一株生防木霉的鉴定及环境p...基苯甲酸对其防病效果的影响_孙小涵.pdf

西 北 农 业 学 报 ，（）：一株生防木霉的鉴定及环境 与对羟基苯甲酸对其防病效果的影响收稿日期：修回日期：基金项目：国家自然科学基金（）；农业高质量发展和生态保护科技创新示范项目（）。第一作者：孙小涵，女，硕士研究生，研究方向为农业微生物资源与利用。：通信作者：顾欣，女，教授，硕士生导师，研究方向为农业微生物资源与利用。：孙小涵，田彦梅，顾欣，刘文辉，赵岩，杨娜（宁夏大学 农学院，银川 ）摘要旨在明确西瓜枯萎病生防真菌 菌株的分类地位及环境 与对羟基苯甲酸（，）共同作用对其防病效果的影响。采用形态学和分子生物学方法分类鉴定，确定 菌株为哈茨木霉（）。平板试验结果表明，对 菌株和病原菌尖镰孢菌西瓜专化型的菌落生长均具有“低浓度促进、高浓度抑制”的作用，强酸和强碱环境均不利于种菌的生长；菌株和病原菌的最适生长环境 和最适 质量浓度不同，前者为和 ，后者为和 。和 共同作用下，菌株的抑菌率无显著变化。在 和 质量浓度 的土壤环境中，菌株的防病效果达到最高水平（）。总之，菌株的防病效果主要受土壤 影响，其能够在 积累环境中有效发挥防病作用，具有较好的生防应用潜力。关键词哈茨木霉；拮抗作用；尖镰孢菌西瓜专化型；对羟基苯甲酸；西瓜枯萎病是西瓜的重要土传病害，病原菌是尖镰孢菌西瓜专化型（，）。发病初期，植株萎蔫；发病后期，根部腐烂，整株枯死。该病害对生产危害性大，可造成瓜田连片发病甚至绝收，且病原菌在土壤存活期长，对西瓜栽种具有持续性影响。因此，有效防控枯萎病对保障西瓜生产具有重要意义。生物防控方法因对环境友好，成为当前土传病害防控的主要研究方向，高效生防菌的获得成为关键。木霉属（）真菌种类丰富、分布广泛、环境适应性强，有广谱抗性，成为应用最广泛的生防真菌之一。据报道，对致病性尖镰孢菌具有生防作用的木霉有哈茨木霉（）、绿色木霉（.）、长枝木霉（.）和 康 氏 木 霉（.）等，抑菌机制涉及竞争作用、重寄生作用、抗生作用和诱导抗性作用等。其中空间和营养竞争作用是木霉菌迅速形成根际生态优势、发挥抑菌作用的重要基础。因此，分离筛选具有强竞争优势、能发挥高效生防作用的木霉菌株很有必要。西瓜枯萎病在酸性和碱性土壤中均有发生，连作田中发病率更高。研究表明，和木霉的生长均受环境 的影响 。室内培养条件下，和木霉的最适生长 范围分别为 和 。土壤 过高 可 导 致 和木霉的数量减少 。因此，环境 直接影响 生 防 木 霉 的 防 控 效 果。对 羟 基 苯 甲 酸（，）是西瓜、水稻、甜瓜等多种作物根分泌物的重要组分 。西瓜连作可导致土壤中根分泌物积累，而对土壤微生物产生影响。研究表明，对 的产孢、萌发及菌丝生长均具有“低浓度促进、高浓度抑制”作用。等 从营养角度探讨土壤中添加 等有机物对木霉的影响，认为少量 有提高土壤中木霉丰度的趋势。以上研究阐述了环境 和 对 和木霉生长繁殖及拮抗效果的部分影响趋势，然而 积累和 双因素叠加对木霉生防效果的影响未见报道。本研究对前期从宁夏西瓜根际土壤中分离的西瓜枯萎病生防木霉 菌株进行鉴定，明确其分类地位；采用平板试验和盆栽试验，探明不同 和 质量浓度下 和 菌株的生长情况，明确 与 共同作用下 菌株对 的抑菌率及防病效果的变化规律，为研制高效的西瓜枯萎病生防菌剂及其有效应用奠定基础。材料与方法材 料菌种：菌株和 由宁夏大学农业微生物学实验室提供，分别从宁夏西瓜健康植株根际土壤和患病植株中分离获得。其中，经回接试验验证其为西瓜枯萎病病原菌，菌株为其拮抗菌。培养基：马铃薯葡萄糖琼脂（，）培养基，用于菌种活化、对峙培养和菌种保藏；马铃薯葡萄糖（，）培养基，用于菌种液态发酵培养。西瓜品种：金城五号。盆栽土壤：宁夏兴仁镇西瓜田旁边的非耕作土，取土深度距地表，过 筛，备用。方 法 菌株的分类鉴定用 培养基，相对湿度 倒置培养 菌株，约，菌丝长满平板（直径，下同），转接于新的 平板，光照 黑暗倒置培养，观察菌株同心轮纹的有无、颜色及形态特征。镜检菌丝、孢子梗和孢子形态特征。鉴定依据为 和 修订的木霉种群分类系统。取活化的 菌落组织，用 法提取 。以提取的 为模板，选用 （）、延伸因子 （）、（）对 菌株进行 扩增。将 产物经琼脂糖凝胶电泳并凝 胶 成 像，切 胶 回 收 片 段。纯 化 的 产物送北京六合华大基因科技有限公司测序，获得 菌株 、和 基因序列。利 用 （：）中木霉属基因信息，通过 软件比对并手工矫正，构建 菌株的系统发育树，确定其分类地位。和 质量浓度对 和 菌落生长的影响采用两因素多水平试验。用过滤除菌的 和 将培养基 分别调为、，添加 使终质 量 浓 度 分别 为、，共制备 种梯度培养基。一部分用于最终 的检测，其余制备梯度平板。在梯度平板中心打个直径 的孔，放入直径相同的 或 菌碟个，倒置培养，测量菌落半径。每个处理设个重复。和 质量浓度对 菌株拮抗 的影响采用对峙培养试验。梯度平板制备方法同“”。在梯度平板上打个直径 的孔，两孔相距，各放入个 和 菌碟，培养条件同“”。测量 菌落半径，计算不同处理下 菌株对 的抑菌率。以不放 菌碟为对照。每个处理设个重复。抑菌率计算公式如下：抑菌率（对照 菌株半径对峙培养 菌株半径）对照 菌株半径 土壤 和 质量浓度对 拮抗 的影响采用盆栽试验。将 和 菌株分别接种于 培养基，培养。血球计数板法检测孢子数量。用无菌水制备 孢子悬液，浓度为 ，孢子悬液浓度为 、和。土壤经 、灭菌制成无菌土。用无菌 和 调节土壤 分别为、，随后添加 使土壤中 质量浓度分别为、，混合均匀。孢子悬液和无菌土以（质量比）混匀制成病菌土。孢子悬液和无菌土以（质量比）混匀制成 接种土。每个营养钵（口径 ，底径，高 ）装 接种土 ，均匀拌入病菌土。每钵定植健康、片真叶的西瓜幼苗株。每浇次 营养液倍稀释液，每次每钵 。根据土壤湿度，每钵浇无菌水 。保持充足光照，温度约。每处理 株，培养，记录瓜苗发病等级，计算发病率、病情指数和防治效果。瓜苗发病等级标准：级为茎内维管束内外无症状；级为茎内维管束变色部分；级为茎内维管束变色部分 ；级为茎内西北农业学报 卷维管束变色部分 ；级为茎内维管束变色部分，部分叶片萎蔫；级为整株萎蔫枯死。发病率、病情指数和防治效果计算公式如下：发病率发病株数调查总株数 病情指数（病级株数代表数值）（调查发病总株数最高级值）防治效果（对照发病率处理发病率）对照发病率 处理与统计分析采用 软件处理数据并制作图表。采用 统计软件进行方差分析和相关性分析，在 水平上进行差异显著性检验。结果与分析 菌株的形态学鉴定菌株生长迅速，初为白色，卷毛状菌丝。随着培养时间增加，产孢簇逐渐变为绿色，老熟时呈暗绿色；分生孢子梗瓶状，较细且稍有弯曲，分枝呈轮状排列，大多轮，较短且无分枝（图，）。分生孢子浅绿色，壁光滑，椭球形，（）（）（图）。培养，菌落出现墨绿色与白色相间的同心轮纹（图），背面无色（图）。培养的菌落呈墨绿色，表面毡毯状，上有少量白色菌丝（图）。依据形态特征，初步鉴 定 菌 株为哈 茨木霉（.）。、分生孢子梗；分生孢子；菌落正面（培养）；菌落背面（培养）；菌落正面（培养）；标尺为，；（）；（）；（）；图 菌株的形态与培养特征 菌株的分子生物学鉴定将 菌株 （登录号 ）、（登 录 号 ）及 （登 录 号 ）序列在 中进行比对，构建系统发育树如图。菌株的 序列与哈茨木霉同源性达到 。由此确定 菌株为哈茨木霉。和 质量浓度对 和 菌落生长的影响 培养基初始 。添加 后，培养基 与初始值相比未发生变化或变化不显著。因此，添加 视为对培养基 无影响。期孙小涵等：一株生防木霉的鉴定及环境 与对羟基苯甲酸对其防病效果的影响图基于 菌株 序列构建的系统发育树 -如图，培养基 和 质量浓度对 和 菌落生长具有不同影响。在 质量浓度相同时，菌落半径由大至小为 ，菌落为 。两菌株都存在最适生长，分别为和。当 相同时，随着 质量浓度增加，两菌的菌落半径均呈现先增加后降低的现象，但是菌落半径峰值对应的 质量浓度不同。处理的 和 菌落半径较对应的 分别增加 和 ，处理分别增加 和 ，处理分别增加 和 ，处理分别增加 和 ，处理分别增加 和 。菌落在 处理中生长最佳，高于或低于该值的处理，菌落半径显著降低，且 时变化趋势在各组内表现一致。菌株也有类似规律，但是其菌落在 处理中生长最佳。由此可知，最适生长条件为 ，质量浓度 ；菌株最适生长条件为 ，质量浓度 。说明 菌株较 更喜弱酸性环境，对 积累环境的适应能力强于。单独培养时，菌落的生长速度显著高于。在 菌 株 生 长 最 适 宜 的 、处 理 中，菌 落 半 径 较 多 ，达 （最高值）；在 生长最适宜的 、处理中，菌落的半径仍然较 多 ，为 （最低值）。说明 菌株在生长速度上较 具有显著优势。和 质量浓度对 拮抗 的影响将 和 菌株对峙培养，在、和 菌株的共同作用下，菌落生长变化趋势与非对峙培养相似。如图，菌落半径的峰值仍然位于 ，且 最有利于 生长。但是在 菌落的影响下，生长受到显著抑制。、处理的菌落半径峰值仅为 ，较对应的单独培养降低 ；、处理的菌落半径最低，仅为 ，较单独培养降低 。由图可知，在 、质量浓度 时，菌株对 的抑菌率为 ，没有显著波动。说明 和 共同作用下，菌株的抑菌率无显著变化。土壤 和 质量浓度对 生防效果的影响由表可知，不同土壤 和 质量浓度影响下植株的发病率、病情指数具有差异，菌株对西瓜枯萎病的防治效果也不同。、未添加 与 、两个处理的发病率最高，均为 。以 、未添加 为对照，计算其他各处理的防治效果。经对比可知，除 外，在 同 一 组 中，处理的植株发病率和病情指数均西北农业学报 卷 菌落半径；菌落半径 ；图不同 和 质量浓度处理后 和 菌落 图不同 和 质量浓度对 菌株拮抗 的作用 为最低，菌株的防治效果均为最高。在 组中，除高质量浓度 显著影响防治效果外，其他各处理均具有最高水平的防治效果，达 。在 组中，未添加 及 处理的植株发病率、病情指数均为组内较高水平，而 菌株的防治效果均为组内较低水平。土壤 和 质量浓度与 菌株防治效果的相关性分析根据皮尔逊相关性分析可知，土壤 与发病率、病情指数和防治效果均具有极显著相关性，即 越高，枯萎病发病率和病情指数越高，而防治效果越受到抑制。质量浓度与病情指数具有显著相关性，但是与发病率和防治效果的相关性不显著。由此可知，菌株的防治效果主要受土壤 的影响；的积累主要影响病情指数。讨 论本研究明确了真菌 菌株为哈茨木霉。利用哈茨木霉防治西瓜枯萎病一直被学者们所关注。田程等 分离获得一株对西瓜枯萎病菌具 有 生 防 作 用 的 哈 茨 木 霉 ，抑 菌 率 。木霉菌的菌丝体通常生长迅速，有利于与病原菌进行空间和营养竞争。在本研究中，菌株表现出较强的竞争能力，于不同 和 含量的环境中，其生长速率均显著高于，使 菌落半径较 减少 ，表 明 菌 株 具 有 较 强 的 竞 争 优 势，对 具有较好的抑菌能力。环境 作为非营养因素可直接影响真菌的生长、繁殖及与其他生物的关系。通常，木霉和尖 镰 孢 菌 生 长 的 最 适 分 别 为 和 。本研究获得与此相似的结论，哈茨木期孙小涵等：一株生防木霉的鉴定及环境 与对羟基苯甲酸对其防病效果的影响表不同土壤 和 质量浓度下 菌株对西瓜枯萎病的防治效果 质量浓度（）发病率 病情指数 防治效果 表土壤 和 质量浓度与 菌株防治效果的相关性 项目 皮尔逊相关性 发病率 病情指数 防治效果 质量浓度 注：，分别表示在，水平上差异显著。：霉 菌株和 的最适 分别为和，为在实际生产环境中利用 菌株开展生物防治提供了依据。是植物根系分泌的一种酚酸类物质，可以被微生物分解利用。郝文雅等 研究表明，对 菌丝生长、产孢和孢子萌发具有促进作用，其最适 质量浓度为 。本研究获得相似的结论，菌株生长具有最适 质量浓度，但该菌株为 ，可能是不同菌株生物学特性差异所致。西北农业学报 卷同时，研究发现 对哈茨木霉 的菌丝生长具有 低 浓 度 促 进、高 浓 度 抑 制 的 作 用，最 适 质量浓度 。等 认为哈茨木霉对 具有较强的降解能力。对比可知，哈茨木霉 菌落生长的最适 质量浓度显著高于 ，说明其对 积累环境具有较好的耐受性。这可能与 菌株对 的降解和利用能力较强有关。哈茨木霉和病原菌对 利用能力差异性的机制研究有待进一步探索。连作 土 壤 环 境 复 杂。土 壤 中 根 系 分 泌 物 积累与 共同作用于根系和根际微生物，故考虑两种因素对生防木霉的叠加作用。作为探索，试验设计的 质量浓度范围涵盖并超过实际连作土壤的情况，但是 菌株的抑菌率几乎未受 质量浓度变化的影响。盆栽试验验证了室内研究结果，菌株在土壤、质量浓度低于 的环境中对西瓜枯萎病的防治效果最佳。等 研究表明土壤 为时，木霉产生大量抗真菌化合物如几丁质酶等，形成较强的拮抗能力，对植株幼苗生防效果最佳。但是，随着土壤 增加，对西瓜枯萎病的防治效果有降低趋势。可能在高 土壤中，木霉调节转运蛋白、信号相关蛋白、胞外酶和参与各种代谢反应的蛋白质的基因，降低了木聚糖酶、纤维素酶和半纤维素酶等的活性，并阻碍膜运输蛋白的运输能力，影响了其对病原菌的防治效果。相关性分析也表明，土壤 较 对 生防效果的影响更为显著。因此，酸性土壤条件更有利于 菌株的生防作用。研究表明，土壤 增加可促进镰孢菌对植株的侵染，导致植株发病率增高。本研究发现，、和 、未添加 两组处理的发病率最高，并非预期的、。说明在植株根际环境，对植株的侵染主要受土壤 的影响。原因可能是土壤 诱导 产生胞外酶降解植物细胞壁，同时促进蛋白酶、脂肪酶等毒力因子的分泌，致使植株发病率升高。对西瓜枯萎病病情指数具有一定影响，相关机制有待深入研究。结 论经形态学和分子生物学鉴定，确定 菌株为哈茨木霉。在培养基中，菌株和 均存在最适 和最适 质量浓度，分别为、和、。在 和 共同作用下，菌株对 的抑菌率稳定在 ；土壤环境中，对西瓜枯萎病的防治效果达 ，主要受环境 的影响。总之，该菌株具有较好的生防应用潜力，研究结果为相关菌剂的研制与应用奠定了基础。参考文献 ：，：，（）：徐同，钟静萍，李德葆木霉对土传病原真菌的拮抗作用植物病理学报，（）：，（）：，：，（）：，（），：，（）：喻景权，杜尧舜蔬菜设施栽培可持续发展中的连作障碍问题沈阳农业大学学报，（）：，（）：，（）：，期孙小涵等：一株生防木霉的鉴定及环境 与对羟基苯甲酸对其防病效果的影响 ，（）：，（）：，（）：秦涵淳，杨腊英，李松伟，等培养基营养成分对香蕉枯萎病尖孢 镰 刀 菌 生 长 的 影 响 热 带 作 物 学 报，（）：，（）：，（）：，（）：，（），（）：郝文雅，冉炜，沈其荣，等西瓜、水稻根分泌物及酚酸类物质对西瓜专化型尖孢镰刀菌的影响中国农业科学，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，：.，（）：，（）：，：，（）：，（）：田程，张屹，肖姬玲，等哈茨木霉 的 标记及其生防特性 中国生物防治学报，（）：，（）：孙虎，杨丽荣，全鑫，等 木霉生防机制及应用的研究进展 中国农学通报，（）：，（）：，（）：，（）：，：董艳，杨智仙，董坤，等施氮水平对蚕豆枯萎病和根际微生物 代 谢 功 能 多 样 性 的 影 响 应 用 生 态 学 报，（）：，（）：，（）：范星菊，曲明星，谭磊，等生物炭缓解甜瓜自毒物质对木霉菌生长和产孢的抑制作用 生态环境学报，（）：，西北农业学报 卷 ，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（，），（），；（）；，（），：，：，：，：（责任编辑：郭柏寿 ：）期孙小涵等：一株生防木霉的鉴定及环境 与对羟基苯甲酸对其防病效果的影响