备后0、4、8、12、24h进样，测定黄芪甲苷峰面积，RSD为1.88(n=5)，表明样品溶液在24h内稳定。2.1.2.7加样同收率试验 精密称取已知含量的黄芪约材约2.0g(一等品)，共6份，分别精密加入一定量的黄芪甲苷对照品，按“2.1.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备及“2.1.1”项下色谱条件测定。结果表明，其平均回收率为99.22，RSD为1.28，符合分析要求。2128样品含量测定 分别按“2.1.22”项下供试品溶液制备方法制备，平行3份，按“2.1.1”项下色谱条件测定，以峰面积代入回归方程中计算黄芪甲苷的含量，结果见表1。表1不同商品规格黄芪中黄芪甲苷的含量(n=3)No.不同商品规格 黄芪甲苷mg.g-1 RSD% 1 一级 0.114 2 1.282 二级 0.129 8 1.623 三级 0.157 3 1.544 四级 0.284 3 1.63 22毛蕊异黄囿可葡萄糖苷的定量分析2.2.1笆谱条件与系统适应性试验 色谱柱为Agilent SB-C18柱(4.6 150，5um)；流动相为乙腈-0.2甲酸溶液，梯度洗脱：O20 min(20A40A)，2030 min(40A)；温度为30。C；检测波长为260 nm；流速为1mLmin-1进样量10uL。2.2.2溶液的配制2.2.2.1对照品溶液的制备 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1mL含100ug的溶液，即得。2.2.2.2供试品溶液的制备 取本品粉末(过四号筛)约2.0g，精密称定，置250mL圆底烧瓶中，精密加入甲醇50mL，称定重量，加热回流4h，静置放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，精密量取续滤液25mL，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀，即得。2.2.2.3线性关系考察 分别精密吸取对照品溶液(含毛蕊异黄酮葡萄糖苷100 ug.mL-1)l、5、lO、15、20 uL，注入液相色谱仪，得进样量x(ug)与峰面积y的线性方程。结果表明，毛蕊异黄酮葡萄糖苷进样量在0.102.00 ug与峰面积成良好的线性关系，回归方程为Y=24933.180 9C+0.3064，r=0.999 1(n=5)。2.2.2.4精密度试验 取毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品溶液(100 ug.mL-1)，进样量10uL，连续测定，进样5次，测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品峰面积的RSD为0.24(n=5)，表明仪器精密度良好。2.2.2.5重复性试验 取同一黄芪样品5份(一等品)，按“2.2.2.2”项下供试品溶液的制备方法制备及“2.2.1”项下色谱条件测定，测得毛蕊异黄酮葡萄糖苷RSD为128(n=5)，表明本方法重复性良好。2.2.2.6稳定性试验 取同一供试品溶液(一等品)，室温密闭放置，分别在制备斤O、4、8、12、24 h进样，测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰面积，RSD为1.48(n=5)，表明样品溶液住24 h内稳定。2.2.2.7加样回收率试验 精密称取已知含量的黄芪约材约1.Og(一等品)，共6份，分别精密加入一定量的毛蕊异黄酮葡萄糖苷对照品，按“2222”项下供试品溶液的制备方法制备及“2.2.1”项下色谱条件测定。结果表明，其平均吲收率为9829，RSD为176，符合分析要求。2.2.2.8样品含量测定 分别按“2222”项下供试品溶液制备方法制备，平行3份，按“221”项下色谱条件测定，以峰而积代入回归方程中计算毛蕊异黄酮葡萄苷的含量，结果见表2。表2不同商品规格黄芪中毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量(n=3) No.不同商品规格 毛蕊异黄酮葡萄糖苷/mg.g-1RDS/% 1 一级 0.054 7 1.322 二级 0.057 4 1.723 三级 0.048 1 1.085 四级 0.052 2 1.82 3讨论 由表1和表2可知，结果表明黄芪不同商品规格中2种苷类成分含量有一定差异，黄芪药材中黄芪甲苷的含量为四级三级二级一级，毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量为二级一级四级三级，黄芪药材中黄芪甲苷的含量随其等级降低含量越高，而毛蕊异黄酮葡萄糖苷则规律性不强，这与田圣志等8，10-11所测得的结果趋势基本一致。其含量的高低对其质量的影响较大，制定药材及饮片标准以及炮制制剂生产过程时应加以重视。因此本试验对黄芪商品药材规格与黄芪质量的关系进行了初步探讨，对黄芪药材的质量评价具有积极意义，值得进一步研究。 由于本试验所取样品有一定的局限性，但仍有一定的代表性，市售黄芪根据其长短、粗细来分等级从而决定其价格，存在一定的不合理性，也提示在制定黄芪药材和饮片质量标准时应予考虑黄芪商品规格的区别。 本试验结果表明黄芪药材中较细者黄芪甲苷含量较高，而毛蕊异黄酮则无较好的规律性。近年来，随着黄芪野生资源匮乏及人工种植技术的提高，黄芪体积增大，黄芪产地商品规格的分类方法有所变动12。制药企业将其用于制剂生产时可多选较细者来提高黄芪甲苷含量，而毛蕊异黄酮葡萄糖苷的含量则应对不同产地、品种、采收期的黄芪进行评价13-15。黄芪中2种苷类成分的含量多少可以作为判断黄芪质量好坏的标准之一，但黄芪中有效成分比较多，应对黄芪中氨基酸和多糖类等其它类成分的含量与商品规格的关系进行更进一步的研究，尚需要结合其他有效成分含量的差异进行研究比较，以期对市场上的黄芪商品规格和质量做出正确评价。